Name: 细菌附着在实验室测量的植物表面 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学习测量细菌在植物根和芽表面的附着方法，使用显微镜观察和活菌计数技术。该方法快速、简便且经济，适用于植物病理学和食品安全研究，帮助研究人员了解细菌与植物的相互作用机制。

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作者感谢 Susan Whitfield 在图表制备方面的帮助，以及 Camille Martin 和 Hillary Samagaio 在部分实验中提供的协助。

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<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
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<li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157%3AH7+survival+on+field+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li>
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</ol>

作者声明其不存在任何竞争性财务利益。

在实验过程中，必须注意细菌可能附着的所有表面。因此，如果使用玻璃试管和移液管进行活菌计数，可能会低估能够与玻璃结合的细菌数量。如果植物在琼脂或土壤中生长，并且部分琼脂或土壤残留在植物表面，则细菌可能附着在残留物质上，而非植物本身。另一方面，清洗植物表面（尤其是根部）可能会去除黏液等天然表面涂层，从而影响黏附试验的结果。
必须确保加入孵育混合物中的细菌在实验过程中保持存活。因此，应常规测定游离细菌以及附着细菌的活菌数量。某些处理方法或细菌突变可能会降低细菌的生长速率，甚至导致部分细菌种群死亡。在显微镜下，除非使用特殊染料，否则无法区分活菌与死菌。有一种可用于区分活菌与死菌的染色试剂盒，其原理基于活细菌能排斥某些染料。然而，如果存在多种细菌的混合种群，则对目标菌种进行活菌计数可能是判断孵育是否导致细菌死亡的最简便方法。
培养基成分会影响细菌的存活和生长。根系分泌物以及伤口和切割部位释放的物质可为细菌的适度生长提供底物。在这些条件下，磷酸盐、氮和铁通常成为限制性因素。钙、镁等二价阳离子可能影响细菌的黏附。在某些情况下，碳源也会影响黏附。pH值同样重要。一般而言，根际的pH值介于5.5至6.5之间。
使用带有抗生素抗性标记的细菌时必须谨慎。最常用的抗生素是利福平和萘啶酸。对这些抗生素的抗性通常源于染色体基因的突变（分别为RNA聚合酶和旋转酶基因），因此在培养过程中不易转移至其他菌株。这类抗性也不会导致抗生素的降解或化学修饰。不建议使用质粒携带的基因标记来标记细菌，除非该质粒无法转移至其他任何细菌。抗生素抗性不应源于对抗生素的降解或化学修饰，否则当抗生素敏感菌位于抗性菌附近时，也可能在含抗生素的平板上生长。
本文所述方法适用于小样本量和/或需要对样本进行封闭处理的实验（例如涉及人类病原体的实验）。对于大样本量（超过100克材料或超过50株植物），则需要采用其他方法或对这些方法进行重大修改10,19,32,19,33,34,35,36。除所研究物种外，存在大量其他微生物也可能带来显著问题。可能的解决方案包括使用带有荧光蛋白标记或抗生素抗性标记的细菌，如步骤6.1.2和7.3中所述。然而，当目标细菌在大量其他微生物群体中属于稀有个体时，这些标记可能不足以对所研究细菌的数量进行明确评估。
本文所述所有方法均为基于实验室的方法。若用于温室研究，需进行少量修改。而对于田间研究，由于原生动物、昆虫及其他动物的捕食作用以及气候条件的变化，难以提供明确定义的实验条件，因此可能需要进行更重大的修改。未来，这些方法或许可进一步拓展，以涵盖两种或多种微生物在植物表面的相互作用。

