Name: 重组原型泡沫病毒整合纯化过程中核酸污染的检测与去除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 了解如何通过肝素亲和层析和核酸酶检测，从大肠杆菌中纯化重组原型泡沫病毒整合酶并去除核酸污染。该方法可获得适用于下游生化与单分子分析的无核酸酶PFV IN。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为AI099854和AI126742，授予KEY。

1. 在E. coli中诱导PFV IN表达
<ol>
	<li>加入1 μL PFV IN表达质粒（10 ng/μL）至20 μL中 E. coli BL21(DE3) pLysS（市售细胞，20 μL 分装） &#62;2 × 106 将质粒按每微克CFU数（CFU/μg质粒）加入1.5 mL离心管中。轻轻弹击或轻弹管壁混匀。冰上孵育5分钟。
	<ol>
		<li>在42 ˚C水浴中热激恰好30秒，然后立即放回冰上孵育2分钟。</li>
		<li>加入80 μL室温的含分解代谢抑制的超级优化肉汤（SOC）培养基，在37 ˚C、225转/分钟（rpm）振荡条件下孵育1小时。</li>
		<li>在含有25 mL LB琼脂（1 L LB琼脂：10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物、15 g琼脂）和100 μg/mL氨苄青霉素（100 mg/mL储备液）的100 mm × 15 mm培养皿中，加入25 μL混合物进行涂布。</li>
		<li>将剩余的75 μL转化细胞涂布于第二块相同的平板上。将平板倒置，在37 °C下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取出转化后的平板 E. coli 使用单菌落接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素的3 mL LB培养基（1 L LB：10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物）中，培养管为14 mL圆底聚丙烯管。在37 ˚C、225 rpm振荡条件下培养约8小时。
	<ol>
		<li>将3 mL培养物加入含有100 μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素（34 mg/mL储存液）的50 mL LB培养基中，置于250 mL锥形瓶内。在37 °C、225 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
		<li>将53 mL培养物转移至含有1 L LB培养基、100 μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素的4 L锥形瓶中。在37 °C、225 rpm振荡条件下培养。</li>
		<li>在 600 nm 处测量光密度（OD600定期检测培养物的 OD 值。最初，检查培养物的 OD600 每小时。当培养物达到目标OD时600，每15分钟检查一次，避免过度生长。将菌液培养至OD600 介于0.9至1.0之间。将锥形瓶转移至冰浴中，轻轻摇动以降低培养物的温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1 mL培养物转移至1.5 mL离心管中，用于后续的变性SDS-PAGE分析。
	<ol>
		<li>在室温下，于14,000 × g离心1分钟，使1.5 mL离心管中的细胞沉淀。弃去上清液。用移液器将沉淀重悬于150 μL磷酸盐缓冲液（PBS）中。PBS可含或不含CaCl₂。2 和 MgCl2.</li>
		<li>加入150 μL 2x SDS-PAGE上样缓冲液（150 mM Tris-HCl，pH 6.8，1.2% SDS，30%甘油，15% β-巯基乙醇（βME），0.0018%溴酚蓝），用移液器或涡旋仪充分混匀。于100°C加热变性3分钟。置于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向细菌培养物中加入：终浓度为 0.25 mM 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，0.25 M 储存液）和 50 μM ZnCl₂2 （50 mM 储存液）。IPTG 诱导 PFV 的表达 在 来自T7启动子的基因和ZnCl₂2 作为补充剂，用于PFV IN氨基末端锌指结构域的正确折叠。将培养物在25 °C、225 rpm振荡条件下孵育4小时。立即将烧瓶转移至冰浴中。按照1.3节所述相同方案，保留1 mL培养物用于SDS-PAGE分析。</li>
