Name: 血管动力尾静脉注射对小鼠肝细胞基因的本构和诱导系统的修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习利用血管动力尾静脉注射技术在小鼠肝细胞中实现稳定转染，结合可诱导基因或shRNA表达系统。该方法适用于研究肝癌机制与肝脏再生，为基因功能研究提供可靠工具。

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本工作由德国 Deutsche Krebshilfe（资助号 111289，授予 UE）和 Lucile Packard 儿童健康基金会（Ernest 和 Amelia Gallo 赠款资助的博士后奖学金——CTSA 资助号 UL1 RR025744，授予 UE）提供支持。我们感谢 Mark A. Kay 博士提供的载体构建和实验建议，以及 Julien Sage 博士提供的小鼠资源和实验支持。

所有动物实验均按照《实验动物照护与使用指南》进行，并已获得相关监管机构的批准（德国慕尼黑上巴伐利亚政府和美国加利福尼亚州斯坦福大学动物照护与使用委员会）。所有用于克隆的质粒列表（步骤1至4）见补充表S1。
1. 组成型基因表达转基因的克隆
<ol>
	<li>设计用于转基因扩增的引物13,14。</li>
	<li>在正向引物的5'端添加PacI（TTAATTAA）限制性酶切位点。在反向引物的5'端添加AscI（GGCGCGCC）或FseI（GGCCGGCC）限制性酶切位点。</li>
	<li>采用针对目标转基因优化的条件进行PCR扩增14。使用市售的DNA纯化试剂盒进行纯化。 
	注意：退火时间取决于步骤1.1中设计的引物，延伸时间取决于构建片段的长度。例如，对于长度为1,000 bp的构建片段，延伸时间应为60秒。</li>
	<li>将转基因片段和用于组成型基因表达的载体15用相应的限制性内切酶（见步骤1.2）及缓冲液在总体积50 µL中于37 °C过夜消化。例如，若适用，可使用5单位PacI和5单位FseI消化构建片段（见步骤1.2）。</li>
	<li>使用市售凝胶回收试剂盒，按照制造商说明对酶切后的载体&#160;和插入片段进行凝胶纯化。将&#160;100 ng载体与&#160;100–1,000 ng插入片段在14 °C下用400 U T4连接酶连接16小时，进行标准连接反应。在65 °C加热10分钟以灭活酶活性。</li>
	<li>采用标准热激法将连接产物转化至感受态细菌16。</li>
	<li>接种于含有100 µg/mL氨苄青霉素的琼脂平板上，于30 °C培养24小时。</li>
	<li>挑取单克隆&#160;，按照制造商说明使用市售质粒小提试剂盒提取质粒DNA，并通过Sanger测序17验证序列（测序引物：5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3'）。</li>
	<li>将测序正确的克隆用于质粒DNA的大规模扩增，并按照制造商说明使用无内毒素质粒制备试剂盒18进行纯化。</li>
	<li>构建完成后可进行显微注射，因此继续进行步骤5。</li>
</ol>
2. 用于诱导型基因表达的转基因克隆
<ol>
	<li>设计用于转基因扩增的引物13,14。</li>
	<li>在正向引物的5'端添加SacI（GAGCTC）、SpeI（ACTAGT）或KpnI（GGTACC）的限制性酶切位点。在反向引物的5'端添加NotI（GCGGCCGC）或XhoI（CTCGAG）的限制性酶切位点。</li>
	<li>采用针对目标转基因优化的条件，通过PCR扩增转基因14。使用商品化的DNA纯化试剂盒进行纯化。</li>
	<li>将纯化后的转基因片段与4 µg的入门载体（pEN_TTmcs-Vector，参见材料表）19分别在50 µL总体积中，使用适当的限制性内切酶（见步骤2.2）和缓冲液，在37 °C下过夜消化。</li>
	<li>使用商品化凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书对酶切后的载体和插入片段进行凝胶纯化。使用400 U T4 DNA连接酶，在14 °C下连接16小时，进行标准连接反应（100 ng载体与100–1,000 ng插入片段）。随后在65 °C加热10分钟以灭活酶活性。</li>
	<li>采用标准热激法将连接产物转化至感受态细菌中16。</li>
	<li>涂布于含有15 µg/mL庆大霉素的琼脂平板上，37 °C培养16小时。</li>
	<li>挑取单克隆菌落，提取质粒DNA，并使用pCEP正向引物（5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'）测序验证插入片段17。 
	注意：可直接对单菌落进行PCR检测，无需预先提取DNA，使用pCEP正向引物和pCEP反向引物（5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'）。此步骤可用于阳性克隆的初步筛选。</li>