细菌与植物表面结合能力的测定在三种不同情境下变得尤为重要。第一种情境是研究人类病原菌在植物表面的传播1,2,3。其目标在于阻止细菌的结合，或清除、杀灭已结合的细菌，从而减少通过植物材料传播的疾病。第二种情境是研究植物病原菌与植物表面的结合4。同样，其目标也是阻止细菌结合，或清除、杀灭已结合的细菌，以降低植物病害的发生。第三种情境是研究共生菌或促进植物生长的细菌与植物表面的结合5,6。此情境下的目标是促进细菌的结合，从而增强植物健康并提高作物产量。
本文所述的测量细菌与植物表面结合的技术成本低廉且相对易于操作。所需条件仅包括一台显微镜以及细菌学实验室中常见的材料。某些技术中使用水浴超声波破碎仪会有所帮助。所描述的技术适用于样本量较小的结合实验。结合的测量在实验室中进行，尽管有可能对其中一些技术进行改进，以适用于温室或田间环境。
这些技术已用于在实验室中测量细菌对根部、芽苗、切叶、切果以及完整的小番茄的结合能力7,8,9,10,11,12,13,14,15它们还被用于测量在实验室中生长于土壤或沙质基质中的植物的根系定殖情况16已将这些技术应用于多种细菌物种，包括 根癌农杆菌，苜蓿中华根瘤菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌 和 Pseudomonas fluorescens. 用于评估相互作用的方法的有用描述 A. tumefaciens 在Morton和Fuqua（2012）中可以找到关于表面相互作用的相关研究17在所有情况下，所涉及的样本量均较小，通常少于25至50株植物。所述技术适用于需在实验过程中保持封闭的人类病原体。

<table><tbody><tr><td>光学显微镜</td><td>任意</td><td>不适用</td><td>相位差或诺马尔斯基光学系统有助于观察；若使用荧光标记，则需配备荧光显微镜。</td></tr><tr><td>种子</td><td>任意&amp;nbsp;</td><td>不适用</td><td>请记录种子批次编号和品种</td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>任意</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>任意科学试剂供应商</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>营养琼脂&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>大豆蛋白胨</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>沙子</td><td>海沙 Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>沙子</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>锥形容器</td><td>Stuewe &amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach 锥形容器</td><td>提供多种规格，可根据所培养植物类型选择合适尺寸</td></tr><tr><td>封口膜</td><td>任意科学试剂供应商</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>MS 盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>任意</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>任意科学仪器公司</td><td>不适用</td><td>沉淀大多数细菌仅需小型离心机，最大离心力为 10,000 ×g 即可</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>任意科学仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>测微计</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-Rafter 计数池</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>探针夹式压密封培养室</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>萘啶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>活/死染色试剂</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

实验室中测定细菌对植物表面的黏附性

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

本文描述了一种在光学显微镜下结合活菌计数法测定细菌与无菌植物表面结合的方法。所用植物材料包括根、芽苗、叶片和切开的果实。所述方法成本低、操作简便，适用于小样本量。结合能力可在实验室中测定，并可采用多种培养介质和条件。可测定抑制剂的作用，也可评估促进或抑制结合的各种情况。在某些情况下，可区分不同条件对结合的影响主要是通过作用于植物还是细菌而实现的。