	<li>将细菌培养物转移至适当尺寸的离心管中。例如，1 L 培养物可分装至四个无菌一次性 250 mL 圆锥底聚丙烯离心管中。在4 ˚C条件下，于冷藏台式离心机中以3000 x g离心20分钟。倾倒弃去上清液。
	<ol>
		<li>将1 L细菌培养物的所有沉淀物重悬于总体积为25 mL（每瓶6.25 mL）的预冷PBS（含或不含CaCl）中2 和 MgCl2用移液器吹打混匀。将菌液悬液合并后转移至一个50 mL锥形离心管中。在4 °C条件下，于制冷离心机中以3,000 × g离心20分钟。倾倒或用移液器弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细菌沉淀用10 mL重悬缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，500 μM苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂）通过移液重悬。将装有样品的离心管浸入盛有液氮的杜瓦瓶中，迅速冷冻。小心取出离心管，并于-80 °C保存。 
	注意：细菌沉淀物可在 -80 °C 下保存数月。我们观察到在 -80 °C 保存两年后，活性蛋白未出现损失。</li>
	<li>使用8.3 cm宽、7.3 cm高、0.75 mm厚的SDS-PAGE凝胶分析诱导前和诱导后样品，凝胶包含1.5 mL 6%聚丙烯酰胺浓缩层（125 mM Tris-HCl，pH 6.8，6%丙烯酰胺，0.1% SDS，0.1%过硫酸铵，0.001% TEMED）和3.5 mL 10%聚丙烯酰胺分离层（375 mM Tris-HCl，pH 8.8，10%丙烯酰胺，0.1% SDS，0.1%过硫酸铵，0.001% TEMED）12.
	<ol>
		<li>灌注浓缩胶后，插入10孔梳子。待凝胶聚合后，组装PAGE电泳装置，并加入足量SDS-PAGE电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM glycine，0.1% SDS）。</li>
		<li>上样10 μL每种样品和4 μL预染蛋白质标准品。以16.5 V/cm电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部，约60 min。</li>
		<li>拆卸凝胶板并将凝胶转移至塑料容器中。加入足量考马斯亮蓝染色液（0.1% 考马斯亮蓝 R-250，40% 甲醇，10% 乙酸）以完全覆盖凝胶，室温下染色 20 分钟。</li>
		<li>倒掉染色液，加入脱色液（40% 甲醇，10% 乙酸），直至条带清晰可见。倒掉脱色液，更换为去离子水。PFV IN 应在诱导后样品中易于识别。带有六组氨酸标签的 PFV IN 分子量为 47374 Da。</li>
		<li>如果看不到PFV IN，可从转化平板中选择另一个菌落重新开始诱导。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 镍亲和层析
<ol>
	<li>将一管细菌沉淀物置于冰上解冻。 
	注意：此步骤将耗费较长时间（约 2 - 3 小时）。当沉淀物解冻至细胞悬液状态时，加入额外的 500 μM PMSF（100 mM 储存液）。</li>
	<li>将装有细菌悬液的50 mL离心管置于冰上。使用直径为0.5英寸、带有直径为0.125英寸锥形微探头、频率为20 kHz、最大功率为400 W的超声破碎仪，对每1 L培养液所得菌体沉淀进行超声处理，超声参数为30%振幅，总时长30 s（工作1 s，间歇1 s）。</li>
	<li>将细胞样品转移至预冷的超速离心管中。使用与Type 60 Ti固定角转子兼容的聚碳酸酯管组件（直径25 mm，高度89 mm）。若能达到相同的离心力，也可使用其他类型的离心管和转子。在4 °C条件下以120,000 × g离心60分钟。离心后应可见明显沉淀。上清液可能呈黄色。</li>
	<li>将上清液通过倾倒或移液转移至预冷的50 mL离心管中。记录体积，该体积应近似等于速冻前用于重悬的缓冲液体积。若上清液黏稠，可能被细菌DNA污染，这会堵塞层析柱。此时，需重复超速离心以沉淀细菌DNA。</li>
	<li>配制 500 mL 缓冲液 A（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，500 μM PMSF）和 500 mL 缓冲液 B（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，500 μM PMSF，200 mM 咪唑）。 
	注意：本实验方案中，应将快速蛋白液相色谱（FPLC）系统、所有缓冲液及样品置于冷室中，保持在 4 °C。
	<ol>
