Name: 粘附细胞培养的时间推移荧光显微镜对蛋白质降解率的单细胞定量研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学习利用SNAP标签脉冲标记与荧光延时显微技术，在单细胞水平定量测定粘附培养细胞中目标蛋白质的降解速率与半衰期。该方法可揭示细胞群体内的异质性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

时间序列显微镜实验在洛桑联邦理工学院（EPFL）的生物分子筛选平台（BSF）进行。我们感谢洛桑联邦理工学院视听服务中心的 Marc Delachaux 在影片拍摄与剪辑方面的协助。

注意：本研究中使用了 E14 胚胎干细胞系。然而，该方案可直接适用于任何其他表达目标蛋白与 SNAP-标签融合蛋白的小鼠胚胎干细胞系，无论是通过标记内源性蛋白还是通过过表达实现。结果部分所示示例采用的是多西环素诱导型 SNAP-标签融合蛋白细胞系（SNAP-标签分别与以下蛋白融合：Nanog、Oct4、Srsf11 或荧光蛋白 mOrange2 和 sfGFP，并由多西环素诱导型启动子调控。有关构建多西环素诱导型 SNAP-标签融合细胞系所用质粒的更多信息，请参见11）。多西环素诱导系统尤为有用，因其可严格控制目标蛋白表达的时间和强度。建议将 SNAP-标签置于蛋白的 C 末端，因为改变 N 末端氨基酸序列更可能影响目标蛋白的半衰期（N-末端规则12）。
1. E-钙黏蛋白包被及细胞接种
<ol>
	<li>生成表达目标蛋白与SNAP标签融合的ES细胞系4.</li>
	<li>用 4 mL 0.1% 明胶（溶于不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）中）包被 100 mm 细胞培养皿2+/毫克2+孵育1小时。去除明胶，室温干燥1小时。立即使用，或将包被的培养皿于4℃保存，最长可存放2个月。</li>
	<li>在 ES 细胞培养基（Glasgow 最低必需培养基，添加 10% 经 ES 细胞鉴定的胎牛血清、2 mM 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸、1% 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺）中培养目标细胞系 100 µM 2-巯基乙醇，白血病抑制因子（LIF） 3 µM CHIR99021 和 0.8 µM PD184352）置于明胶包被的培养皿中 37 °C 和5% CO2 培养2天，直至每个培养皿细胞汇合度达到10 - 20 × 10⁶个细胞。 
	注意：此处的LIF通过瞬时转染HEK 293T细胞后收集上清液并过滤制备。每批LIF均经过测试其维持多能性的能力，但未测定浓度。然而，重组LIF也可从商业途径获得，常用于小鼠胚胎干细胞培养的浓度为1000 units/mL13.</li>
	<li>用适用于成像的96孔板 30 µL 每孔加入5 ng重组小鼠E-cadherin Fc嵌合蛋白（E-cad-Fc）µL，用含钙的 PBS 稀释2+/毫克2+. 使用100 ng/μL的储备浓度µL，储存于 -80 °C）。避免反复吹打，因为E-cad-Fc非常脆弱。于 37 °C 1.5 小时。 
	注意：根据显微镜型号的不同，可能会使用其他格式。</li>
	<li>吸去E-cad-Fc，用缓冲液洗涤一次 100 µL 含钙的 PBS2+/毫克2+，并加入 100 µL 预热的ES细胞培养基</li>
	<li>用不含 Ca 的 PBS 5 mL 洗涤目标细胞2+/毫克2+吸弃后加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37℃孵育4分钟 37 °C加入4 mL ES细胞培养基，重悬细胞后在1000 × g离心4分钟。吸除上清液，将沉淀物重悬于2 mL新鲜ES细胞培养基中。 
	注意：不含 Ca 的 PBS2+/毫克2+ 应使用其在胰蛋白酶消化前洗涤细胞，以去除 Ca2+ 离子，这些离子是细胞黏附所必需的。相比之下，在E-cad-Fc稀释与包被（步骤1.4）时，应使用含Ca²⁺的PBS2+/毫克2+，因为 ES 细胞在 E-cad-Fc 包被的培养皿上的黏附依赖于 Ca2+-依赖的14.</li>
	<li>将重悬的细胞用1 mL ES细胞培养基按1:10稀释，使用计数板进行计数（加样 10 µL （适用于深度为0.1 mm的腔室）。</li>