A. tumefaciens 定植于根部表面。为了确定细菌合成纤维素是否在根部定植过程中发挥作用，研究人员检测了阻断纤维素合成的细菌突变体所产生的影响16。实验采用了步骤1.3和7.1中所述的技术。番茄种子经表面灭菌后，在无菌水中萌发。当根长达到约2 cm时，将其浸入每毫升含105个细菌的菌液中，随后种植于经巴氏消毒的土壤容器中。植物在25 °C条件下生长14天，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。在指定时间点取出植株，清洗根部并使用水浴超声仪进行超声处理，以去除紧密结合的细菌。通过活菌计数法测定细菌数量。图2展示了两种不同纤维素缺陷型突变体对细菌定植番茄根部能力的影响。尽管部分测量值的标准差高达0.9 log10（此类测量中的常见问题），但纤维素缺陷型突变体的结合能力下降趋势明显，因此可以得出结论：细菌合成纤维素有助于其在番茄根部的定植。
<img alt="生长趋势图；平均对数 vs. 天数；C58菌株；数据分析；生物学研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：农杆菌野生型及纤维素缺陷突变体的根部定殖情况。 接种农杆菌野生型菌株C58及纤维素缺陷突变体C58:1和C58:A60后，从番茄根部分离得到的每厘米根长细菌总数的对数（Log10）。所示数据来自至少四次独立实验的平均值。误差线表示平均值的标准差。通过将根部浸入每毫升含105个细菌的悬浮液中1分钟进行接种。植物在容器中培养，随后将根部置于玻璃小瓶中的洗涤缓冲液中清洗，以去除松散附着的细菌。紧密附着的细菌则使用水浴超声仪去除，并将所得悬浮液涂布于平板上以测定活菌数量16。本图经Matthysse和McMahan修改。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
胞外多糖在结合过程中的作用 E. coli 并研究了其他细菌在苜蓿芽上的定植情况。一些由腹泻性疾病引起的暴发事件与 E. coli O157:H7 已被追溯至受污染的苜蓿芽。采用步骤 1.1、5.1 和 7.2 中所述方法，检测了野生型细菌及无法产生各种胞外多糖的突变菌株的结合能力。将苜蓿芽在无菌水中进行表面灭菌，并于无菌水中萌发一天 25 °C 在黑暗条件下，将四株带有种皮的萌发幼苗放入含有5 mL无菌水的塑料培养皿中。向其中加入在LB液体培养基中培养的细菌，使其终浓度约为5 × 103 每毫升。接种后的芽苗在 25 °C 在黑暗条件下培养3天。将芽体转移至离心管中，加入5 mL无菌水，剧烈颠倒振荡洗涤两次，随后在洗涤缓冲液中使用电机驱动的聚四氟乙烯玻璃匀浆器进行匀浆处理。此前利用携带GFP基因质粒标记的细菌进行的实验表明，尽管可轻易观察到表面附着的细菌，但未检测到内化细菌。结果如图所示 表1两种菌株 E. coli O157:H7 进行了检测。在这两种菌株中，聚-β-1,6-葡萄糖醛酸（PGA）的产生似乎对病原菌的黏附起到了最大的促进作用 E. coli 结肠酸在与植物表面结合过程中也发挥了重要作用。尽管纤维素缺失突变体中的结合能力显著降低，但其降低程度不及另外两种多糖。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">大肠杆菌 O157:H7 外多糖合成基因突变对其在豆芽和开放种皮上结合能力的影响</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">细菌菌株</td>
			<td rowspan="2">突变或基因型（相关表型）</td>
			<td colspan="2">每克豆芽或种皮结合的细菌数量的对数值（Log10）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>苜蓿芽b</td>
			<td>开放种皮</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>86-24</td>
			<td>无（野生型）</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8624N</td>
			<td>yhjN（纤维素缺陷型）</td>
			<td>2.9 ± 0.7c</td>
			<td>3.5 ± 0.6c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8624C</td>
			<td>wcaD（结肠酸缺陷型）</td>
			<td>1.8 ± 0.7c</td>
			<td>2.4 ± 0.5c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8624P</td>
			<td>pgaC（PGA缺陷型）</td>
			<td>&lt;1.0c</td>
			<td>1.0 ± 1.0c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4A</td>