		<li>使用0.2 μm一次性滤器对缓冲液A和缓冲液B进行无菌过滤。根据FPLC系统的要求，分别用缓冲液A和缓冲液B冲洗泵A和泵B。以90%缓冲液A和10%缓冲液B的流动相流经系统，直至电导率和紫外吸收读数稳定。最大流速取决于仪器型号；建议使用5 mL/min的流速，最大压力限制为1.0 MPa。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备一根长110 mm、直径5 mm的FPLC柱，装填1.5 mL镍离子螯合树脂（最大结合容量50 mg/mL，最大耐压1 MPa）。可在纯化前一天制备色谱柱，并于4 ˚C保存。</li>
	<li>将色谱柱连接至FPLC仪器。用20 mL含90%缓冲液A和10%缓冲液B（20 mM 咪唑）的溶液以0.5 mL/min的流速平衡色谱柱，最大压力限制为0.5 MPa。仪器应实时采集电导率和280 nm处的紫外吸光度（A280）。电导率和紫外吸收读数应趋于稳定。如果这些读数尚未稳定，请继续用缓冲液冲洗色谱柱，直至读数稳定。</li>
	<li>将蛋白样品（每管约10 mL）以0.15 mL/min的流速上样至层析柱，最大压力限制为0.5 MPa。整个纯化过程中流速和柱压保持不变。用50 mL离心管收集穿流组分。
	<ol>
		<li>用20 mL含90%缓冲液A和10%缓冲液B的溶液洗涤层析柱，收集洗脱液至50 mL离心管中。用20 mL线性梯度洗脱液（缓冲液B比例从10%升至100%，即咪唑浓度从20 mM升至200 mM）洗脱蛋白质。</li>
		<li>最后，用5 mL 100%缓冲液B（200 mM咪唑）洗涤层析柱。收集梯度洗脱液和最终洗涤液于 0.27 mL 份</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将15 μL的2x SDS-PAGE上样缓冲液与15 μL的穿流液、洗涤液和洗脱峰A组分混合280 组分。将样品煮沸3分钟。
	<ol>
		<li>按照步骤1.6所述方法制备两块10% SDS-PAGE凝胶，但使用15孔梳子。每孔上样10 μL样品，并加入4 μL预染蛋白质标准品。按照步骤1.6所述条件进行电泳、染色及凝胶分析。</li>
		<li>根据目测结果，合并含有几乎纯净的PFV IN的组分。使用移液器测量体积，通常为8 - 10 mL。</li>
		<li>使用分光光度计测量 A280 合并组分的蛋白总量并计算PFV IN蛋白的总产量；通常每升诱导培养物可获得约10 mg蛋白。带有六组氨酸标签的PFV IN蛋白的消光系数为59360 cm⁻¹·(mol/L)⁻¹。-1 M-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为去除六组氨酸标签，向PFV IN中加入10 mM二硫苏糖醇（DTT，1 M储存液）和0.1 mM EDTA（pH 8.0，0.5 M储存液）。每毫克PFV IN加入15 μg人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶。4 ˚C下孵育过夜。切割后PFV IN的分子量由47374 Da降至44394 Da，可通过10% SDS-PAGE分析验证。</li>
</ol>
3. 肝素亲和层析
<ol>
	<li>配制 250 mL 缓冲液 C（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM DTT，0.1 mM EDTA，500 μM PMSF）和 250 mL 缓冲液 D（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM DTT，0.1 mM EDTA，500 μM PMSF，1 M NaCl）。 
	注意：在本实验方案中，FPLC 系统、缓冲液和样品均置于 4 ˚C 的冷室中。
	<ol>
		<li>使用 0.2 μm 一次性滤器对缓冲液 C 和缓冲液 D 进行无菌过滤。根据 FPLC 系统的不同，分别用缓冲液 C 和缓冲液 D 清洗泵 A 和泵 B。以 80% 缓冲液 C 和 20% 缓冲液 D 的比例流经系统，直至电导率和紫外吸收读数稳定。最大流速取决于仪器型号；我们通常使用 5 mL/min 的流速，最大压力限制为 1.0 MPa。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备一根长 80 mm、直径 5 mm 的 FPLC 柱，装填 1 mL 肝素 Sepharose 树脂（每毫升树脂最大结合容量为 2.0 mg 牛抗凝血酶 III，最大耐受压力为 1.4 MPa）。该层析柱可在纯化前一天制备，并于 4 °C 保存。将柱子连接至 FPLC 仪器。
	<ol>
