Name: 用 3 d-印刷模具制作细胞播种和组织环自组装用的自定义琼脂糖井 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习使用3D打印模具制作自定义琼脂糖井，用于细胞播种和组织环自组装。该方法可制备不同尺寸的三维组织环，适用于评估组织结构、力学性能及功能，为组织工程研究提供简便灵活的技术平台。

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我们衷心感谢 Erica Stults 博士（学术研究 &amp;感谢WPI信息技术服务部应用科学家（#38; Application Scientist, WPI Information Technology Services）在3D打印方面的协助，感谢Amanda Zoë Reidinger博士、Chris Nycz和Karen Levi（M.E.）在模具设计方面的建议，感谢Kathy Suqui和Jennifer Mann在测试模具设计方面的帮助，以及Michael O’Keefe在拍摄方面的协助。&#160; 本研究由以下项目资助：NSF IGERT DGE 1144804（MWR, HAS）、NIH R15 HL097332（MWR, TAH）、NSF REU EEC0754996（BA）、NIH 1R01 EB023907（MWR, HAS）和 NIH R15 HL137197（MWR, HAS）。
<div></div>

1. 准备3D打印模具
<ol>
	<li>根据所需尺寸准备模具的 CAD 图纸。</li>
	<li>将 CAD 文件发送至高分辨率 3D 打印机，选择具有光泽表面的合适塑料打印材料。</li>
	<li>打印完成后，用洗涤剂和水彻底清洗模具。</li>
</ol>
2. 浇铸PDMS负模
<ol>
	<li>在天平上称取所需量的PDMS基底材料。对于直径为60 mm、井柱高度为2 mm的模具，使用25 g。</li>
	<li>按1:10（w/w）的比例将固化剂加入PDMS基底材料中。</li>
	<li>充分搅拌，直至两种组分完全混合均匀。混合不充分可能导致PDMS固化不完全，从而产生&#34;发黏&#34;的表面。</li>
	<li>在3D打印模具边缘贴上一圈实验室胶带，以便在打印出的微井上方形成一层PDMS基底层。</li>
	<li>将PDMS混合物倒入模具中，并将模具放入真空室中脱气，直至所有气泡完全排出。</li>
	<li>在50 °C下固化2–4小时，或直至PDMS完全固化到可以取出的程度。</li>
	<li>移除实验室胶带，并小心取出PDMS负模。</li>
	<li>将PDMS负模从3D打印模具中取出后，在60 °C下额外孵育1小时，以确保其完全固化。</li>
	<li>用洗涤剂和水彻底清洗PDMS，以去除任何残留物。清洗不充分可能导致PDMS负模在初次使用时无法形成良好的环状结构。</li>
</ol>
3. 制备琼脂糖小孔
<ol>
	<li>在接种细胞前一天制备琼脂糖小孔。</li>
	<li>用DMEM配制2% (w/v)的琼脂糖溶液，并进行高压灭菌。</li>
	<li>将4 mL熔融琼脂糖移入已灭菌的PDMS阴模中，然后直接将琼脂糖注入PDMS阴模的柱状结构内。使用移液枪头去除所有气泡，因为气泡可能导致小孔尺寸不均一。</li>
	<li>注意：不要过度填充模具；琼脂糖的上表面必须保持平整，以确保将琼脂糖小孔从PDMS模具中取出并放入6孔培养板时保持水平。剩余的琼脂糖可重新高压灭菌后再次使用，但不宜超过一次。</li>
	<li>待琼脂糖冷却后（4 mL琼脂糖约需10分钟；较大的模具可能需要更长的冷却时间），用钝头镊子小心地将琼脂糖小孔从PDMS阴模上分离，并转移至6孔板的一个孔中。</li>
	<li>将琼脂糖小孔完全浸没于完全培养基中，并在使用前于37 °C培养箱中平衡过夜。</li>
</ol>
4. 接种组织环
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养大鼠主动脉平滑肌细胞21（RaSMCs），直至细胞融合度达到70%。 
	注意：细胞应在37 °C、5% CO2条件下，于15 cm组织培养皿中进行培养。</li>
	<li>待模具平衡后（第3节），准备接种RaSMCs细胞。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿，每皿5 mL，清洗两次。</li>