	<li>接种 30,000 个细胞/cm²2 在E-cad-Fc包被的成像板中。加液至 200 µL 每孔加入ES细胞培养基。对于可诱导型细胞系，加入适当浓度的强力霉素进行诱导（需预先优化诱导剂量和时间。本实验所用细胞系在成像前24小时以500 ng/mL强力霉素处理）。置于 37 °C 和5% CO₂2 在细胞接种后24小时进行脉冲标记和成像。</li>
</ol>
2. SNAP-标签的脉冲标记
注意：进行蛋白质降解实验时，使用适当的 SNAP 染料浓度至关重要。染料浓度应足够高，以确保在时间序列成像初期获得明亮的荧光信号，因为荧光信号会随时间推移而减弱。然而，若染料浓度过高，则可能在洗涤后仍有残余染料滞留在培养基或细胞内。这些游离染料可能在后续成像过程中与新合成的 SNAP 标签蛋白结合，从而干扰降解曲线的准确性。所观察到的荧光信号强度取决于染料的特性、所用细胞系以及相应蛋白的表达水平。因此，必须通过测试不同稀释度来优化染料浓度，起始浓度可参考生产商推荐的活细胞成像稀释比例。本研究中使用了一种远红荧光底物，针对多西环素诱导型过表达细胞系，确定最佳浓度为 12 nM。
<ol>
	<li>将 SNAP 染料用预热的 ES 细胞培养基稀释至适当浓度。用移液器轻轻吸去先前接种于 96 孔板中的细胞的培养基，每孔加入 50 µL 稀释后的 SNAP 染料。在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用移液器吸去稀释的染料，用 200 µL 预热的不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 洗涤 3 次。每孔加入 200 µL ES 细胞培养基，在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>重复上述洗涤步骤两次。 
	注意：充分洗涤对于去除未结合的染料至关重要。通过 PBS 多次洗涤可去除培养基中残留的胞外染料，而每次 15 分钟的孵育则可确保在开始成像实验前 SNAP 标签融合蛋白被有效标记。然而，洗涤操作应使用轻柔的移液方式，避免使用自动吸液装置，因为接种在 E-cad-Fc 上的细胞容易脱落。</li>
	<li>加入 200 µL 成像培养基。为降低荧光背景，使用不含酚红的培养基（补充 10% ES 细胞专用胎牛血清、2 mM 丙酮酸钠、1% 非必需氨基酸、1% 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、100 µM 2-巯基乙醇、LIF、3 µM CHIR99021 和 0.8 µM PD184352）。</li>
</ol>
3. 时间序列显微镜观察
<ol>
	<li>使用适用于活细胞成像的显微镜，该显微镜应具备温度和 CO2 控制功能。使用前将温度设置为 37 °C，CO2 设置为 5%，并预热平衡 1 - 2 小时。</li>
	<li>将培养板放入显微镜中，寻找适合成像的视野。选择细胞分布均匀但不过于密集的区域，以便于后续分析。根据分析所需的细胞数量调整所选视野的数量。本研究中，每种细胞系记录 3 - 5 个视野。</li>
	<li>选择物镜。对于胚胎干细胞（ES 细胞）的尺寸，20 倍物镜是合适的。</li>
	<li>选择待记录的荧光通道照明参数。根据目标细胞荧光信号的强度调整激光功率和曝光时间。确保获得较强的初始信号，因为信号在成像过程中会逐渐减弱；但应避免使用超过 30% 的激光功率，以尽量减少光毒性和荧光漂白。本研究中使用的参数为：激发滤光片 632/22 nm（波长/带宽），发射滤光片 679/34 nm（波长/带宽），激光功率 10%，曝光时间 100 ms。</li>
	<li>设置延时成像的时间间隔和总时长。对于预期半衰期为 2 - 20 小时的蛋白质，建议采集时间为 12 - 24 小时，时间间隔为 15 分钟。对于寿命较短的蛋白质，应缩短时间间隔和采集时间；对于寿命较长的蛋白质，则相应延长。</li>
	<li>开始成像。</li>
</ol>
4. 图像处理与分析
<ol>
	<li>以 tiff 格式将采集的图像作为图像栈进行收集。使用 FIJI 软件进行后续处理和分析15如果延时数据未由显微镜软件以图像序列形式采集，则在软件中打开延时实验的所有帧（可通过点击 文件 | 打开… 或通过将相应文件拖放到工具栏来上传，然后点击 图像 | 堆叠 | 图像堆叠.</li>
	<li>使用减去背景功能从图像堆栈中的所有图片中去除背景。操作方法为点击 过程 | 减去背景在弹出窗口中选择滚动球半径。所选半径应至少等于所成像细胞的大小。为将背景减除应用于图像栈中的所有细胞，请选择 是 在 工艺堆叠？ 弹出窗口</li>