		<li>以 0.5 mL/min 的流速，使用 20 mL 含 80% 缓冲液 C 和 20% 缓冲液 D（200 mM NaCl）的混合缓冲液平衡柱子，最大压力限制为 1 MPa。仪器应实时采集电导率和 280 nm 处的紫外吸光度（A280）数据。电导率和紫外读数应趋于稳定。若未稳定，继续用缓冲液冲洗柱子直至读数稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过加入 1.5 倍体积的缓冲液 C，将 PFV IN 样品中的 NaCl 浓度降低至 200 mM。例如，向 10 mL PFV IN 中加入 15 mL 缓冲液 C。我们的总体积通常约为 25 mL。</li>
	<li>以 0.5 mL/min 的流速将稀释后的 PFV IN 样品上样至肝素 Sepharose 柱，最大压力限制为 1.0 MPa。在整个纯化过程中，流速和柱压保持不变。用 50 mL 锥形管收集穿流液。
	<ol>
		<li>用 20 mL 含 80% 缓冲液 C 和 20% 缓冲液 D（200 mM NaCl）的混合缓冲液洗涤柱子，洗脱液收集于 50 mL 锥形管中。随后用 30 mL 线性梯度缓冲液（从 20% 至 100% 缓冲液 D，即 NaCl 浓度从 200 mM 升至 1 M）进行洗脱。</li>
		<li>再用 5 mL 100% 缓冲液 D 洗涤柱子。将梯度洗脱液和最终洗涤液按每管 0.37 mL 分部收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤 2.9 所述方法，通过 8% SDS-PAGE 分析上样液、穿流液、洗涤液及各收集组分。PFV IN 在切除六组氨酸标签后的分子量为 44394 Da，且去除六组氨酸标签后其消光系数仍为 59360 cm-1 M-1。所有组分在完成核酸酶活性检测前均应保存于 4 ˚C。</li>
</ol>
4. 核酸酶实验
<ol>
	<li>鉴定肝素琼脂糖层析组分中几乎纯的PFV IN。将3 μL肝素组分与50 ng 3 kb超螺旋质粒DNA在反应缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5，110 mM NaCl，5 mM MgSO₄）中混合4，4 μM ZnCl₂2，10 mM DTT），终体积为15 μL。37 ˚C孵育90分钟。设置不含PFV IN的阴性对照。
	<ol>
		<li>使用 1 mg/mL 蛋白酶 K（20 mg/mL 储存液）和 0.5% SDS（10% 储存液）终止反应。37 °C 孵育 1 小时。样品可于 -20 °C 保存，以备后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制125 mL 1% 质量体积比（w/v）的琼脂糖凝胶，溶剂为1x&#160;TAE 缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA），含 0.1 µg/mL 溴化乙锭（10 mg/mL 储存液）13将琼脂糖溶液融化后倒入15 cm × 10 cm的凝胶制备板中。插入一个具有15个加样孔的梳子，加样孔宽度为5 mm，厚度为0.75 mm。与1.5 mm厚的加样孔相比，较薄的加样孔可获得更好的条带分辨率。在室温下静置，使凝胶完全凝固。
	<ol>
		<li>将凝胶浸入1x缓冲液中&#160;含0.1 µg/mL溴化乙锭的TAE缓冲液。向核酸酶反应体系中加入3.5 μL 6x上样缓冲液（50%甘油，0.15%橙G染料）。将全部反应产物上样至凝胶。在室温下以恒定电压（每厘米10伏，即100 V）电泳1小时，或直至橙G染料前沿迁移至凝胶末端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即使用荧光扫描仪对琼脂糖凝胶成像，检测溴化乙锭。线性DNA应按3 kb大小正确迁移，超螺旋DNA迁移较快（约2 kb），松弛环状DNA迁移较慢（约3.5 kb）。
	<ol>
		<li>使用图像分析软件，计算每条泳道中超螺旋、线性和松弛环状质粒的像素体积。将这三种DNA形式的像素体积之和称为 &#34;总DNA&#34; 将该值用于计算线性化和松弛环状DNA的百分比。例如，用该泳道中松弛环状DNA的像素体积除以总DNA像素值，再将所得数值乘以100，即可得到百分比。含有核酸酶污染的组分相较于阴性对照，其线性化和松弛环状DNA的百分比更高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合并不含有核酸酶污染活性的肝素琼脂糖层析组分。将合并后的组分装入截留分子量为6–8 kDa的透析袋中，在4 °C条件下，用1 L含50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、200 mM NaCl和50 μM ZnCl₂的缓冲液透析过夜。2，10 mM DTT，20% 甘油。</li>
	<li>从透析袋中回收无核酸酶的PFV IN样品。测量A280 并计算最终蛋白质浓度。分装后在液氮中速冻，于 -80 °C 保存分装样品。</li>
</ol>