	<li>继续进行第4步。</li>
</ol>
3. 用于可诱导基因敲低的 miR-shRNA 克隆
<ol>
	<li>根据 pSLIK 克隆方案19设计 miR-shRNA 寡核苷酸&#160;。退火并纯化寡核苷酸，用 ddH2O 按 1 : 20 稀释。</li>
	<li>在 50 °C 条件下，用 5 U BfuAI 消化 3 µg 入门载体 3 h，然后在 65 °C 灭活反应 20 min。 
	注意：若需共表达绿色荧光蛋白（GFP），请使用 pEN_TTGmiRc19 作为入门载体；否则使用 pEN_TTmiRc219。</li>
	<li>参照步骤 2.5 对消化后的载体进行凝胶纯化。在室温下，使用 400 U T4 连接酶将 100 ng 载体与 1 µL 纯化稀释后的 shRNA 寡核苷酸（步骤 3.1）进行标准连接反应 1 h。在 65 °C 热灭活 10 min。</li>
	<li>采用标准热激法转化感受态细菌16。</li>
	<li>涂布于含 15 µg/mL 庆大霉素的琼脂平板上。在 37 °C 培养 16 h。</li>
	<li>挑取单菌落，提取质粒 DNA，并通过 Sanger 测序17验证插入片段（测序引物：5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3'）。</li>
	<li>进入步骤 4。</li>
</ol>
4. 重组克隆以生成可用于注射的克隆
<ol>
	<li>取150 ng的入门载体（来自步骤2或步骤3）和150 ng的pTC TET载体20，混合。</li>
	<li>加入TE缓冲液至总体积为8 µL（pH=8）。</li>
	<li>将LR-clonase酶混合液II（见材料表）置于冰上，孵育2分钟，涡旋振荡两次。</li>
	<li>向反应体系中加入2 µL的LR-clonase酶混合液II，在25 °C下孵育1小时。</li>
	<li>加入1 µL蛋白酶K溶液终止反应，在37 °C下孵育10分钟。</li>
	<li>取2 µL重组克隆混合物，按照标准热激转化程序转化Stbl3感受态细菌16。</li>
	<li>涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的琼脂平板上，在30 °C下培养24小时。</li>
	<li>挑取单克隆菌落，按照生产商说明书使用无内毒素质粒提取试剂盒18纯化质粒DNA，并通过Sanger测序17验证载体完整性（测序引物序列为5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3'）。</li>
	<li>构建完成后可用于注射，继续进行步骤5。</li>
</ol>
5. 准备水动力尾静脉注射溶液
注意：组成型和诱导型基因表达载体的构建方法见步骤1、2、3和4。
<ol>
	<li>准备无菌的0.9%注射用生理盐水（不要使用PBS）。使用体积约为小鼠体重10%的生理盐水。示例：对于体重20 g的小鼠，准备2 mL溶液。</li>
	<li>准备使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化的注射载体18（分别参见步骤1.8或4.8）。</li>
	<li>每毫升无菌生理盐水中加入10 µg或15 µg无内毒素的sleeping beauty载体构建体（来自步骤1的使用10 µg，来自步骤4的使用15 µg）以及1 µg无内毒素的pc-HSB521。</li>
	<li>溶液可在4 °C保存最多4小时。切勿冷冻。</li>
</ol>
6. 进行水动力尾静脉注射
<ol>
	<li>使用尾静脉注射固定器（ commercially available 或用带有透气孔和尾部穿出孔的 50 mL 锥形管自制）。在管底部填充纸巾。</li>
	<li>用于注射的小鼠应为约 8–10 周龄，体重为 20–25 g。</li>
	<li>注射前称量小鼠体重，并根据体重准备注射体积（相当于体重的 10%，见步骤 5.1）。准备一支无菌的 3 mL 注射器，配备 27 G 针头，吸入所需体积的液体。</li>
	<li>将小鼠放入固定器中。调整纸巾的用量（见步骤 6.1），使小鼠活动空间最小化，但仍有足够空间呼吸。</li>
	<li>确保小鼠呼吸规律。</li>
	<li>使用红外灯加热尾部 30–60 秒。密切观察是否出现过热迹象。</li>
	<li>用酒精棉片清洁尾部。</li>
	<li>将针头几乎水平地插入尾部两侧静脉之一，靠近尾根部。 
	注意：若进针成功，可能会有少量血液回流至针头前端。不建议主动回抽，因为针头的额外移动可能导致其移位和/或损伤静脉。</li>
	<li>在 8–10 秒内将全部液体注入尾静脉。</li>