	<li>选择目标细胞，并使用工具栏在其周围绘制感兴趣区域（ROI）。对于核信号，使用 椭圆形 首先点击工具栏中相应的标签，然后点击目标细胞核并调整其周围的椭圆区域来进行选择。对于细胞质信号或非常密集的区域，使用自由手绘选择工具，以便更紧密地沿细胞轮廓进行勾画。应避免包含过大的背景区域，尽管由于后续将减去所有背景像素（步骤 4.8 - 4.9），因此无需精确沿细胞轮廓勾画。</li>
	<li>通过点击将感兴趣区域添加到 ROI 管理器中 分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器 | 添加，或通过按下 T 在键盘上。</li>
	<li>通过移动堆叠窗口中的标签或按住 Shift + 方向键进入下一帧 &lt; 在键盘上按相应键，然后重复之前的操作。在整个视频过程中跟踪目标细胞，并将每一帧的感兴趣区域（ROI）添加到ROI管理器中。通过点击保存每个被追踪细胞的最终ROI集合。 更多 | 保存…在 ROI 管理器中。 
	注意：细胞分裂后，需分别追踪两个子细胞，并在扣除背景后（见步骤 4.6 - 4.9）将其整合荧光强度相加，以校正细胞分裂过程中蛋白质的稀释效应。保存两个子细胞的感兴趣区域（ROI）集合。</li>
	<li>一旦在整个视频中追踪到目标细胞，单击 测量，以获取各 ROI 的平均强度和面积值。将获得的数值复制到电子表格程序中，并按如下方法计算每个时间点细胞的原始整合强度： 
	<img alt="Ic=MeanC×AreaC；电路分析中用于计算电流的方程。" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	其中 平均值c 是平均强度，而 面积C 相应ROI的面积。</li>
	<li>为估计局部背景，需在每个时间帧中于目标细胞附近添加一个感兴趣区域（ROI），注意避免包含任何细胞荧光信号。使用一个大小约与细胞相当的圆形ROI，并根据需要移动或缩小该区域。 例如 如果邻近细胞产生干扰，则按照先前所述方法设置细胞ROI，以获得背景ROI区域，并将测得的荧光强度值复制到电子表格中。</li>
	<li>为获得细胞总荧光强度的背景校正值，首先计算每个时间点背景的总荧光强度： 
	<img alt="静态平衡方程，I_BG = Mean_BG * Area_C，用于演示平衡计算。" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	其中 平均值BG 是背景信号的平均强度，且 面积C 是围绕细胞的感兴趣区域（ROI）的面积。除非两个区域面积相同，否则不要使用背景感兴趣区域的面积。</li>
	<li>计算每个时间点细胞的最终背景校正后整合荧光强度： 
	<img alt="信号分离方程：IC-BG = IC - IBG；用于光谱数据分析图示。" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"></li>
	<li>为标准化单细胞衰减曲线，将每个时间点的强度值除以第一个时间点的强度值。 
	注意：曲线拟合（见步骤 4.11）可针对单个细胞进行，也可基于细胞群体的平均值进行。若计算基于群体的平均值，则需要进行归一化处理，以避免不同细胞间荧光强度差异带来的偏差。因此，归一化可确保每个细胞对最终衰减曲线的贡献权重相同。此外，归一化还有助于在不受绝对荧光强度影响的情况下可视化单个细胞的衰减情况（参见 图3A-3C然而，如果仅测定单个细胞的半衰期，且数据未进行平均处理，则可以省略归一化步骤，直接对原始数据进行曲线拟合。</li>
	<li>为估算蛋白质半衰期，请使用曲线拟合工具。本研究中使用了 MATLAB 曲线拟合工具箱 3.4.1，该工具箱默认位于 应用程序 MATLAB 用户界面部分。通过点击将电子表格中的荧光强度和时间值导入 MATLAB 导入数据 打开曲线拟合工具箱，选择时间点和荧光衰减数据 X 数据 和 Y 数据 标签。选择 自定义方程 在曲线拟合选项卡中输入指数衰减方程： 
	<img alt="指数衰减公式 f(t)=a*e^(-bt)，数学表达，数据拟合" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 
	其中 f(t) 是在给定时间点的荧光强度， a 初始强度和 b 衰变速率。在 拟合选项… 选项卡中，将两者的下限均选择为 0 a 和 b. 估算值为 a 和 b 结果将显示在结果窗口中。按如下方法计算半衰期： 
	<img alt="半衰期方程 \( t_{1/2} = \frac{ln(2)}{b} \) 用于描述衰变过程。" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5"></li>
</ol>