<ol><li>Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li>
<li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+reaction+pathway+and+critical+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li>
<li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li>
<li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与DNA相互作用的重组蛋白（如DNA修复蛋白、单分子显微镜应用中的氧清除剂或逆转录病毒整合酶）应不含污染性的细菌核酸酶2,3。这些污染物可能会干扰在整体生化实验或单分子检测中对实验结果的解读。
我们发现，一种细菌核酸酶经常与PFV IN共同纯化。然而，PFV IN对肝素琼脂糖的亲和力与细菌核酸酶污染物明显不同1。制备无核酸酶污染的PFV IN的关键在于，在肝素琼脂糖梯度洗脱后的每一组分中，仔细定量其核酸酶活性。梯度必须足够平缓，以实现PFV IN与核酸酶污染物的有效分离；若梯度过陡，则无法实现高效分离。此外，质粒DNA底物中松弛环状结构的比例应尽可能低，以降低核酸酶检测的本底信号。如果质粒DNA底物中松弛环状结构的本底较高，应重新纯化质粒DNA。核酸酶活性检测可揭示污染物核酸酶的存在，并确定应弃去的组分。
在某些情况下，尺寸排阻色谱法（SEC）可能是去除污染性核酸...

蛋白质与DNA相互作用的生化及单分子研究需要极高纯度的重组蛋白。来自细菌的污染性核酸酶可能掩盖这些实验的结果。已在从大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中分离得到的重组蛋白——氧清除剂原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD）和原型泡沫病毒（PFV）整合酶（IN）——的制备样品中发现存在污染性核酸酶1,2,3。
逆转录病毒整合酶活性检测依赖于将超螺旋DNA转化为切口或线性产物，以此作为衡量整合酶（IN）活性的指标4。在细胞感染过程中，整合酶将病毒cDNA的两端连接到宿主染色质上5。每一次末端连接反应称为链转移。重组整合酶活性的检测可通过协同整合反应，将模拟病毒cDNA两端的两个DNA寡核苷酸连接至靶DNA上4,5,6,7,8。或者，重组整合酶也可能仅连接一个DNA末端，发生非生理性的半位点整合反应9,10。当超螺旋质粒DNA作为整合靶标时，协同整合产物为线性DNA，而半位点整合产物为松弛环状DNA。这些反应产物可通过琼脂糖凝胶电泳中相对迁移率的不同进行鉴定1。如果重组整合酶样品中含有污染性核酸酶，则会产生非特异性的松弛环状DNA或可能的线性化质粒，从而干扰实验结果。病毒DNA寡核苷酸可进行荧光标记，以明确区分整合产物与核酸酶降解产物。然而，整合酶对超螺旋DNA靶标具有强烈偏好；若因污染性核酸酶导致超螺旋质粒转化为松弛环状或线性DNA，可能使实验结果和数据分析产生偏差11。因此，从逆转录病毒整合酶制备物中去除细菌来源的核酸酶至关重要。
PFV IN 对肝素琼脂糖的亲和力与细菌核酸酶不同1。PFV IN 与该核酸酶可通过肝素琼脂糖上的线性梯度洗脱实现分离。该核酸酶无法通过 280 nm 处的紫外（UV）吸收峰或分析型十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）轻易检测到。相反，需通过核酸酶活性检测来鉴定，该检测基于超螺旋质粒转化为松弛环状或线性产物的能力。肝素琼脂糖层析后的每一份馏分均需检测核酸酶活性。PFV IN 与核酸酶污染物对 Mono-Q 阴离子树脂的亲和力无差异。在对 Mono-S 阳离子树脂的亲和力上仅有微小差异。然而，Mono-S 树脂无法有效分离细菌核酸酶与 PFV IN。最终，肝素琼脂糖亲和纯化是将细菌核酸酶与 PFV IN 实现最佳分离的方法，且具有上样体积不受限制的优势。
检测核酸酶污染活性的方法可适用于其他蛋白质。目标蛋白质的亲和特性可能与PFV IN不同；目标蛋白质与核酸酶污染物之间的结合特性差异必须通过实验确定。该核酸酶污染检测方法可适用于其他树脂，包括Mono-S阳离子交换树脂或Mono-Q阴离子交换树脂。亲和层析树脂和离子交换树脂可能提供一种可靠方法，用于从核酸酶污染物中分离目标重组蛋白，且在层析过程中对蛋白样品体积无限制。

