γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

γ-H2AX 和 53BP1 免疫荧光显微技术的总体目标是分析各种组织中 DNA 双链断裂的形成与修复过程。该方法有助于解答癌症研究中的关键问题，例如肿瘤细胞中遗传不稳定性是如何产生的。该技术的主要优势在于能够可视化单个 DNA 双链断裂，并可对修复过程进行分析。

本实验操作将由本实验室技术员 Susanne Brendel 进行示范。开始实验前需先配制溶液，首先配制抗凝剂储备液，即每毫升含 200 国际单位肝素的 0.9% 氯化钠溶液。在采集血液或骨髓样本前，向每支收集管中加入 2 毫升抗凝剂储备液。

接下来，配制用于裂解红细胞的10倍浓度裂解液：将82.91克氯化铵、7.91克碳酸氢铵以及2毫升0.5摩尔的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液加入双蒸水中溶解，并调节pH至8.0，定容至总体积1升。然后，在微量离心管中，向360毫克多聚甲醛（PFA）中加入8.3微升1摩尔的氢氧化钾溶液，配制固定液。用磷酸盐缓冲液（PBS）将管内液体补至1毫升刻度线处，并将该管置于95摄氏度的加热块中加热，得到1毫升浓度为36%的PFA溶液。

将1 mL的36% PFA溶液转移至15 mL离心管中，加入8 mL PBS，配制成9 mL的4% PFA储存液。将4% PFA储存液分装后于-18 °C保存，用于后续细胞固定。

接下来，通过将50微升Octoxynol 9加入50毫升PBS中，配制通透化溶液，得到浓度约为0.1%的Octoxynol 9溶液。最后，通过将蛋白封闭剂与PBS混合，分别配制5%和2%的封闭溶液。为准备血液或骨髓样本，请取出装有2毫升抗凝剂储备液的试管。

在无菌条件下，通过静脉穿刺或骨髓穿刺，每管采集七毫升血液或骨髓样本。将样本在室温下保存过夜。过夜保存后，用 PBS 将肝素抗凝的血液样本按 1:1 比例稀释，将肝素抗凝的骨髓样本按 1:3 比例用 PBS 稀释。

轻轻吹打细胞，用移液器吸取并推出两次。接下来，向新试管中加入等体积的密度梯度介质。将稀释后的血液或骨髓样品轻轻铺加在密度梯度介质上方，注意避免混合两层液体。

将离心管在室温下以400 × g离心30分钟。用移液器吸取上层血浆层。然后，小心收集密度梯度介质上方的单个核细胞层。将单个核细胞转移至新的离心管中，并加入至少三倍体积的PBS。

轻轻吹打细胞悬液，使用移液器吹吸两次。离心管。离心后，弃去上清液。

加入10毫升4°C的1×红细胞裂解液。用移液器轻柔吹打混悬细胞两次，然后将离心管置于冰上5分钟。随后，加入30毫升4°C的磷酸盐缓冲液（PBS），并离心离心管。

使用CD34微珠和细胞分离柱分离CD34阳性细胞。通过离心各1 × 10⁵个细胞，制备两份患者样本的单个核细胞涂片。用200 µL 4%多聚甲醛固定细胞10分钟。

固定后，在摇床中用 30 毫升 PBS 轻柔洗涤细胞三次，每次 5 分钟。然后，用 200 微升 0.1% Octoxynol 9 对细胞进行通透处理，持续 10 分钟。接着，在摇床中用 30 毫升 5% 封闭液轻柔洗涤细胞三次，每次 5 分钟。

用30毫升新鲜的5%封闭液封闭细胞，孵育1小时。使用含0.1%辛基酚聚氧乙烯醚-9的4%多聚甲醛对细胞进行固定和通透处理，可清晰保留γ-H2AX和53BP1焦点结构。将其中一份细胞样品与小鼠单克隆抗-γ-H2AX抗体在4°C下孵育过夜，另一份细胞样品则同时与小鼠单克隆抗-γ-H2AX抗体和兔多克隆抗-53BP1抗体在4°C下孵育过夜。

强烈推荐使用经过验证的抗γ-H2AX和抗53BP1抗体。孵育后，在实验室摇床上用30毫升2%封闭液轻柔洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤三次。接着，将细胞的第一步处理样品与Alexa 488标记的山羊抗小鼠二抗在2%封闭液中按1:500稀释后进行孵育。

将细胞的第二份样品与Alexa 488标记的山羊抗小鼠二抗和Alexa 555标记的驴抗兔二抗共同孵育，两种二抗均用2%封闭液按1:500稀释。在摇床平台上用30毫升PBS轻柔洗涤细胞3次。吸除PBS，用封片剂封片。

小心地将盖玻片盖在封片剂上，避免产生气泡。封片剂需至少静置三小时使其完全固化，然后通过荧光显微镜观察细胞。最后，使用配备 DAPI、Alexa 488 和 Cy3 滤光片的荧光显微镜，在 100 倍物镜放大倍数下分析细胞核内的 γ-H2AX 和 53BP1 焦点。

在G0/G1期和G2期，细胞中的γ-H2AX焦点表现为清晰的荧光点，如本成纤维细胞代表性图像所示，此时对γ-H2AX焦点的分析最为准确。相比之下，在S期由于DNA复制过程导致γ-H2AX在细胞核内广泛弥散分布，形成弥散性的全核γ-H2AX斑点，使得γ-H2AX焦点的分析变得复杂。通过γ-H2AX免疫荧光染色可定量检测照射组织中的DNA双链断裂，并已阐明照射后淋巴细胞中γ-H2AX焦点的水平与辐射剂量呈正比关系。

急性髓系白血病患者CD34阳性细胞中γ-H2AX与53BP1焦点的共定位，提示在DNA双链断裂位点处53BP1介导的非同源末端连接修复机制被激活。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展γ-H2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测，以分析DNA双链断裂情况。在完成该实验步骤后，还可对肿瘤细胞进行其他检测方法，例如免疫印迹法检测磷酸化ATM、ATR、检查点激酶1（checkpoint kinase one）、检查点激酶2（checkpoint kinase two）以及TP53，以进一步分析DNA损伤应答通路的改变。