			<td>无（野生型）</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4AN</td>
			<td>yhjN（纤维素缺陷型）</td>
			<td>4.8 ± 0.8d</td>
			<td>4.1 ± 0.8d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4AC</td>
			<td>wcaD（结肠酸缺陷型）</td>
			<td>3.9 ± 0.5c</td>
			<td>4.8 ± 0.8d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4AP</td>
			<td>pgaC（PGA缺陷型）</td>
			<td>&lt;1.0c</td>
			<td>1.2 ± 0.7c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">a 每3天后结合细菌数量（log10）的平均值 ± 标准差，至少三次测量结果的均值。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">b 测量前对豆芽进行了清洗。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">c 与野生型相比差异显著：P &lt;0.01。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">d 与野生型相比差异显著：P &lt;0.05。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">本表格改编自 Matthysse, Deora, Mishra 和 Torres10。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：胞外多糖合成基因突变对结合能力的影响 E. coli O157:H7 污染豆芽为了确定各种胞外多糖和脂多糖在病原体结合中的作用 E. coli O157:H7 菌株对苜蓿芽的黏附性，采用第6步所述方法检测了一组突变株对芽苗和开放种皮的结合能力。结果显示，聚-ß-1,6-N乙酰-D-葡萄糖胺（PGA）似乎是与芽体结合所必需的，且纤维素和卷曲酸均是实现最大结合所必需的 E. coli O157。本表格经Matthysse、Deora、Mishra和Torres修改10.
为了确定聚谷氨酸（PGA）的产生是否足以引起细菌与植物表面的结合，将携带编码PGA合成所需基因的克隆操纵子的质粒（pMM11）导入两种通常无法与番茄根部结合的细菌中10. A. tumefaciens A1045 是野生型菌株 C58 的一个突变体，不能产生环状β-1,2-葡聚糖，也无法与植物表面结合29。而Sinorhizobium meliloti 1021 能在苜蓿上形成根瘤，但不能与包括番茄在内的非豆科植物结合12。采用步骤1.1、5.1、6.3和7.1中所述技术，检测产生PGA的能力是否普遍增强了细菌对根部表面的结合能力。番茄种子经表面灭菌后，在无菌水中萌发。将根切成1 cm长的片段，置于无菌水中，并接种细菌。由于这两种细菌的生长速度不同，因此在不同时间点测定结合情况，以确保细菌生长量大致相等。携带质粒pMM11导致两种细菌的结合数量均显著增加（表2）10。在光学显微镜下也观察到结合显著增强，但两种细菌的结合方式存在明显差异（图3）。A. tumefaciens A1045 以单个细菌的形式直接附着于根部表面；而S. meliloti 则形成大的菌簇，其中仅有少数细菌直接与根部接触，大多数细菌通过与其他细菌连接而间接附着。此实例表明，若仅分析结合细菌的数量而不结合显微观察，可能会对实验结果产生误导性认识。尽管两种方法（活菌计数和显微观察）均显示pMM11增强了细菌对番茄根部的结合能力，但由PGA产生所导致的结合方式在这两种细菌间存在差异10。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">质粒pMM11对细菌结合番茄根部的影响</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细菌菌株</td>
			<td>质粒</td>
			<td>每毫米根长结合的细菌数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A. tumefaciens A1045a</td>
			<td>无</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pBBR1mcs（载体）</td>
			<td>0.25 x 103 ± 0.25 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pMM11（PGA合成）</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. meliloti 1021b</td>