	<li>立即从固定器中取出小鼠。按压注射部位至少 30 秒，或直至出血停止。</li>
	<li>将小鼠放入单独的笼子中。待小鼠从操作中恢复（约 30–60 分钟）后，将其移回原笼。在接下来的 24 小时内定期检查小鼠状态。 
	注意：注射后通常可观察到小鼠轻度镇静，持续时间可达 2 小时。</li>
	<li>在进行后续实验（i.e.，步骤 7）之前，需等待 10–15 天以清除未整合的载体。</li>
</ol>
7. 使用他莫昔芬诱导转染的 CreER
警告：他莫昔芬有害，可能致癌或损害生育能力。请参阅安全数据表。
<ol>
	<li>计划在连续三天内进行腹腔注射他莫昔芬。</li>
	<li>第1天，将10 mg他莫昔芬溶解于40 µL乙醇中，在55 °C孵育10分钟，期间多次涡旋震荡，直至他莫昔芬完全溶解。</li>
	<li>加入960 µL玉米油，在55 °C孵育5分钟，多次涡旋震荡，获得澄清溶液。</li>
	<li>将溶液转移至带27 G针头的1 mL胰岛素注射器中备用。</li>
	<li>用拇指和第二指轻轻抓住小鼠颈部皮肤使其仰卧固定，同时将尾巴夹在手掌根部与第四、第五指之间。</li>
	<li>将0.1 mL（含1 mg他莫昔芬）溶液注射至小鼠腹部左下象限的腹腔内。</li>
	<li>在第2天和第3天重复上述注射操作。</li>
</ol>
8. 四环素依赖性基因或shRNA表达的诱导
警告：多西环素可能有害。请参阅安全数据表。
注意：&#160;根据实验类型和持续时间，多西环素可通过饮用水（步骤 8.1）或饲料（步骤 8.2）给予
<ol>
	<li>对于短期实验（&#60;10 天），通过饮水方式给予多西环素，具体方案如下。
	<ol>
		<li>将 5 g 蔗糖溶解于 100 mL 自来水中，高压灭菌。</li>
		<li>在 15 mL 圆锥管中，将 100 mg 盐酸多西环素溶解于 5 mL 蔗糖溶液（步骤 8.1.1）中。</li>
		<li>使用 10 mL 注射器，通过 0.2 µm 滤器无菌过滤该溶液，然后加入步骤 8.1.1 中配制的蔗糖溶液中。</li>
		<li>将多西环素-蔗糖溶液作为小鼠的饮用水提供。每日检查，若溶液变浑浊（提示细菌过度生长），则立即更换；即使溶液澄清，最迟也应在三天后更换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于长期实验（&#62;10 天）或对代谢变化敏感的实验，应使用市售的多西环素饲料（例如，含 0.625 g/kg 盐酸多西环素的饲料），以避免动物脱水和/或蔗糖引起的肝脏代谢改变。</li>
</ol>
9. 通过免疫染色分析小鼠肝脏的制备
警告：多聚甲醛可能有害。请参阅安全数据表。
注意：分析小鼠的时间点取决于具体实验。建议在给予多西环素处理至少三天后分析肝脏组织，以确保外源基因或shRNA表达得到充分诱导。
<ol>
	<li>用1 mL注射器配27 G针头，吸取1 mL 4%多聚甲醛溶液（PFA）。</li>
	<li>根据批准的动物实验方案，采用适当的方法处死小鼠。 
	注意：不同机构对安乐死方法的指导原则可能有所不同。</li>
	<li>使用解剖剪和解剖镊，通过正中腹切口小心打开腹腔，暴露肝脏。将小肠移向右侧，以暴露门静脉和下腔静脉（IVC）。</li>
	<li>将准备好的注射器针头（见步骤9.1）插入下腔静脉，并剪开门静脉。缓慢向下腔静脉注入1 mL PFA，以灌注肝脏组织并清除自发荧光的红细胞（若后续进行免疫荧光染色，则此步骤尤为必要）。</li>
	<li>取出肝脏，用水冲洗后转移至5–10 mL 4% PFA溶液中。</li>
	<li>如制备石蜡切片，组织固定36–48 h。此后组织可进行脱水及石蜡包埋。</li>
	<li>如制备冰冻切片，用4% PFA固定组织1 h。
	<ol>
		<li>为进行冷冻保护，将组织转移至10%蔗糖溶液中，孵育60 min。</li>
		<li>转移至20%蔗糖溶液中，孵育60 min。</li>
		<li>转移至30%蔗糖溶液中，孵育12–16 h。随后将组织包埋于冰冻切片包埋剂中，并在-20 °C下冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Watcharanurak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immunological+balance+by+sustained+interferon-gamma+gene+transfer+for+acute+phase+of+atopic+dermatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice.</a> Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