<ol><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15173609">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li>
<li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Select%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li>
<li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li>
<li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li>
<li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li>
<li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745(2011).</li>
<li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li>
<li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li>
<li>Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15(2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li>
<li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAST%3A+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22076938">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li>
<li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability%2C+DNA+Binding%2C+and+Transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用 SNAP-标签监测蛋白质降解时最关键的步骤是确保洗涤后培养基或细胞内不残留未结合的染料，否则这些染料可能在实验后续阶段与新合成的 SNAP-标签分子结合，从而影响降解曲线的准确性。一方面，这需要严格按照所述步骤进行充分洗涤；另一方面，染料浓度应尽可能低，同时仍需保持在能够获得良好信噪比的范围内。如图2所示，应通过测试不同稀释度来为每次实验优化染料浓度。在本实验中，多西环素诱导的细胞系具有相对较高的表达水平，因此可使用较低的染料浓度。
本方案描述了一种通过延时荧光成像在单细胞水平定量蛋白质降解的通用方法，该方案的各个部分可根据实验条件和具体实验目的进行相应调整。蛋白质降解通常遵循一级指数衰减规律。对于本文所示的蛋白质衰减曲线，拟合的R2值较高（0.95–0.99），使用多指数模型并未显著改善拟合效果。然而，如果单指数拟合结果不理想，可考虑采用多指数拟合，这可能意味着存在多个以不同速率衰减的标记蛋白亚群。此外，我们的图像分析流程包含大量人工操作，仅适用于分析少量细胞。若需分析大量细胞，应考虑采用更自...