	<li>每15 cm培养皿中加入3 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，将培养皿放入37 °C培养箱中孵育2–3分钟，或直至细胞从皿底脱落。</li>
	<li>用等体积（每皿3 mL）的完全培养基中和胰蛋白酶，并充分重悬细胞以打散细胞团块。</li>
	<li>取部分细胞悬液与台盼蓝染液按1:1比例稀释，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将全部细胞悬液在200 × g条件下离心5分钟，以沉淀细胞。</li>
	<li>将细胞重悬至浓度为1000万个细胞/mL，即每50 µL含50万个细胞。 
	注意：不同类型的细胞可能需要不同的细胞浓度。</li>
	<li>吸除琼脂糖模具中的全部培养基。注意彻底清除各个孔内的培养基，但避免刺穿孔底。</li>
	<li>用移液器向每个孔中加入50 µL细胞悬液。</li>
	<li>小心地在琼脂糖模具外围加入2 mL新鲜培养基，注意避免培养基溢入琼脂糖模具的孔中。将培养皿放入培养箱中过夜（约16小时）。</li>
	<li>过夜培养后，吸除模具外围的培养基，向6孔板的每个孔&#160;中加入4.5 mL新鲜培养基，确保模具和环状结构完全浸没。每天更换培养基。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种多功能方法，利用3D打印技术快速制备可自组装且尺寸易于定制的组织环。该方法与Svoronos et al.6 报道的方法类似，均使用3D打印的蜂窝状和哑铃形蜡模来浇铸PDMS阴模。然而，本研究对模具进行了改进，增加了若干独特设计特征。缺口结构（图4A(1)）可为模具提供方向标识，使每个组织环能够被单独标记和追踪。中心孔（图4A(2)）有助于培养基更好地扩散至孔内。CAD文件编号直接打印在模具上，因此每个PDMS阴模均标有版本号和柱体直径（图4A3）。锥形外壁（图3(1)，5 °）、孔槽顶部的倾斜面（图3(2)，45 °）以及中心孔（图3(3)，5 °）的设计，使得PDMS阴模更易从3D打印模具中脱模，同时琼脂糖凝胶孔也更易从PDMS阴模中取出（图4A(2), A(4)）。
我们已通过构建多种直径和细胞类型的自组装环状组织，展示了该系统的多功能性，所用细胞包括原代人平滑肌细胞（SMCs）18,22、大鼠主动脉SMCs7,23、人骨髓间充质干细胞（hMSCs）13，以及由诱导性多能干细胞（iPSCs）分化的SMCs11（表1）。在目前正在进行的研究中，我们正在评估由其他类型细胞（如内皮细胞）形成环状结构的能力，并尝试融合不同尺寸的软骨环，以探索其在气管替代治疗中的潜在应用。除了完全由细胞构成的结构外，我们还利用该系统制备了含有交联明胶微球的环状组织13,22。微球可在组织环自组装过程中被包埋，以提供额外的机械强度，或实现生长因子的局部递送13,22。
在制备组织环时，不同细胞类型可能需要优化细胞数量。最低细胞数量可能因细胞的大小和类型而异。例如，来源于iPSC的hSMCs以每环600,000个细胞接种11，hMSCs和原代hSMCs以每环400,000个细胞接种13,22，而大鼠主动脉SMCs则以每环500,000个细胞接种18。槽的尺寸也可能影响组织环的形成以及形成环所需的最低细胞数量24。在使用人源细胞和3D打印模具的研究中，采用2 mm的槽宽。原始的聚碳酸酯模具槽宽为3.75 mm，需750,000个hSMCs才能形成2 mm的细胞环18。通过减小槽宽，我们将每环形成组织环所需的细胞数量减少了46%，降至每环400,000个细胞25。每环接种的细胞数量总结于表1中。
在选择3D打印材料时，需要考虑多种因素。由于PDMS通常在60 °C下固化，因此3D打印材料必须具有足够高的熔点，以避免在PDMS固化过程中受损。本研究中所用材料（一种专有材料，参见材料表）的熔点尚未公开。然而，当该材料在60 °C下烘烤1小时时，我们观察到其开始产生气味。因此，我们决定将固化温度降低至50 °C，并延长固化时间，以便在不损坏3D打印材料的前提下完成PDMS的固化。如果对模具进行修改以制备更大的PDMS阴模，则可能需要调整固化时间。在从3D打印模具中取出PDMS后，再进行一段60 °C的额外固化，可防止最终的PDMS阴模表面发黏，同时限制3D打印模具所承受的温度。需要注意的是，某些材料会抑制PDMS的固化，因此应确保所选材料与PDMS相容。此外，还必须考虑模具材料的毒性问题。尽管3D打印模具不会直接接触细胞，但在固化过程中仍有可能将少量残留物转移到PDMS阴模上。我们发现，使用洗涤剂进行非常彻底的清洗足以去除PDMS阴模上的任何残留物。然而，我们此前曾观察到，若清洗不充分，在PDMS阴模最初几次使用时，琼脂糖孔中的环状结构形成效果较差。使用其他3D打印材料制备的PDMS复制件可能需要进一步研究，以验证洗涤剂是否足以去除模具残留物，包括任何潜在的浸出物。此外，可能还需要定期检测，因为即使在50 °C条件下反复加热，也可能随时间推移对模具造成损伤，导致多次使用后残留物增加。迄今为止，我们已使用同一个3D打印模具制备了超过30个PDMS阴模，均成功用于组织环的生成。