通过水动力尾静脉注射法转染肝细胞自15年前首次报道以来，已成为一种成熟的技术6。注射体积超过心脏输出量，液体从下腔静脉流入肝脏的肝窦7，从而实现约10%-20%的肝细胞转染，某些情况下可高达40%25,26。转染成功的关键预测因素是单位时间内注射的体积22,23。因此，转染效率较低（图1A，左图）通常是因为在操作过程中未能维持恒定的注射速度所致7。然而，即使采用最佳技术，水动力尾静脉注射（HTVI）所能达到的转染效率仍低于腺病毒或腺相关病毒介导的病毒感染，后者转染率几乎可达100%5,27。为确保尾静脉注射成功，关...

慢性肝病在全球范围内构成了重大的健康负担1动物研究模型是肝脏疾病研究中的重要工具，有助于解答肝再生、肝炎症、脂肪变性以及肝癌等复杂问题。2大量此类动物模型依赖于肝细胞的遗传修饰，因此，能够有效调控肝细胞基因表达的工具具有重要意义。3已有的方法，如培育基因工程小鼠品系或制备用于肝细胞感染的病毒载体，要么耗时较长，要么存在安全顾虑，或在肝细胞中导致外源基因表达水平较低 体内4,5. 水动力尾静脉注射（HTVI）是一种替代方法 体内 转染肝细胞，从而简便、快速且经济高效地研究肝脏中基因功能。对于水动力尾静脉注射（HTVI），将携带目的DNA序列的载体溶解于生理盐水中，溶液体积相当于被注射动物体重的10%。随后在5–10秒内将溶液注入尾静脉。6超过心输出量后，生理盐水从下腔静脉流入肝静脉，导致肝脏扩张及肝细胞的流体动力学转染7为了实现稳定的基因组整合，该方法已与基于转座子的载体（如）相结合 睡美人-转座子系统。该系统通过转座酶介导靶向载体与基因组重组位点之间的重组反应， 睡美人-转座酶8,9对于肝纤维化或癌变模型，通常需要在疾病模型的特定时间点过表达或沉默基因。为此，可使用可诱导的基因表达工具，例如 Cre/LoxP 系统或四环素诱导型基因表达系统（Tet-On）。10.
此处，我们描述了一种实验方案 体内 通过HTVI转染小鼠肝细胞 睡美人 基于转座子的系统。除了提供一种在肝特异性启动子控制下实现外源基因稳定、组成型表达的方案外，我们还描述了一种更先进的载体系统，该系统结合了组成型他莫昔芬依赖性Cre重组酶（CreER）的表达与外源基因或经微小RNA修饰的短发夹RNA（miR-shRNA）的可诱导表达，称为pTC TET系统。11在此载体系统中，用于四环素依赖性表达的可诱导转基因或miR-shRNA通过重组克隆系统插入到骨架载体中，可快速、简便地构建新型载体。12本视频指南涵盖了用于实现可诱导性转基因/miR-shRNA表达的载体构建、小鼠注射与处理方法，以及最终用于分析的肝组织制备。本方案所述方法旨在将任意基于Cre/loxP的小鼠系统与任意目的基因的表达或敲低相结合，因此在肝脏疾病研究中具有广泛的应用价值。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;通用材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>#SM1331</td><td>电泳用DNA分子量标准</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>冷冻切片包埋剂</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-蔗糖</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td>用于多西环素溶液的甜味剂</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td>用于筛选氨苄青霉素抗性克隆</td></tr><tr><td>LB琼脂（Luria/Miller）</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤（Luria/Miller）</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. 培养基</td><td>Thermo Fischer</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>AppliChem</td><td>A1492,0001</td><td>用于筛选庆大霉素抗性克隆</td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4 %</td><td>Fa. Roth</td><td>P087.6</td><td>甲醛溶液</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>GatewayTM LR ClonaseTM II 酶混合物</td><td>invitrogen/ThermoFisher</td><td>11791-020</td><td>包含LR克隆酶混合物II和蛋白酶K</td></tr><tr><td>DB3.1 感受态细胞</td><td>Thermo Fisher</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 化学感受态大肠杆菌</td><td>Thermo