众所周知，细胞蛋白质会经历广泛的更新，其合成和降解速率对每种蛋白质具有特异性，并受到生理条件的调控。传统上，蛋白质降解速率的测定依赖于群体水平的方法，例如放射性脉冲追踪分析，或使用蛋白质合成抑制剂（如环己酰亚胺）1。近年来，细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）结合质谱技术已被建立，用于在全基因组范围内定量蛋白质更新速率2。然而，这些方法受限于对细胞群体的平均化处理，因而丢失了单个细胞之间的变异信息。此外，对于在细胞群体中不同步发生的蛋白质降解的瞬时变化，这些方法也无法识别。
或者，也可采用基于荧光的方法测定蛋白质半衰期，此类方法通常具有单细胞分辨率的优势。例如，已有研究利用光激活型绿色荧光蛋白（paGFP）测定早期哺乳动物胚胎中Oct4的半衰期3另一种在活细胞中监测蛋白质降解的方法是使用SNAP标签结合荧光延时成像技术。SNAP标签是DNA修复酶O6-烷基鸟嘌呤DNA-烷基转移酶（AGT），可特异性地与苯甲基鸟嘌呤（BG）衍生物反应，后者可偶联至分子探针4,5,6因此，任何与SNAP-标签融合的蛋白均可与一种荧光性、可穿透细胞的染料发生不可逆标记。对目标蛋白与SNAP-标签的融合蛋白进行脉冲标记，随后洗去残留染料，即可监测被标记蛋白群体的降解过程，从而测定蛋白的半衰期。SNAP-标签已成功应用于贴壁细胞培养中蛋白的脉冲-追踪标记及蛋白半衰期的测定 体内5,7,8,9市面上有多种商业化的SNAP-tag底物，覆盖了常用的荧光光谱范围，可根据每种特定应用选择最合适的荧光染料。因此，SNAP-tag可与其他荧光融合蛋白或染料联用，实现多色成像。细胞不可渗透性染料适用于膜锚定蛋白的标记，而细胞可渗透性染料则可用于检测细胞内蛋白和膜结合蛋白。此外，部分探针在未结合SNAP-tag时几乎不产生本底荧光，仅在与SNAP-tag结合后才发出强烈的荧光信号。10.
本方案描述了如何利用SNAP标签在单细胞水平上测量不同目的蛋白的降解速率。本文中，我们将该方法应用于培养在E-钙黏蛋白上的小鼠胚胎干细胞（ES细胞），但该方法也可用于任何贴壁培养的细胞类型。我们证明，对SNAP标签融合蛋白进行脉冲标记，随后进行荧光延时成像，可测定各种目的蛋白在单细胞中的半衰期，并可评估培养细胞群体中细胞间半衰期的变异性。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>表达目标 SNAP-tag 融合蛋白的 ES 细胞系</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm 细胞培养皿（TC处理）</td><td>康宁</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96孔，黑色/透明，组织培养处理板</td><td>康宁</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>改进型奈堡计数室，0.1 mm</td><td>马里恩费尔德-上部</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 细胞成像系统</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>格拉斯哥最低必需培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，胚胎干细胞专用</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基&amp;nbsp; 非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>生物概念</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>-</td><td>-</td><td>通过HEK-293T细胞的瞬时转染在实验室中制备，随后收集并过滤上清液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021（GSK-3抑制剂XVI）</td><td>默克密理博</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>牛皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS 10倍浓缩液</td><td>生物概念</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca++/Mg++ 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>生物概念</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠E-钙黏蛋白Fc融合蛋白</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>开源图像分析软件</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

