组成型与诱导型基因表达系统 体内 通过水动力尾静脉注射法修饰小鼠肝细胞

本方法的总体目标是通过可诱导的基因或shRNA表达载体构建，在体内实现肝细胞的稳定转染。该方法有助于解答肝脏研究领域中的关键问题，例如可用于研究肝癌发生及肝脏再生的机制。

该技术的主要优势在于通过水动力尾静脉注射，在活体小鼠肝细胞中实现CreER与可诱导的R shRNA转基因的联合表达。本实验操作将由本实验室的医学生Eric Hubner进行演示。首先，将含有靶向蛋白短发夹RNA的150纳克入门载体与150纳克pTC Tet载体及TE缓冲液混合，总体积为8微升。

然后将LR克隆酶混合液II转移至冰上，孵育2分钟，孵育期间涡旋振荡两次。随后向反应体系中加入2 µL的LR克隆酶混合液II，并在25 °C下孵育1小时。

孵育结束后，加入一微升蛋白酶K溶液以终止反应。然后在37摄氏度下孵育十分钟。接下来，取两微升连接混合物，采用标准热激方法转化Stbl3感受态细菌。

将转化产物接种于含有氨苄青霉素的琼脂平板后，在30摄氏度下培养24小时。次日，挑取单菌落并接种至少量细菌培养基中，过夜培养。在提取DNA并经Sanger测序确认载体完整性后，制备该重组质粒的大规模DNA样品用于显微注射。

首先称量小鼠的体重。然后配制无内毒素的无菌生理盐水溶液，其中包含每毫升15微克的无内毒素Sleeping Beauty载体构建物和每毫升1微克的无内毒素pchsB5。配制的溶液总量应足以按照每只小鼠体重的10%的体积进行注射。

用无菌的3毫升注射器吸取一只小鼠所需的药液体积，并安装一根27号针头。在固定器内放入适量纸巾，以减少小鼠活动空间但保留足够呼吸空间，然后将小鼠放入带有通气孔的合适固定器中。使用红外灯加热小鼠尾巴30至60秒，同时密切观察是否出现过热迹象，例如尾巴快速摆动或其他躁动表现。

然后用酒精棉片清洁尾部。将针头几乎水平地插入尾部基部附近的两条侧尾静脉之一。如果插入成功，可能会有少量血液回流到针头的锥形部分。

在8到10秒内将总体积注入尾静脉。注射后，立即从固定器中取出小鼠。用无菌纱布按压注射伤口至少30秒，或直至出血停止。

成功的水动力尾静脉注射对于转染至关重要，尤其依赖于注射速度、体积和时间。为使静脉注射更顺利，需确保小鼠在注射当天未处于应激或脱水状态。在恢复笼中单独饲养30至60分钟后，将小鼠转移回其原始笼中。

在尾静脉注射后10至15天启动Cre重组酶的诱导，以确保未整合的载体被清除。将10毫克他莫昔芬溶解于40微升乙醇中，于55摄氏度孵育10分钟并震荡。期间涡旋数次，直至他莫昔芬完全溶解。

然后加入 960 µL 玉米油，在 55 °C 下孵育 5 分钟。冷却后，用带有 20 号针头的 1 mL 胰岛素注射器吸取溶液，随后更换为 27 号针头。

注射时，首先用拇指和第二根手指轻轻抓住小鼠颈部皮肤使其背颈部固定，并将尾巴固定在手掌根部与第四、第五根手指之间。随后，将0.1毫升溶液注射至小鼠腹部左下象限的腹腔内。对于持续时间少于十天的实验，需通过饮水方式持续给予多西环素，具体方案如下。

首先，将5克蔗糖溶解于100毫升自来水中，并进行高压灭菌。然后，在15毫升锥形管中，将100毫克盐酸多西环素溶解于5毫升蔗糖溶液中。接着，使用10毫升注射器通过0.2微米滤膜对溶液进行无菌过滤。

然后将过滤后的多西环素溶液加入剩余的95毫升蔗糖溶液中，并将该溶液代替饮用水供给小鼠。每天检查，如果溶液变浑浊则立即更换，因为浑浊表明有细菌过度生长。用1毫升4%多聚甲醛溶液准备一支1毫升注射器，配27号针头。

使用解剖剪和解剖镊对安乐死小鼠进行正中腹切开术，暴露肝脏。将小肠移至右侧，以暴露门静脉和下腔静脉。将已准备好的注射器针头插入下腔静脉，并剪开门静脉。

缓慢注入一毫升 PFA 以灌注肝组织，去除自发荧光的红细胞。取出肝脏后，用水冲洗，并转移至 5 到 10 毫升的 4% PFA 溶液中进行后固定，再进行切片。将一种转座子构建体注射到 Cre 报告小鼠体内，该构建体结合了可诱导 Cre 重组酶的组成型表达以及目的转基因或 shRNA 的可诱导表达，在他莫昔芬诱导激活 Cre 重组酶后，可观察到 GFP 报告基因的强烈表达。

经多西环素处理后，可通过特异性抗体在转染的肝细胞中观察诱导型转基因的表达。对于可诱导的shRNA表达，可通过免疫染色检测到的细胞质内GFP表达作为shRNA表达的替代标志物。注射了携带由肝特异性启动子调控的荧光素酶表达盒的转座子构建体。

注射荧光素后，小鼠在水动力尾静脉注射两周后使用活体成像系统进行成像。成像结果显示，在注射后15天，肝脏中可观察到强烈且稳定的荧光素酶生物发光信号，表明该系统可通过生物发光成像成功用于在活体内追踪转染细胞的存在。一旦掌握操作技巧，水动力尾静脉注射可在约15分钟内完成，而从克隆构建、小鼠注射、诱导转基因R shRNA表达到肝脏组织制备的整个实验流程则大约需要三至四周时间。

在进行该实验操作时，需始终注意质粒的大小及其序列的完整性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将pTC Tet系统与您选定的靶向R基因的shRNA转基因结合，应用于任何Crelux Pbase小鼠模型中。