Fisher</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;限制性内切酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>FseI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0588S</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>BfuAI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0701S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>用于从凝胶中提取DNA</td></tr><tr><td>NucleoSpin 凝胶和PCR产物纯化试剂盒</td><td>Macherey &amp;amp; Nagel</td><td>740609.10</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC20</td><td>Macherey &amp;amp; Nagel</td><td>740571</td><td>质粒提取（小提）</td></tr><tr><td>NucleoBond PC500</td><td>Macherey &amp;amp; Nagel</td><td>740574</td><td>质粒提取（大提）</td></tr><tr><td>Phusion 高保真DNA聚合酶</td><td>Thermo Fisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠实验材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt 注射器 F 1 ml</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td>用于腹腔注射</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td>用于静脉注射</td></tr><tr><td>Sterican 套管针 24G</td><td>Braun</td><td>4657675</td><td></td></tr><tr><td>Sterican 套管针 27G</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>用于激活CreER</td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>他莫昔芬注射的载体</td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>AppliChem</td><td>A2951,0025</td><td>激活四环素依赖性表达</td></tr><tr><td>Injekt 10 ml 注射器</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td>用于多西环素溶液的过滤</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>Braun</td><td>3200905</td><td>静脉注射用载体</td></tr><tr><td>Falcon 圆底离心管 50ml</td><td>Corning Life Science</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>红外灯</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于加热小鼠尾巴</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>活体成像系统</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于HTVI的睡美人转座子载体克隆的质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTC</td><td></td><td>n/a</td><td>用于组成型基因表达的载体，参考文献15</td></tr><tr><td>pEN_TTmcs</td><td></td><td>Addgene #25755</td><td>用于诱导型基因表达的入门载体，参考文献19</td></tr><tr><td>pEN_TTGmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25753</td><td>用于诱导型miR-shRNA表达并共表达GFP的入门载体，参考文献19</td></tr><tr><td>pEN_TTmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25752</td><td>用于诱导型miR-shRNA表达但不共表达GFP的入门载体，参考文献19</td></tr><tr><td>pTC ApoE-Tet</td><td></td><td>Addgene #85578</td><td>使用ApoE.HCR.hAAT启动子进行诱导型基因或miR-shRNA表达的表达载体，参考文献11</td></tr><tr><td>pTC-CMV-Tet</td><td></td><td>Addgene #85577</td><td>使用CMV启动子进行诱导型基因或miR-shRNA表达的表达载体，参考文献11</td></tr></tbody></table>