通过延时荧光显微镜在贴壁细胞培养中对蛋白质降解速率进行单细胞定量分析

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

蛋白质处于合成与降解的动态平衡状态，其半衰期可在不同条件下发生调节。然而，目前常用的测定蛋白质半衰期的方法大多仅限于裂解细胞获得的群体平均值，或需要使用蛋白质合成抑制剂。本实验方案描述了一种利用SNAP-tag融合蛋白结合荧光时间延时显微镜技术，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。任何与SNAP-tag融合的目标蛋白均可共价结合一种带有苯甲基鸟嘌呤衍生物的荧光、可穿透细胞的染料，在洗去残留染料后，可监测标记蛋白群体的信号衰减过程。随后通过细胞追踪并量化随时间变化的总荧光强度，可为每个被追踪的细胞生成一条指数衰减曲线，进而通过曲线拟合确定单个细胞中蛋白质的降解速率。该方法能够估算培养细胞群体中半衰期的异质性，而这种异质性难以通过其他方法轻易评估。本文所述方法适用于表达SNAP-tag融合蛋白的任何类型的培养贴壁细胞。本文以生长在E-钙黏蛋白包被培养板上的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）为例，展示如何测定具有广泛不同半衰期的蛋白质在单细胞水平的降解速率。

本方案可评估任意与SNAP标签融合的蛋白质在细胞间的半衰期变异性。利用重组E-cadherin-Fc包被成像培养板，可在胚胎干细胞（ES细胞）中实现单细胞分辨率，这些细胞通常以集落形式生长。在整个成像过程中，可对单个细胞进行独立追踪（图1A）。
为了确定每个单细胞的蛋白质半衰期，必须随时间测量经背景校正的整合SNAP-tag荧光信号（图1B），在细胞分裂的情况下，需将两个子细胞的整合荧光强度相加。由此可获得每个细胞的指数衰减曲线，通过曲线拟合可从中提取衰减速率，进而计算出半衰期（图1C）。重要的是，若要计算平均衰减曲线，应将单细胞轨迹归一化至第一帧，以确保尽管各细胞初始荧光强度可能存在差异，每个细胞在平均值中具有相同的权重。
合适的染料浓度取决于所用染料的类型和细胞系，因此应针对每个实验进行优化。为说明这一点，<strong class="xfig"...