总体而言，与聚碳酸酯的机械加工相比，3D打印在制备琼脂糖模具方面具有更高的灵活性。其分辨率高于传统加工工艺，且模具设计不受可用工具尺寸的限制。这使得模具可实现更高的定制化，并可添加如锥度等机械加工难以实现的结构特征。该系统也可用于制备除环状结构以外其他形状的自组装组织6,17。利用环状结构制备方法，我们已开发出多种细胞类型和尺寸的组织环，可用于气管组织工程13、人工血管构建7以及血管疾病建模11等潜在应用。

利用细胞自组装方法构建组织工程血管是基于支架方法的一种替代策略。与基于支架的组织相比，自组装、无支架的组织可能具有更高的细胞密度、更丰富的基质沉积和更强的力学性能，以及更优的生物学功能1,2,3,4。然而，在不使用外源性支架支撑的情况下，形成具有特定尺寸和形状的三维组织仍是一项挑战。一些方法通过将多层细胞片层融合来构建更厚的组织结构，但该过程可能耗时且劳动强度大5。另一种方法是将细胞接种到非黏附性模具中，使其自发聚集形成球状体、环状结构或其他组织形态6,7,8。
与较大的管状工程化组织相比，自组装组织环所需的细胞数量更少、培养时间更短、试剂用量更少，但仍可进行力学测试、组织学检查，或用于收缩性及其他功能测试7,9,10,11。由于组织环可快速制备且易于测试，因此非常适合用于高通量筛选大量培养参数，并有望作为疾病模型11或药物筛选工具12。此外，组织环还可融合形成更复杂的组织结构，如血管或气管7,13，且与其他形状（如类球体）相比，组织环的融合可能更为完全14,15。
琼脂糖由于具有良好的生物相容性、通透性以及非细胞黏附特性，被广泛用作自组装组织的模具材料。例如，Norotte 等通过挤出棒材制备琼脂糖模具，但该方法对模具形状的控制有限，且需要专用设备15。Tan 等则以海藻酸盐液滴作为构建单元，制备出多种形状（如金字塔形、方形）的定制水凝胶模具16。然而，海藻酸盐球体的直径较大（300 µm），导致所形成的结构分辨率较低。这种低分辨率可能导致模具表面不平整，从而对细胞聚集的一致性产生不利影响。另一种方法是将琼脂糖浇铸到聚合物阴模中，以制造具有光滑特征结构和特定尺寸的非黏附性模具6,7,17。
我们此前报道了一种利用在铣削聚碳酸酯模具中制备的PDMS负模来制备定制环形琼脂糖细胞接种孔的系统7,18。将琼脂糖倒入PDMS负模中并使其凝固7,18。随后将细胞接种至琼脂糖孔中，细胞在不到24小时内聚集形成自组装、无支架的组织环7,18。PDMS负模可高压灭菌，可重复使用多次，且质地柔软、具有弹性，便于取出凝固的琼脂糖孔。该系统最初在Gwyther et al.7中报道时，PDMS负模由铣削聚碳酸酯模具铸造而成（图1A）。琼脂糖成型后，细胞接种孔被逐个切割下来并放入12孔板的孔中7,18。最近对该设计进行了改进，使单个琼脂糖模具可生成5个环，并适配于6孔板的孔，从而无需切割单个孔，同时减少了每个环所需的PDMS和琼脂糖用量（图1B）。采用更窄的细胞接种槽宽度以减少实现环形结构所需的接种细胞数量。尽管如此，模具的分辨率和定制能力仍受限于标准立铣刀尺寸的可获得性，且微铣削成本可能过高。此外，由于需要预约使用高负荷的定制设备、需额外使用计算机辅助制造（CAM）软件将计算机辅助设计（CAD）文件转换为可编程刀具路径，以及在加工过程中需可靠固定聚碳酸酯部件，计算机数控（CNC）加工可能耗时且繁琐。
在本研究中，我们探讨了使用3D打印技术作为数控加工（CNC machining）的替代方法。3D打印已广泛应用于定制化植入物的工程制造、支架材料的制备，以及细胞和组织类球体的直接打印15,19,20。我们采用了一台高分辨率3D打印机以及专用的3D打印材料，从而能够打印出具有光滑、光亮表面的刚性模具（见材料表）。该技术可实现高度可定制、高分辨率的塑料模具的制备，可用于浇铸PDMS阴模和琼脂糖微孔。设计迭代过程总结于图1中。在3D打印模具版本中，进一步修改了模具设计，增加了锥形外壁和中心孔，以便于将PDMS阴模从3D打印模具中取出，以及将琼脂糖微孔从PDMS阴模中脱模。这些锥形结构无法通过标准的机械加工工艺实现。在本次迭代中，还增加了微孔底部至模具底部的距离，从而在柱体下方形成更厚的琼脂糖基底，以降低琼脂糖微孔取出过程中柱体断裂的风险。模具和环状结构的制备流程在图2中以示意图形式展示。