组成型与诱导型基因表达系统 体内 通过水动力尾静脉注射法修饰小鼠肝细胞

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

在肝癌、再生、炎症和纤维化研究模型中，灵活的系统用于 体内 基因表达与基因沉默具有重要的应用价值。通过尾静脉水动力注射基于转座子的构建体，是实现成年小鼠肝细胞遗传操作的一种高效方法。除了可用于组成型外源基因表达外，该系统还可应用于更复杂的实验设计，例如利用shRNA介导的基因敲低、CRISPR/Cas9系统的引入以诱导基因突变，或使用可诱导表达系统。本文以组成型表达CreER与可诱导表达特定外源基因或miR-shRNA的组合为例，介绍该技术的应用。我们详细阐述从构建体准备开始的多步骤操作流程 睡美人转座子构建体，到小鼠的显微注射与处理，以及通过免疫染色分析肝脏组织的制备。该系统是一种可靠且高效的肝细胞遗传操作方法，特别适用于与基于Cre/loxP的小鼠品系联合使用，可广泛应用于肝脏疾病研究的多种模型。

通过水动力尾静脉注射实现的转染效率：单次注射后小鼠肝细胞通过水动力方法实现转染的比例具有可变性，取决于多种参数，如注射体积、注射时间、注入DNA的量以及注入载体的大小6,22,23。此外，在体型较大的动物中，转染效率通常较低，这是由于血管直径较大以及肝窦面积较大，导致整体压力下降。为可视化转染效率，在携带 Rosa26mTmG 报告基因的小鼠中进行了CreER转座子构建体的高压尾静脉注射（HTVI），随后通过他莫昔芬激活CreER构建体。由于技术原因导致的注射体积过小或注射时间过长，会降低转染效率，整个肝脏中仅能检测到少量转染的肝细胞；而优化的注射条件则可实现更高的转染效率，如CreER转座子HTVI后通过报告基因染色所示（图1A）。为评估转染效率，强烈推...

基于转座子的整合载体经水动力尾静脉注射可实现小鼠肝细胞的稳定转染 体内 本文介绍了一种用于转染系统的实用方案，可实现单个转基因在肝脏中的长期组成型表达，或转基因与miR-shRNA在肝脏中的组成型与多西环素诱导型联合表达。

在肝癌、肝再生、炎症和纤维化研究模型中，体内基因表达与沉默的灵活系统具有重要意义……

本方法的总体目标是通过可诱导的基因或shRNA表达载体构建，在体内实现肝细胞的稳定转染。该方法有助于解答肝脏研究领域中的关键问题，例如可用于研究肝癌发生及肝脏再生的机制。该技术的主要优势在于通过水动力尾静脉注射，在活体小鼠肝细胞中实现CreER与可诱导的R shRNA转基因的联合表达。本实验操作将由本实验室的医学生Eric Hubner进行演示。首先，将含有靶向蛋白短发夹RNA的150纳克入门载体与150纳克pTC Tet载体及TE缓冲液混合，总体积为8微升。然后将LR克隆酶混合液II转移至冰上，孵育2分钟，孵育期间涡旋振荡两次。随后向反应体系中加入2 µL的LR克隆酶混合液II，并在25 °C下孵育1小时。孵育结束后，加入一微升蛋白酶K溶液以终止反应。然后在37摄氏度下孵育十分钟。接下来，取两微升连接混合物，采用标准热激方法转化Stbl3感受态细菌。将转化产物接种于含有氨苄青霉素的琼脂平板后，在30摄氏度下培养24小时。次日，挑取单菌落并接种至少量细菌培养基中，过夜培养。在提取DNA并经Sanger测序确认载体完整性后，制备该重组质粒的大规模DNA样品用于显微注射。首先称量小鼠的体重。然后配制无内毒素的无菌生理盐水溶液，其中包含每毫升15微克的无内毒素Sleeping Beauty载体构建物和每毫升1微克的无内毒素pchsB5。配制的溶液总量应足以按照每只小鼠体重的10%的体积进行注射。用无菌的3毫升注射器吸取一只小鼠所需的药液体积，并安装一根27号针头。在固定器内放入适量纸巾，以减少小鼠活动空间但保留足够呼吸空间，然后将小鼠放入带有通气孔的合适固定器中。使用红外灯加热小鼠尾巴30至60秒，同时密切观察是否出现过热迹象，例如尾巴快速摆动或其他躁动表现。然后用酒精棉片清洁尾部。将针头几乎水平地插入尾部基部附近的两条侧尾静脉之一。如果插入成功，可能会有少量血液回流到针头的锥形部分。在8到10秒内将总体积注入尾静脉。注射后，立即从固定器中取出小鼠。用无菌纱布按压注射伤口至少30秒，或直至出血停止。成功的水动力尾静脉注射对于转染至关重要，尤其依赖于注射速度、体积和时间。为使静脉注射更顺利，需确保小鼠在注射当天未处于应激或脱水状态。在恢复笼中单独饲养30至60分钟后，将小鼠转移回其原始笼中。在尾静脉注射后10至15天启动Cre重组酶的诱导，以确保未整合的载体被清除。将10毫克他莫昔芬溶解于40微升乙醇中，于55摄氏度孵育10分钟并震荡。期间涡旋数次，直至他莫昔芬完全溶解。然后加入 960 µL 玉米油，在 55 °C 下孵育 5 分钟。冷却后，用带有 20 号针头的 1 mL 胰岛素注射器吸取溶液，随后更换为 27 号针头。注射时，首先用拇指和第二根手指轻轻抓住小鼠颈部皮肤使其背颈部固定，并将尾巴固定在手掌根部与第四、第五根手指之间。随后，将0.1毫升溶液注射至小鼠