本方案描述了一种利用脉冲标记和SNAP-标签融合蛋白的荧光延时成像，在单个活体贴壁细胞中测定蛋白质半衰期的方法。

蛋白质处于合成与降解的动态平衡状态，其半衰期可在不同条件下发生调节。然而，最常用的……

本荧光成像方法的总体目标是利用SNAP标签在单个活细胞中测定目标蛋白的半衰期。细胞内蛋白质不断更新，其合成与降解速率因蛋白而异，并受到生理条件的调控。然而，目前常用的测定蛋白半衰期的方法，要么仅限于从大量细胞中获得群体平均值，要么需要使用蛋白质合成抑制剂。在本视频中，我们演示了如何将 SNAP-标签与荧光延时显微镜相结合，用于测量活细胞中蛋白质的半衰期。该方法的优势在于能够实现单细胞分辨率，从而对培养细胞群体中半衰期的异质性提供估算。此处介绍的实验方案可应用于任何类型的贴壁培养细胞，只要其表达目标蛋白与 SNAP-标签的融合蛋白即可。这可以通过内源性蛋白标记或过表达带标签蛋白来实现。SNAP-标签是DNA修复酶O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的一个突变体，可特异性地与苄基鸟嘌呤发生反应，而后者可与分子探针偶联。因此，任何SNAP-标签融合蛋白均可与一种荧光细胞通透性染料发生不可逆标记。当洗去残留染料后，标记的蛋白质群体将呈指数衰减，由此可推断相应蛋白质的半衰期。在本视频中，我们使用胚胎干细胞，这类细胞在明胶包被的培养皿上进行经典培养时会形成紧密的克隆集落。为了使其以单层细胞形式生长，从而在荧光成像实验中实现单细胞分辨率，我们将细胞培养在降低细胞黏附性的包被培养板上，以减少由细胞质膜表面表达的细胞黏附分子介导的细胞间相互作用。将重组Inc黏附蛋白用PBS稀释至每微升5纳克，然后在96孔成像板中每孔加入30微升稀释后的Inc黏附蛋白。避免反复吹打，因为重组Inc黏附蛋白非常脆弱。在37摄氏度孵育一个半小时。吸去培养皿中残留的培养基，用 100 微升 PBS 洗涤一次，加入最多 200 微升预温的 ESL 培养基。使用表达目标蛋白与 SNAP-tag 融合蛋白的 ESL 细胞系。用 5 毫升 PBS 洗涤细胞。然后加入 2 ml Tripson，37 摄氏度孵育 4 分钟。加入 4 ml ESL 培养基，重悬细胞，以 1000 ×g 离心 4 分钟。吸除上清液，用新鲜培养基重悬细胞，并进行细胞计数。在经黏附涂层处理的成像板中，每平方厘米接种 30,000 个细胞。细胞接种后 24 小时进行 SNAP 染料染色。将细胞染料用 ELS 培养基稀释至先前确定的最佳浓度。使用移液器吸去培养基，小心加入50微升稀释后的SNAP染料。在37摄氏度下孵育30分钟。吸去染料，并用200微升预温的PBS缓冲液洗涤三次。加入 200 微升 ESL 培养基，于 37 摄氏度孵育 15 分钟。通过轻柔的移液操作进行洗涤步骤，不要使用自动吸液器，因为细胞容易脱落。重复上述洗涤步骤两次，然后加入 200 微升成像培养基。使用不含酚红的培养基以减少荧光背景。使用可控制温度和 CO2 的显微镜。使用前将温度设置为 37 度，CO2 设置为 5%，并平衡 1 至 2 小时。将培养板放入显微镜中，选择适合成像的区域。明场图像显示 ESL 以单层形式附着在包被的培养皿上。选择物镜，对于此类大小的 ESL，20X 物镜较为合适。选择待记录的荧光通道的照明设置。调整激光功率和曝光时间以获得较强的信号，因为信号在成像过程中会逐渐减弱。设置延时实验的采集参数。对于预期半衰期为2至20小时的蛋白质，选择12至24小时的采集时间，时间间隔为15分钟。启动成像实验。使用FIJI软件对视频进行处理和分析。将获取的图像作为图像栈进行收集并进行形变处理。使用FIJI的“减去背景”功能去除图像栈中所有图片的背景。选择目标细胞，利用FIJI工具栏在其周围绘制感兴趣区域，并将该感兴趣区域添加至ROI管理器中。进入下一帧并重复上述操作。在整个视频过程中持续追踪目标细胞，并为每个被追踪的细胞保存对应的感兴趣区域（ROI）。点击“测量”以获取ROI的平均荧光强度和面积数值。为估算局部背景，在每个时间帧中，在目标细胞附近添加一个感兴趣区域。最后，单击“测量”以获取平均背景强度值。首先，通过将细胞感兴趣区域的平均强度值乘以其面积，计算细胞的平均强度。然后，通过将背景感兴趣区域（ROI）的平均强度乘以细胞感兴趣区域（ROI）的面积，计算细胞的积分背景值。最后，为了获得细胞积分强度的背景校正值，需从细胞的积分强度值中减去积分背景强度值。为了得到细胞群体的平均半衰期，需将获得的数值归一化为每个细胞第一帧的强度值。这确保了每个细胞对平均半衰期值的贡献权重相同，而与其绝对荧光强度无关。在细胞分裂后，分别追踪两个子细胞，并在扣除背景后对其积分强度求和，以考虑细胞分裂过程中的蛋白质稀释效应。保存两个子细胞的感兴趣区域（ROI）集合。为了估算蛋白质的半衰期，使用 MATLAB 中的曲线拟合工具。蛋白质的降解遵循指数衰减规律，其中 F(x) 表示在给定时间点的荧光强度，a 表示初始强度，b 表示降解速率。从拟合结果中获得降解速率 b 的值后，可通过将 2 的对数除以 b 来计算半衰期。本视频展示了在多西环素不可用的 Opt4 SNAP-tag 融合细胞系中 SNAP 染料荧光的衰减过程。观察到的荧光信号将取决于所用的细胞系、目标蛋白的表达水平以及所用染料的特性。对于蛋白降解实验，使用适当的SNAP染料浓度至关重要。该浓度应足够高，以确保在时间序列的初始阶段产生明亮的荧光信号。然而，使用过高的染料浓度可能会导致即使在洗涤后仍有残留染料留在培养基中。游离染料可能在成像过程中与新合成的SNAP-tag分子结合，从而扭曲衰减曲线。因此，通过测试不同稀释度来优化SNAP染料浓度至关重要。该图显示了在多西环素不可用细胞系上测试的八种不同浓度荧光 SNAP 染料的衰减曲线。根据制造商对活细胞成像的说明，选择初始染料浓度为 3 µM，并进行 1 比 3 的系列稀释，直至浓度达到 1.4 nM。在两个最高浓度下，信号未出现下降，而在较低浓度下，观察到的衰减呈指数曲线形式。在此示例中，选择了 12 纳摩尔的最优浓度，因为该浓度可确保洗涤后培养基中残留的染料最少，同时荧光信号仍足够强，能够观察到清晰的衰减曲线。所述方案可估算与 SNAP 标签融合的任意给定蛋白质的细胞间变异性和半衰期。该图显示了三种不同无法使用多西环素的 SNAP 标签融合细胞系的单细胞衰减曲线及群体平均值。Nanog和Oct4的半衰期相对较短，平均半衰期分别为2.9小时和4.8小时。而Srsf11的半衰期较长，平均为25.3小时。箱线图显示了这三种蛋白质半衰期的分布情况。我们已证明，将 SNAP 标签与荧光延时显微镜结合使用，可测定任何目标蛋白的半衰期。单细胞衰变测量能够估算细胞群体中半衰期的异质性，而使用其他方法测定蛋白半衰期时则无法获得这一信息。使用 SNAP 标签监测蛋白降解时，最关键的步骤之一是确保洗涤后培养基或细胞内无残留的未结合染料。否则，它可能会在实验后续阶段与新生成的SNAP-tag分子结合，从而影响衰减曲线的准确性。一方面，这需要仔细执行所有所述的洗涤步骤；另一方面，应尽可能降低SNAP染料的浓度，同时仍保持在能够获得良好信噪比的范围内。应根据细胞系和所用染料的类型，针对每个实验优化SNAP染料的浓度。尽管在某些情况下SNAP标签可能改变候选蛋白的半衰期，但我们未观察到此类效应的证据，因为测定的候选蛋白半衰期与已发表的数值高度一致。为进一步排除SNAP标签对蛋白降解的影响，可选用的一种方法是：使用环己酰亚胺阻断蛋白合成，并在不同时间点进行免疫印迹检测，采用可识别内源性蛋白的抗体。并直接比较SNAP标签候选蛋白与其无标签的内源版本的降解情况。