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta 大肠杆菌</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌（ZnCl₂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris 超纯级</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>咪唑&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>肝素 Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C 蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

重组原型泡沫病毒整合酶纯化过程中核酸酶污染的检测与去除

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

逆转录病毒原型泡沫病毒（PFV）的整合酶（IN）蛋白是研究逆转录病毒整合机制的模式酶。与其它逆转录病毒的IN相比，PFV IN具有更高的溶解度，更易于进行实验操作。此外，它对临床上重要的人类免疫缺陷病毒（HIV-1）IN抑制剂敏感，表明PFV IN的催化机制与HIV-1 IN相似。IN在称为链转移的过程中催化病毒互补DNA（cDNA）与靶DNA之间的共价连接。该链转移反应会在靶DNA上引入切口。由于存在同样能够切割DNA的核酸酶，整合反应产物的分析可能受到干扰。已有研究表明，一种细菌核酸酶会与在Escherichia coli（E. coli）中表达的重组PFV IN共同纯化。本文介绍了一种通过肝素亲和层析法将PFV IN与污染性核酸酶分离的方法。可利用超螺旋质粒和琼脂糖凝胶电泳对各组分中的核酸酶污染进行简便筛选。PFV IN与污染性核酸酶对肝素琼脂糖具有不同的亲和性，因此可通过该方法获得无核酸酶污染的重组PFV IN，适用于整合反应的大规模生化分析或单分子分析。

重组PFV IN常被一种细菌核酸酶污染1。生化整合实验依赖于定量超螺旋质粒DNA转化为松弛环状和线性产物的过程。若存在污染性核酸酶，可能导致这些实验的定量结果出现偏差。在E. coli中诱导表达带有六聚组氨酸标签的PFV IN（图1），并首先通过镍亲和层析进行纯化（图2）。将含有几乎纯化PFV IN的组分合并后，利用蛋白酶切除六聚组氨酸标签。我们已确定PFV IN与污染性核酸酶对肝素Sepharose层析具有不同的亲和力（图3）1。将经过肝素Sepharose层析后的PFV IN组分与超螺旋质粒共同孵育，以检测是否存在松弛环状和线性质粒——即核酸酶活性的产物（图4）。该检测方法可用于鉴定不含核酸酶的蛋白组分（图5）。这些组分可合并...