			<td>无</td>
			<td>未检测到</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pBBR1mcs（载体）</td>
			<td>未检测到</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pMM11（PGA合成）</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">a 细菌结合在2小时后测定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">b 细菌结合在18小时后测定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">本表格经修改自 Matthysse, Deora, Mishra, 和 Torres10。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：携带PGA合成基因的质粒对结合能力的影响 A. tumefaciens A1045 和 S. meliloti 1021 菌株接种番茄根段为了检测聚-ß-1,6-N-乙酰-D-葡萄糖胺（PGA）以促进细菌与植物根部的结合，研究考察了一种可赋予细菌合成PGA能力的质粒（pMM11）对两种与植物相关的细菌菌株与番茄根部结合能力的影响。在缺乏该质粒或存在不含PGA合成基因的质粒（pBBR1mcs）时，两种细菌菌株均未表现出对番茄根部的显著结合能力。携带PGA合成基因的质粒的引入使两种细菌的结合能力均得到增强。由于 A. tumefaciens 比……生长更快 S. meliloti 孵育2 h后测定结合情况 A. tumefaciens 18小时后 S. meliloti. 所用技术如步骤7所述。本表格改编自Matthysse、Deora、Mishra和Torres10.
<img alt="细胞微结构图像；在10 µm尺度下对毛发纤维进行显微分析，显示其结构细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3质粒pMM11携带PGA生物合成基因对结合能力的影响 A. tumefaciens A1045 和 S. meliloti 1021 至番茄根毛。 A）与番茄根毛的结合 A. tumefaciens A1045，B） A. tumefaciens A1045 pMM11，C） S. meliloti 1021，以及 D） S. meliloti 1021 pMM11。尽管两种细菌的结合量增加大致相似，但在光学显微镜下观察到的结合细节存在明显差异。所用技术参见步骤6。该图改编自Matthysse, Deora, Mishra和Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
有时可利用细菌在非生物表面的结合能力，帮助区分在特定相互作用中细菌与植物各自的贡献。研究表明，A. tumefaciens 的单极多糖（UPP）能够介导该细菌与多种生物及非生物表面的结合30。已观察到钙离子可抑制由 UPP 介导的 A. tumefaciens 与植物表面的结合28。为了确定钙离子对细菌与植物表面结合的抑制作用是源于对细菌的影响还是对植物表面的影响，实验检测了细菌在尼龙线上的结合情况。实验采用第 8.2 步所述技术。番茄种子按第 1 步所述方法进行表面灭菌并在水中萌发。细菌在含蔗糖的最低培养基中培养后，按第 5.1 步所述方法以终浓度约 105/mL 添加至番茄根部或尼龙线。通过显微镜观察添加 CaCl2 对细菌在番茄根部和尼龙线表面结合的影响。图 4 显示，在两种表面上钙离子均表现出相似的结合抑制作用，表明钙离子的作用主要针对细菌本身10。
<img alt="真菌菌丝的显微镜图像，10 µm 比例尺，结构分析，细胞形态学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：钙对根癌农杆菌（A. tumefaciens）结合番茄根毛和尼龙丝的影响。 将根癌农杆菌（A. tumefaciens）与番茄根（A 和 B）或尼龙丝（C 和 D）在 MS 盐 1:10 稀释液和 AB 最小培养基 1:20 稀释液、0.4% 蔗糖（A 和 C）中，或在含 60 mM CaCl2 的 MS 盐 1:10 稀释液和 AB 最小培养基 1:20 稀释液、0.4% 蔗糖（B 和 D）中共同孵育 24 小时31。添加的 CaCl2 抑制了细菌对根和尼龙丝的结合，表明该抑制作用主要归因于对细菌本身的影响，而非对植物表面的作用。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种简便的方法，用于测量和表征细菌对植物（特别是根部和芽）的黏附。