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

粘附细胞培养的时间推移荧光显微镜对蛋白质降解率的单细胞定量研究

我们描述了一种用于制备荧光明胶包被的显微镜盖玻片的典型方法，以可视化由侵袭性伪足介导的基质降解。本文介绍了利用现有软件进行计算分析的技术，可用于定量混合细胞群体中单个细胞以及涵盖整个显微视野的多细胞群体所导致的基质蛋白水解水平。...

单细胞与多细胞环境中侵袭足介导的细胞外基质降解的定量测量

基于荧光微孔板的放线菌酮追踪实验：一种监测荧光标记核内错误折叠蛋白降解动力学的技术

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。...

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

本文介绍了一种用于定量泛素-蛋白酶体系统中蛋白水解相对速率的可靠生物学检测方法。该检测的读出指标为酵母在液体培养中的生长速率，其依赖于报告蛋白的细胞内水平，该报告蛋白由一个降解信号与必需的代谢标记物融合而成。...

基于报告基因的生长分析法用于系统性研究蛋白质降解

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

本报告介绍了通过蛋白质印迹法或基于荧光的检测方法来测定错误折叠蛋白质降解速率的实验方案。这些方法可应用于其他错误折叠蛋白质的分析，以及高通量筛选。...

细胞中错误折叠蛋白质降解的检测方法

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。...

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

我们描述了通过自噬和蛋白酶体在小鼠肝脏中测量蛋白质分解代谢生物节律的实验方案。...

测量自噬和蛋白酶体流的昼夜节律

我们介绍一种利用微图案阵列获取单细胞荧光报告信号时间序列的方法。本方案详细描述了单细胞阵列的制备、活细胞扫描式延时显微镜的设置与操作，以及一个开源图像分析工具，用于对每个黏附位点的细胞整合荧光时间序列进行自动预筛选、可视化质控和追踪分析。...

活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

本方案描述了使用脉冲式SILAC对衰老细胞和非分裂细胞进行代谢标记、非靶向质谱分析以及蛋白质半衰期的简化计算的工作流程。...

通过代谢标记与质谱法测定衰老及非分裂培养细胞中的蛋白质周转率

学习利用SNAP标签脉冲标记与荧光延时显微技术，在单细胞水平定量测定粘附培养细胞中目标蛋白质的降解速率与半衰期。该方法可揭示细胞群体内的异质性。

通过延时荧光显微镜在贴壁细胞培养中对蛋白质降解速率进行单细胞定量分析

探索更多视频