constitutive-inducible-systems-for-genetic-vivo-modification-mouse

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

血管动力尾静脉注射对小鼠肝细胞基因的本构和诱导系统的修饰

本视频介绍了一种在小鼠模型中通过腹腔注射他莫昔芬，利用他莫昔芬诱导型Cre重组酶系统实现目的基因敲除的实验方法。...

基于CreER-LoxP系统的靶基因失活：一种在小鼠模型中实现靶基因敲除的他莫昔芬诱导型Cre重组酶系统

本视频展示了在小鼠模型中使用四环素（Tet-On）基因表达系统。在多西环素（一种四环素衍生物）存在的情况下，Tet-On...

基于可诱导 Tet-On 调控系统的体内基因表达：小鼠模型中四环素诱导的目标基因转录激活系统

本视频介绍了通过水动力尾静脉注射法对小鼠肝细胞进行体内遗传转染的技术。该转染系统可在肝细胞中实现外源基因的长期表达。...

水动力基因递送：一种技术方法 体内 通过尾静脉注射将外源DNA转染入小鼠肝细胞

通过水动力基因递送法对裸DNA进行体内转染，可将基因导入动物组织，且引发的炎症反应极小。该方法能够产生足量的基因产物，从而可用于分析基因功能与调控机制，以及蛋白质结构与功能。...

通过水动力基因递送在小鼠中瞬时表达蛋白质

本文介绍了一种新型的人源化小鼠肝脏模型，该模型通过将未成熟且具有扩增能力的人类肝干细胞移植到白蛋白-毒素受体介导的细胞敲除（TRECK）/SCID小鼠体内而建立。...

利用人肝干细胞构建人源化小鼠肝脏

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统为基因工程提供了有力工具，并实现了外源基因的靶向整合。本文描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的高效DNA靶向整合策略 体内...

CRISPR/Cas9介导的靶向整合 体内 使用基于同源介导末端连接的策略

本文介绍了一种在小鼠中实现心脏特异性基因操作的实验方案。在麻醉条件下，通过第四肋间切口将小鼠心脏暴露于体外，随后使用注射器将编码特定基因的腺病毒注入心肌组织，接着通过蛋白质表达检测方法进行分析。 体内...

一种简单高效的方法 体内 小鼠心肌内注射实现心脏特异性基因操作

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞来源的肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型的实验方案。该模型是测试高胆固醇血症新疗法的重要工具。...

利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。...

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

本方案描述了从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，并通过电穿孔将CRISPR-Cas9以核糖核蛋白复合物和mRNA形式导入细胞，以破坏与遗传性肝代谢疾病相关的治疗靶基因的技术。所述方法在电穿孔后可实现高细胞存活率和高效的基因修饰水平。...

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

本方案描述了显微注射及 体内...

利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

学习利用血管动力尾静脉注射技术在小鼠肝细胞中实现稳定转染，结合可诱导基因或shRNA表达系统。该方法适用于研究肝癌机制与肝脏再生，为基因功能研究提供可靠工具。

组成型与诱导型基因表达系统体内通过水动力尾静脉注射法修饰小鼠肝细胞

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组成型与诱导型基因表达系统 体内 通过水动力尾静脉注射法修饰小鼠肝细胞

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