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50040</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>道康宁</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>康宁 Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>VeroWhite</td><td>StrataSys</td><td>RGD835</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印机</td><td>StrataSys</td><td>Objet 260 Connex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>康宁 Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>康宁 Cellgro</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>康宁 Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>康宁 Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>康宁 Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>康宁 Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>康宁 Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>康宁</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>WKY 3M-22 大鼠主动脉平滑肌细胞</td><td>由 T. Wight 提供 [参考文献 21]</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

使用3d打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

工程化组织已开始应用于临床组织修复与替代，并正在被开发为药物筛选和人类疾病建模的工具。与基于支架的组织工程技术相比，自组装组织具有优势，例如增强的基质沉积、更高的强度和更好的功能。然而，目前可用于在无支撑支架表面或内部接种细胞来构建三维组织的方法仍十分有限。此前，我们开发了一种通过将细胞接种到非黏附性琼脂糖孔中以构建自组装组织环的系统。该方法首先在加工成型的聚碳酸酯模具中浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）阴模，然后在PDMS阴模中凝胶化琼脂糖，从而形成环形细胞接种孔。然而，该方法的通用性受限于加工聚碳酸酯模具所用设备的分辨率。在此，我们证明3D打印塑料可作为加工聚碳酸酯的替代方案，用于制备PDMS阴模。3D打印模具及改进后的模具设计使用更简便、生产成本更低，且每个细胞接种孔所需的琼脂糖和PDMS显著减少。我们已证实，由此制得的琼脂糖孔可用于多种不同类型细胞来源的、具有定制直径的自组装组织环的构建。这些组织环可进一步用于力学、功能学和组织学分析，或用于构建更大、更复杂的管状组织。

该系统可实现琼脂糖细胞接种孔的简易定制化制备，从而支持细胞自组装形成环状三维工程组织。与加工聚碳酸酯相比，3D打印在模具设计上具有更高的分辨率和更大的灵活性，后者因受限于可用刀具尺寸而存在尺寸限制。使用高分辨率3D打印机，可打印出薄至0.254 mm的壁结构，槽体尺寸仅受限于打印机的分辨率（本研究中为15.2 µm分辨率）。通常，商业上无法获得小于0.3 mm的CNC端铣刀，因此无法加工出更窄的槽。虽然微铣削可实现更小的结构特征，但所需设备可能过于昂贵或难以被多数生物医学研究实验室获取。此外，槽的尺寸和曲率还受限于端铣刀刀头的形状。同时，无法实现倾斜或锥形壁等结构特征，且在加工过程中微小结构可能发生断裂。
