Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

这种荧光成像方法的总体目标是使用 SNAP 标签确定单个活细胞中目标蛋白质的半衰期。细胞蛋白质被广泛翻转，合成和降解速率对每种蛋白质都是特异性的，并受到生理调节。然而，最常用的确定蛋白质半衰期的方法要么仅限于虱子细胞的群体平均值，要么需要使用蛋白质合成抑制剂。

在本视频中，我们演示了如何将 SNAP 标签与荧光延时显微镜相结合来测量活细胞中的蛋白质半衰期。这种方法的优点是它实现了单细胞分辨率，因此为培养细胞群中半衰期的异质性提供了估计值。此处介绍的实验程序可应用于任何类型的贴壁培养细胞，表达与 SNAP 标签融合的目标蛋白。

这可以通过内源性蛋白质标记或使用标记蛋白质的过表达来实现。SNAP 标签是 DNA 修复酶 O6-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶的突变版本，它与苄基鸟嘌呤特异性反应，苄基鸟嘌呤可与分子探针偶联。因此，任何 SNAP 标签融合蛋白都可以用荧光细胞渗透性染料进行不可逆标记。

洗去残留染料后，标记的蛋白质群将呈指数衰减，并且可以推断出相应蛋白质的半衰期。在本视频中，我们使用胚胎干细胞，当它们在明胶包被的培养皿上经典生长时，它们会形成紧密的菌落。为了让它们作为单层细胞生长，从而实现荧光成像实验的单细胞分辨率，我们将它们培养在 inc 粘附的包被板上，这减少了由细胞 inc 粘附介导的细胞间相互作用在质膜上表达。

在 PBS 中稀释粘附的重组 inc 至每微升 5 ng，并在 96 个阀板中为每个瓣膜添加 30 μL 稀释的粘附 inc，适用于成像。避免大量移液，因为重组化合物的粘附非常脆弱。在 37 度下孵育 1 个半小时。

吸出 inc 粘附溶液，用 100 μL PBS 洗涤一次，然后添加至 200 μL 预蠕虫 ESL 培养基。使用表达与 SNAP 标签融合的目标蛋白的 ESL 细胞系。用 5 ml PBS 洗涤细胞。

然后加入 2 ml Tripson，在 37 度下孵育 4 分钟。加入 4 ml ESL 培养基，重新悬浮，并以 1000 T 离心 4 分钟。吸出上清液，重悬于新鲜培养基中，并计数细胞。

每平方厘米可容纳 30， 000 个细胞，位于 inc 粘附涂层成像板中。在细胞放置 24 小时后继续进行 SNAP 染料染色。在 ELS 培养基中将细胞染料稀释至先前确定的最佳浓度。

使用移液管吸出培养基，并小心加入 50 μL 稀释的 SNAP 染料。在 30 度下孵育 37 分钟。吸出染料并用 200 微升蠕前 PBS 洗涤 3 次。

加入 200 μL ESL 培养基，在 37 度下孵育 15 分钟。通过轻柔的移液进行洗涤步骤，不要使用自动吸液器，因为细胞往往很容易分离。再重复相同的洗涤步骤两次，然后加入 200 微升成像介质。

使用不含酚红的培养基来减少荧光背景。使用允许控制温度和 CO2 的显微镜。使用前将温度设置为 37 度，将 CO2 设置为 5%，并平衡 1 到 2 小时。

将板放入显微镜中，然后选择适合成像的点。明场图像显示 ESL 以单层形式粘附在 inc 涂层培养皿上。选择物镜，20X 物镜适合此大小的 ESL。

选择要录制的荧光通道的照明度设置。调整激光功率和曝光以获得较强的信号，因为它会随着影片的播放过程而降低。选择延时实验的采集参数。

对于预期半衰期为 2 到 20 小时的蛋白质，请选择 12 到 24 小时的采集时间，时间间隔为 15 分钟。开始成像实验。使用 FIJI 软件处理和分析电影。

将获取的图像收集为堆栈并使其变形。使用减去背景斐济函数从堆栈中的所有图片中删除背景。选择一个感兴趣的单元格，使用 FIJI 工具栏在其周围绘制一个感兴趣的区域，然后将感兴趣的区域添加到 ROI 管理器中。