重组原型泡沫病毒整合酶蛋白在纯化过程中常被细菌核酸酶污染。本方法可鉴定核酸酶污染并将其从酶的最终制备物中去除。

逆转录病毒原型泡沫病毒（PFV）的整合酶（IN）蛋白是研究逆转录病毒整合机制的模式酶。相较于……

本方案的总体目标是在蛋白质纯化过程中识别并去除污染性的核酸酶活性。该方法有助于回答逆转录病毒学领域的关键问题，例如整合过程中的生物化学、结构与动态特性。该技术的主要优势在于，能够在纯化重组目标蛋白的过程中，识别并去除其中污染性的DNA核酸酶活性。首先将一管表达原型泡沫病毒整合酶的 E.coli 菌体冰上融化。使用配备直径为 0.5 英寸、末端为直径 0.125 英寸锥形微探头的超声破碎仪，在冰上对菌液进行超声处理，条件为振幅 30%，持续 30 秒。超声处理后，将细胞样品转移至预冷的超速离心管中，在 4°C 下以 120,000 ×g 离心 60 分钟。离心后应可见明显沉淀，上清液可能呈黄色。将上清液转移至预冷的50毫升锥形管中。接着，准备一根110毫米长、5毫米直径的FPLC柱，内含1.5毫升镍离子负载树脂。首先，将层析柱连接至FPLC仪器，并上样缓冲液。仪器应实时采集电导率和280纳米处的紫外吸光度数据。电导率和紫外读数应趋于稳定。如有必要，继续用缓冲液冲洗层析柱，直至读数稳定。使用超大进样环，以每分钟0.15毫升的流速和不超过0.5兆帕的最大压力限制，将蛋白质样品上样至层析柱。将超大进样环连接至AKTA FPLC系统。洗涤层析柱并洗脱蛋白质后，取初始穿流液、洗涤液以及280纳米吸光度峰值组分各15微升，分别加入15微升2× SDS-PAGE上样缓冲液。将样品煮沸3分钟。每份样品取10微升，连同4微升预染蛋白质标准品，上样至10% SDS-PAGE凝胶中。通过肉眼观察凝胶，确定含有近乎纯的原型泡沫病毒整合酶的组分。合并这些组分，并在移液时记录其体积，通常为 8 至 10 毫升。使用分光光度计测定合并组分在280纳米处的紫外吸光度，并计算原型泡沫病毒整合酶蛋白的总量。典型的产量约为每升诱导培养物10毫克。为去除六组氨酸标签，向原型泡沫病毒整合酶中添加终浓度为10毫摩尔的DTT和0.1毫摩尔的EDTA。然后每毫克原型泡沫病毒整合酶加入15微克人鼻病毒3C蛋白酶，在4摄氏度下孵育过夜。为进行原型泡沫病毒整合酶的肝素亲和层析分级分离，通过加入1.5倍体积的C缓冲液将样品的氯化钠浓度降低至200毫摩尔。随后以每分钟0.5毫升的流速（最大压力限制为1兆帕）将稀释后的原型泡沫病毒整合酶样品上样至肝素Sepharose柱。洗涤柱子并收集梯度洗脱组分及最终洗涤液后，通过8% SDS-PAGE分析上样样品、穿流组分、洗涤组分及各洗脱组分。然后用考马斯亮蓝染色凝胶以评估各组分。原型泡沫病毒整合酶与污染的核酸酶对肝素 Sepharose 层析具有不同的亲和力。鉴定出似乎含有近乎纯化的原型泡沫病毒整合酶的肝素 Sepharose 组分，用于核酸酶活性检测。开始核酸酶活性检测时，将三微升肝素组分、50纳克三干碱基的环状超螺旋质粒DNA以及反应缓冲液混合，总体积为15微升。在37摄氏度孵育90分钟。加入终浓度为每毫升1毫克的蛋白酶K和0.5% SDS终止反应，并在37摄氏度继续孵育一小时。然后向核酸酶反应体系中加入 3.5 µL 的 6X 上样缓冲液，并将全部体积上样至 1% 琼脂糖凝胶中。在室温下以 100 伏电压电泳运行一小时，或直至染料前沿迁移至凝胶末端。电泳完成后，凝胶的荧光扫描图像应显示：线性 DNA 的迁移大小约为 3 kb，超螺旋 DNA 迁移较快，约为 2 kb，而松弛环状 DNA 迁移较慢，接近 3.5 kb。使用图像分析软件，计算每条泳道中超螺旋、线性和松弛环状质粒的像素体积。将这三种DNA形式的像素体积总和称为总DNA值，并用其计算线性和松弛环状DNA所占的百分比。含有核酸酶污染的组分与阴性对照相比，其线性和松弛环状DNA的百分比更高。合并不含核酸酶活性污染的肝素 Sepharose 洗脱组分，并转移至 10 毫米、截留分子量为 6 至 8 千道尔顿的透析袋中。在 4 摄氏度下，用 1 升透析液透析过夜。次日，从透析袋中回收无核酸酶的原型泡沫病毒整合酶样品。在280纳米处测定吸光度，并计算最终的蛋白浓度。将蛋白分装后，于液氮中速冻，然后于-80摄氏度保存。核酸酶活性检测按照本视频所述步骤进行。阴性对照包括不含蛋白质的质粒DNA，以及先前纯化的已知不含核酸酶污染的野生型原型泡沫病毒整合酶。用于检测核酸酶污染的阳性对照是先前纯化的已知含有核酸酶污染的催化失活型原型泡沫病毒整合酶。通过此操作步骤，还可进行其他方法，如生化分析或单分子成像，以回答更多问题，例如酶动力学和动态变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何识别并去除重组蛋白中的污染性核酸酶活性。