本文描述了一种利用光学显微镜及活细胞计数技术检测细菌与无菌植物表面结合的方法。

本实验的总体目标是观察并测量细菌与植物表面的结合情况。该方法可回答植物病理学和食品安全领域的重要问题，特别是关于细菌如何与植物表面结合以及如何将其去除的问题。该技术的主要优点是操作简便、快速且成本低廉。准备水培幼苗时，将少量种子放入30、50、100或150毫升的玻璃烧杯中。此处使用番茄种子。用80%乙醇覆盖种子，轻轻摇晃片刻，然后让种子浸泡一分钟。倒掉乙醇，将种子浸入含有50%商用漂白剂、0.1%Triton X-100和自来水的溶液中。让种子浸泡20分钟或更长时间，如果种子较大（如豆类种子）。倒掉漂白剂混合液，用无菌水将种子清洗三次，每次清洗时让种子在水中浸泡一分钟。将种子和少量水倒入无菌培养皿中，在黑暗条件下培养种子，直至幼苗长到所需大小，即1厘米至10厘米之间。为准备在沙土中生长的种子或幼苗，首先对种子和种植材料进行灭菌处理，然后根据文本方案接种细菌。使用无菌玻璃棒在沙土中挖一个浅孔，深度以刚好能将种子置于沙面以下为宜。将种子放入孔中，并用一层薄沙覆盖。然后用封口膜密封容器顶部，以防止水分流失和额外微生物进入。在实验室光照条件下或温室中，根据植物的种类和品种，在适宜的温度和光照周期下培养植物。将幼苗种植在沙子中。使用无菌玻璃棒打孔。然后用无菌不锈钢钩针将根小心引导至孔中，并用沙子填充孔的两侧。根据文本方案将植物与细菌共培养后，将样品置于载玻片上的水滴或培养液中，直接进行显微镜观察。若未观察到游离的细菌，可能是细菌已死亡，或细菌在孵育过程中与容器壁发生结合。将样品置于装有液体的样品瓶中，通过轻轻倒置样品瓶的方式用水或孵育液洗涤样品。随后将样品转移至载玻片上的新鲜液体中，用于观察。使用普通的盖玻片来封片。如果样品较厚并产生凸起，则将液体和样品加入压片的凹孔中，并使用边缘带有橡胶或塑料环的盖玻片。将载玻片置于其上，轻轻按压，使盖玻片与载玻片密封。将载玻片倒置以观察样品。或者，以类似方式使用藻类计数载玻片和盖玻片，并在不超过20倍的放大倍数下进行观察。为确定在沙土中生长的植物所携带的活菌数量，首先需移除容器顶部和底部的密封材料。将容器置于一张无菌纸上，轻轻敲击容器底部，使沙子松动，然后小心地将沙柱连同植物从容器中取出。当沙柱和植物完整地落在纸上后，沿沙柱中央切开，以暴露植物根系。如有需要，可同时采集靠近容器边缘以及靠近根系附近的沙样。这有助于确定细菌的扩散、积累和生长情况。取出根部，通过将根浸入已知体积的水或缓冲液中并轻轻振荡，以去除松散附着的沙子和细菌。通过将所得悬液涂布于合适的培养基（如LB琼脂）上，测定其中细菌的活菌数量。这代表与根部 loosely 结合的细菌数量。最后，通过超声处理去除紧密结合的细菌，并测定其数量。该图显示了两种不同的纤维素缺陷突变对细菌定植番茄根部能力的影响。尽管某些测量值的标准差高达以10为底的0.9 log，但纤维素缺失突变株的结合能力下降趋势仍清晰可见。本实验测定了无法合成不同胞外多糖的突变株与野生型大肠杆菌O157:H7在苜蓿芽上的结合能力。在两个菌株中，聚-β-1,6-葡萄糖醛酸（PGA）的产生似乎对致病性大肠杆菌与植物表面的结合贡献最大。胶状酸在结合过程中也发挥了重要作用。本实验中，两种无法与植物表面结合的细菌菌株被改造为能够产生PGA，以确定PGA是否足以引起细菌与番茄根部的结合。在根癌农杆菌A1045的情况下，PGA促使细菌单独结合到根部表面。另一方面，黏着的 S.meliloti 呈现为大的簇状结构，其中只有少数细菌直接附着于根部，而大多数细菌则附着在其他细菌上。一旦掌握，该技术的初始设置可在一小时之内完成，另需一定的孵育时间，观察评分时间则介于10分钟至一小时之间，具体时长取决于样品。在进行该操作时，重要的是要记住，细菌几乎可以黏附到任何表面。观看本视频后，您应能够充分理解如何观察细菌与植物表面的结合，确定细菌在植物上的结合位点，并测定结合的细菌数量。请注意，若使用人类病原菌进行这些操作，过程可能具有极高危险性，必须采取预防措施，例如在密闭防护罩内操作并佩戴手套。

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

科研

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