进入下一帧并重复前面的作。在整个影片过程中跟踪感兴趣的单元格，并保存每个跟踪单元格的 ROI 集。单击 measure 以获取 ROI 的平均强度和面积的值。

要估计局部背景，请为每个时间范围添加靠近感兴趣单元格的感兴趣区域。最后，单击 measure 以获取平均背景强度的值。首先，通过将获得的细胞 ROI 的平均强度值乘以其面积来计算细胞的平均强度。

然后，通过将背景 ROI 的平均强度乘以细胞 ROI 的面积，继续计算细胞的积分背景值。最后，为了获得细胞积分强度的背景校正值，请从积分细胞强度值中减去积分背景强度值。为了获得细胞群的平均半衰期，将获得的值标准化为每个细胞的第一帧的强度值。

这确保了每个细胞对平均半衰期值的贡献相同，而与其绝对荧光强度无关。细胞分裂后，分别追踪两个子细胞，并在扣除背景后对它们的积分强度求和，以解释细胞分裂过程中的蛋白质稀释。保存两个子单元格的 ROI 集。

对于蛋白质半衰期的估计，请使用 MATLAB 中的曲线拟合工具。蛋白质衰变遵循指数，其中 F（x） 是给定时间点的荧光强度，a"初始强度"，b"衰变速率。从拟合中获得衰变速率 b"的值后，可以通过将 2 的对数除以 b"该电影显示了多西环素不可用的 opt 4 SNAP 标签融合细胞系中 SNAP 染料荧光的衰变。

观察到的荧光信号将取决于所使用的细胞系、相应目标蛋白的表达水平以及所用染料的特性。对于蛋白质衰变实验，使用足够浓度的 SNAP 染料非常重要。浓度应足够高，以便在延时开始时产生明亮的荧光信号。

但是，使用过高的染料浓度可能会导致残留的染料留在培养基中，即使在洗涤后也是如此。游离染料随后可能会在电影过程中与新产生的 SNAP 标签分子结合，这会扭曲衰变曲线。因此，通过测试不同的稀释度来优化 SNAP 染料浓度至关重要。

该图显示了在多西环素不可用细胞系上测试的八种不同浓度的荧光 SNAP 染料的衰变曲线。根据活细胞成像的制造商说明选择 3 微摩尔的初始染料浓度，并进行 1 至 3 的连续稀释，直至达到 1.4 纳摩尔的浓度。对于两个最高浓度的信号不会降低，而对于较低浓度，观察到的衰减遵循指数曲线。

在本例中，选择了 12 纳摩尔的最佳浓度，因为该浓度可确保洗涤后残留染料的最小量，但荧光信号仍然足够亮，可以观察到清晰的衰变曲线。所描述的方案提供了与 SNAP 标签融合的任何给定蛋白质的细胞间变异性和半衰期的估计值。该图显示了单细胞衰变，以及三种不同多西环素不可用的 SNAP 标签融合细胞系的群体平均值。

Nanog"和 Oct4"的寿命相当短，平均半衰期为 2.9 和 4.8 小时。而 Srsf11"寿命更长，平均半衰期为 25.3 小时。箱线图显示了三种蛋白质的半衰期分布。

我们已经表明，将 SNAP 标签与荧光延时显微镜结合使用，可以确定任何感兴趣蛋白质的半衰期。单细胞衰变测量为细胞群中半衰期的异质性提供了估计值，当使用其他方法确定蛋白质半衰期时，可以省略该估计值。使用 SNAP 标签监测蛋白质衰变时，最关键的步骤之一是确保洗涤后培养基或细胞中没有残留的未结合染料。

否则，它可能会在实验过程的后期与新产生的 SNAP 标签分子结合，从而损害衰变曲线。一方面，这是通过仔细执行所有描述的洗涤步骤来实现的。另一方面，SNAP 染料浓度应保持在尽可能低的范围内，同时仍保持在允许获得良好信噪比的范围内。

应根据细胞系和所用染料类型，针对每个实验优化 SNAP 染料浓度。虽然 SNAP 标签在某些情况下可能会改变候选蛋白的半衰期，但我们没有看到这种影响的证据，因为候选蛋白测试的确定半衰期与已发布的值非常匹配。为了进一步排除 SNAP 标签对蛋白质降解的影响，一种选择是，用放线菌酮阻断蛋白质合成，并在不同时间点使用识别天然蛋白质的抗体进行洗手间印迹。

并直接比较 SNAP 标签候选蛋白与未标记的本土蛋白的衰变。