重组原型泡沫病毒整合酶纯化过程中核酸酶污染的检测与去除

本方案的总体目标是在蛋白质纯化过程中识别并去除污染性的核酸酶活性。该方法有助于回答逆转录病毒学领域的关键问题，例如整合过程中的生物化学、结构与动态特性。该技术的主要优势在于，能够在纯化重组目标蛋白的过程中，识别并去除其中污染性的DNA核酸酶活性。

首先将一管表达原型泡沫病毒整合酶的 E.coli 菌体冰上融化。使用配备直径为 0.5 英寸、末端为直径 0.125 英寸锥形微探头的超声破碎仪，在冰上对菌液进行超声处理，条件为振幅 30%，持续 30 秒。超声处理后，将细胞样品转移至预冷的超速离心管中，在 4°C 下以 120,000 ×g 离心 60 分钟。

离心后应可见明显沉淀，上清液可能呈黄色。将上清液转移至预冷的50毫升锥形管中。接着，准备一根110毫米长、5毫米直径的FPLC柱，内含1.5毫升镍离子负载树脂。

首先，将层析柱连接至FPLC仪器，并上样缓冲液。仪器应实时采集电导率和280纳米处的紫外吸光度数据。电导率和紫外读数应趋于稳定。

如有必要，继续用缓冲液冲洗层析柱，直至读数稳定。使用超大进样环，以每分钟0.15毫升的流速和不超过0.5兆帕的最大压力限制，将蛋白质样品上样至层析柱。将超大进样环连接至AKTA FPLC系统。

洗涤层析柱并洗脱蛋白质后，取初始穿流液、洗涤液以及280纳米吸光度峰值组分各15微升，分别加入15微升2× SDS-PAGE上样缓冲液。将样品煮沸3分钟。每份样品取10微升，连同4微升预染蛋白质标准品，上样至10% SDS-PAGE凝胶中。

通过肉眼观察凝胶，确定含有近乎纯的原型泡沫病毒整合酶的组分。合并这些组分，并在移液时记录其体积，通常为 8 至 10 毫升。

使用分光光度计测定合并组分在280纳米处的紫外吸光度，并计算原型泡沫病毒整合酶蛋白的总量。典型的产量约为每升诱导培养物10毫克。为去除六组氨酸标签，向原型泡沫病毒整合酶中添加终浓度为10毫摩尔的DTT和0.1毫摩尔的EDTA。

然后每毫克原型泡沫病毒整合酶加入15微克人鼻病毒3C蛋白酶，在4摄氏度下孵育过夜。为进行原型泡沫病毒整合酶的肝素亲和层析分级分离，通过加入1.5倍体积的C缓冲液将样品的氯化钠浓度降低至200毫摩尔。随后以每分钟0.5毫升的流速（最大压力限制为1兆帕）将稀释后的原型泡沫病毒整合酶样品上样至肝素Sepharose柱。洗涤柱子并收集梯度洗脱组分及最终洗涤液后，通过8% SDS-PAGE分析上样样品、穿流组分、洗涤组分及各洗脱组分。

然后用考马斯亮蓝染色凝胶以评估各组分。原型泡沫病毒整合酶与污染的核酸酶对肝素 Sepharose 层析具有不同的亲和力。鉴定出似乎含有近乎纯化的原型泡沫病毒整合酶的肝素 Sepharose 组分，用于核酸酶活性检测。

开始核酸酶活性检测时，将三微升肝素组分、50纳克三干碱基的环状超螺旋质粒DNA以及反应缓冲液混合，总体积为15微升。在37摄氏度孵育90分钟。加入终浓度为每毫升1毫克的蛋白酶K和0.5% SDS终止反应，并在37摄氏度继续孵育一小时。

然后向核酸酶反应体系中加入 3.5 µL 的 6X 上样缓冲液，并将全部体积上样至 1% 琼脂糖凝胶中。在室温下以 100 伏电压电泳运行一小时，或直至染料前沿迁移至凝胶末端。电泳完成后，凝胶的荧光扫描图像应显示：线性 DNA 的迁移大小约为 3 kb，超螺旋 DNA 迁移较快，约为 2 kb，而松弛环状 DNA 迁移较慢，接近 3.5 kb。

使用图像分析软件，计算每条泳道中超螺旋、线性和松弛环状质粒的像素体积。将这三种DNA形式的像素体积总和称为总DNA值，并用其计算线性和松弛环状DNA所占的百分比。含有核酸酶污染的组分与阴性对照相比，其线性和松弛环状DNA的百分比更高。

合并不含核酸酶活性污染的肝素 Sepharose 洗脱组分，并转移至 10 毫米、截留分子量为 6 至 8 千道尔顿的透析袋中。在 4 摄氏度下，用 1 升透析液透析过夜。次日，从透析袋中回收无核酸酶的原型泡沫病毒整合酶样品。

在280纳米处测定吸光度，并计算最终的蛋白浓度。将蛋白分装后，于液氮中速冻，然后于-80摄氏度保存。

核酸酶活性检测按照本视频所述步骤进行。阴性对照包括不含蛋白质的质粒DNA，以及先前纯化的已知不含核酸酶污染的野生型原型泡沫病毒整合酶。用于检测核酸酶污染的阳性对照是先前纯化的已知含有核酸酶污染的催化失活型原型泡沫病毒整合酶。

通过此操作步骤，还可进行其他方法，如生化分析或单分子成像，以回答更多问题，例如酶动力学和动态变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何识别并去除重组蛋白中的污染性核酸酶活性。