重组原型泡沫病毒整合纯化过程中核酸污染的检测与去除

该方案的总体目标是在蛋白质纯化过程中识别和去除污染的核酸酶活性。这种方法可以帮助回答逆转录病毒学领域的关键问题，例如生物化学、结构和整合动力学。该技术的主要优点是，它允许在纯化过程中从目标重组蛋白中鉴定和去除污染的 DNA 核酸酶活性。

首先在冰上解冻一粒表达原型泡沫病毒整合酶的大肠杆菌颗粒。使用配备 0.5 英寸直径生物喇叭和 0.125 英寸直径锥形微尖的超声仪，将试管置于冰上，以 30% 的振幅超声处理 30 秒。超声处理后，将细胞样品转移至冷超速离心管中，并在 4 摄氏度下以 120， 000 倍 g 离心 60 分钟。

离心后，应有明显的沉淀，上清液可能呈黄色。将上清液转移到 50 mL 冷锥形管中。接下来，使用 1.5 mL 含镍树脂设置 110 mm 长、5 mm 直径的 FPLC 色谱柱。

首先，将色谱柱连接到 FPLC 仪器，然后添加缓冲液。仪器应收集 280 纳米的电导率和紫外吸光度的实时数据。电导率和 UV 读数应稳定。

如有必要，继续使缓冲液流过色谱柱，直到读数稳定。使用超级回路，以每分钟 0.15 mL/min 的流速将蛋白质样品上样到色谱柱上，最大压力限制为 0.5 Mega Pascal。将 superloop 连接到 AKTA FPLC。

洗涤色谱柱并吸出蛋白质后，从初始流出物中挑选 15 μL 等分试样，洗涤并达到 280 纳米吸光度分数的峰值，并向每个样品中加入 15 μL 2X SDS-PAGE 样品缓冲液。将样品煮沸 3 分钟。将每个样品的 10 微升加载到 10% SDS-PAGE 凝胶上，以及 4 微升预染蛋白质标准品。

目视检查凝胶以识别似乎含有近乎纯的原型泡沫状病毒整合酶的组分。合并这些馏分，并在移液时记下体积。这通常是 8 到 10 毫升。

使用分光光度计，测量组合级分在 280 纳米处的紫外吸光度，并计算原型泡沫病毒整合酶蛋白的总量。典型产量为每升诱导培养物约 10 毫克。为了去除六组氨酸标签，补充终浓度为 10 毫摩尔 DTT 和 0.1 毫摩尔 EDTA 的原型泡沫病毒整合酶。

然后每毫克原型泡沫病毒整合酶加入 15 微克人鼻病毒 3C 蛋白酶，并在 4 摄氏度下孵育过夜。为了对原型泡沫病毒整合酶进行肝素亲和色谱分离，通过添加 1.5 体积的缓冲液 C 将样品的氯化钠浓度降低至 200 毫摩尔，然后将稀释的原型泡沫病毒整合酶样品以每分钟 0.5 毫升的流速加载到肝素琼脂糖柱中，最大压力限制为 1 兆帕。清洗色谱柱并收集梯度和最终洗涤后，通过 8% SDS-PAGE 分析上样量、流穿、洗涤和馏分。

然后通过用考马斯蓝对凝胶染色来评估馏分。原型泡沫状病毒整合酶和污染核酸酶对肝素琼脂糖层析具有不同的亲和力。鉴定似乎含有近乎纯的原型泡沫状病毒整合酶的肝素琼脂糖级分，用于核酸酶检测。

开始核酸酶检测时，将 3 μL 肝素组分和 50 ng3 kb 超螺旋质粒 DNA 和反应缓冲液混合，最终体积为 15 μL。在 37 摄氏度下孵育 90 分钟。用 1 毫克/毫升蛋白酶 K 和 0.5% SDS 终止反应，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

然后向核酸酶检测反应中加入 3.5 μL 6X 上样染料，并将整个体积上样到 1% 琼脂糖凝胶上。在环境温度下以 100 伏电压电泳凝胶 1 小时，或直到染料前沿到达凝胶末端。电泳完成后，凝胶的荧光扫描仪图像应显示线性 DNA 在 3 kb 处运行正常大小，超螺旋 DNA 运行得更快，达到 2 kb 左右，松弛环 DNA 在接近 3.5 kb 处运行得更慢。

使用图像分析软件，计算每个泳道中超螺旋、线性和松弛圆形质粒的像素体积。将这三个 DNA 的像素体积之和称为总 DNA 值，并使用它来计算线性和松弛圆圈的百分比。与阴性对照相比，含有污染核酸酶的组分显示出更高百分比的线性和松弛圆圈。

混合未显示污染核酸酶活性的肝素琼脂糖级分，并转移到 10 毫米、6 至 8 道尔顿截留分子量透析管中。在 4 摄氏度下对照 1 升透析液透析过夜。第二天，从透析管中回收无核酸酶原型泡沫状病毒整合酶样品。

测量 280 纳米处的吸光度，并计算最终蛋白质浓度。将蛋白质分装，并在液氮中快速冷冻。然后将等分试样储存在零下 80 摄氏度。

本视频中的概述进行核酸酶检测。阴性对照包括不含蛋白质的质粒 DNA 和先前纯化的已知不含核酸酶的野生型原型泡沫病毒整合酶。污染核酸酶活性的阳性对照是先前纯化已知具有污染核酸酶的催化失活原型泡沫病毒整合酶。

在此程序之后，可以执行其他方法，如生化测定或单分子成像，以回答其他问题，如酶动力学和动力学。观看此视频后，您应该对如何识别和去除重组蛋白中的污染核酸酶活性有很好的了解。