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

重组原型泡沫病毒整合纯化过程中核酸污染的检测与去除

甲型流感病毒的基因组由八个独立的RNA和蛋白质复合物组成，称为病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍了甲型流感病毒vRNPs的甘油梯度纯化及其透射电子显微镜观察方法。...

甲型流感病毒核糖核蛋白复合物的纯化与可视化

基于结构的药物设计在药物研发中发挥着重要作用。并行追求多个靶点可显著提高先导化合物发现的成功率。以下文章重点介绍了西雅图传染病结构基因组学中心如何采用多靶点策略，实现流感病毒A型PB2亚基从基因到结构的测定。...

流感病毒聚合酶PB2亚基基因至结构解析的多靶点并行处理方法

来源：Yuan, M., 等．构建突变型痘苗病毒载体的一种简单高效方法．J. Vis. Exp.

基于荧光的重组痘苗病毒检测与纯化

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

本实验方案的目的是特异性标记并选择性分离感染细胞中的病毒DNA，以用于表征与病毒基因组相关的蛋白质。...

用于鉴定相关病毒和细胞蛋白的病毒DNA纯化

重组逆转录病毒整合酶与模拟病毒DNA末端的DNA寡核苷酸可形成一种具有酶活性的复合物，称为整合体（intasome）。整合体可用于生化、结构和动力学研究。本方案详细介绍了如何组装和纯化原型泡沫病毒整合体。...

原型泡沫病毒整合体的组装与纯化

低拷贝数整合病毒DNA的检测方法 体外 乙型肝炎感染

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

插入突变是正向遗传学中用于鉴定功能性基因组元件的重要工具。本文中，我们描述了一种基于插入的功能元件与转录本筛选方法（InSET），该方法可用于检测基于慢病毒的插入突变细胞文库中的慢病毒整合位点。...

插入突变细胞文库中功能相关慢病毒整合位点的鉴定

本方案描述了一种凝胶迁移生化实验，用于检测FEN1（瓣状内切酶1）的活性及抑制剂的开发。...

基于荧光的FEN1核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选

了解如何通过肝素亲和层析和核酸酶检测，从大肠杆菌中纯化重组原型泡沫病毒整合酶并去除核酸污染。该方法可获得适用于下游生化与单分子分析的无核酸酶PFV IN。

重组原型泡沫病毒整合酶纯化过程中核酸酶污染的检测与去除

探索更多视频