CAD图纸可轻松修改，以制备具有可定制尺寸的3D打印模具和PDMS负模。图3展示了我们当前2 mm柱状结构的3D打印模具的尺寸，并与之前的设计版本进行了比较。该方法成本低廉；一个2 mm、5环结构的3D打印模具的打印成本为44.67美元，且每个部件可用于制备多个PDMS负模。迄今为止，我们已使用单个3D打印模具制备了超过30个PDMS负模。每个PDMS负模需要25 g PDMS，单价为每克0.11美元（即每个PDMS负模2.75美元）。每个PDMS负模均可使用洗涤剂清洗、高压灭菌，并可重复使用数年，具体取决于使用频率。与原始设计18相比，这种紧凑型3D打印模具在每个2 mm组织环中所使用的PDMS和琼脂糖显著减少（图1E）。
在已平衡的琼脂糖小孔中接种的细胞在不到24小时内聚集形成组织环。组织环的尺寸取决于琼脂糖小孔的尺寸。本研究中，我们展示了可利用直径为2、4或12 mm柱体的小孔制备自组装的大鼠平滑肌细胞环（图4）。尽管本研究中的组织环仅培养了3天，但我们此前已将人平滑肌细胞（hSMC）环培养长达2周22，并将人骨髓间充质干细胞-软骨环（hMSC-软骨环）培养长达3周13。如先前报道，这些组织环可作为三维体外（in vitro）人类组织模型，用于组织功能的定量评估11和力学强度分析13,22，也可作为模块化构建单元用于生成管状组织结构7,13。由这些细胞类型构建的组织环的细胞接种条件及其功能特性总结于表1中。
<img alt="多孔板制备装置；聚碳酸酯、3D打印、聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具；材料清单、规格格式" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：聚碳酸酯模具设计。 最初，采用聚碳酸酯加工制成15孔模具A）。后续版本采用了更紧凑的设计（B），设计为5个孔位于一个聚碳酸酯模具内，并适配6孔板中的一个孔。在此，我们对该设计进行了改进，采用3D打印塑料作为比机械加工聚碳酸酯更可定制的替代方案（C）。如（D) 是由初始设计制成的琼脂糖小孔18 （左）与当前的紧凑设计（右）相比，后者所需琼脂糖显著减少，且无需手动分离加样孔。每种设计迭代所需的聚二甲基硅氧烷（PDMS）和琼脂糖用量如图（E）。中心柱直径为 2 mm。模具在（A）为 6 cm × 12 cm，（B) 直径为 5 cm，且 (C) 直径为6 cm。（比例尺在(D) = 3 cm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="琼脂糖凝胶孔及自组装环状结构制备示意图；三维模具、PDMS 阴模、细胞接种。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：自组装组织环的制备。 使用 3D 打印模具浇铸 PDMS 阴模，再利用该阴模制备琼脂糖凝胶孔（A）。随后将细胞直接接种至琼脂糖凝胶孔中，细胞在不到 24 小时内聚集并形成组织环（B）。图（B）中的虚线表示凝胶孔的轮廓。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微孔板模具示意图；标注尺寸 A-F；包含3D打印与聚碳酸酯两种形式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：3D打印模具的CAD截面图。 图中显示了槽口宽度（A）、槽口高度（B）、中心孔（C）、总直径（D）、外缘（E）和外壁高度（F）的尺寸。外壁（1）、孔的上部（2）以及中心孔（3）均设计为锥形（1和3的锥角为5°，2为45°），以利于PDMS阴模的脱模。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于PDMS浇铸、琼脂糖孔和PBS环的3D打印模具示意图。显微镜实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：CAD设计图及其对应的PDMS负模和自组装SMC环，柱体直径分别为2（A）、4（B）和12（C）mm。 在（A）中，（1）表示用于定位的凹槽，（2）表示用于改善灌注的中心孔，（3）为文件编号，可直接压印在PDMS负模上，（4）表示外壁，呈锥形设计以便于取出PDMS负模。琼脂糖孔中的比例尺 = 1 cm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞类型</td>
			<td>每环接种的细胞数</td>
			<td>环直径</td>
			<td>培养时间</td>
			<td>进行的功能分析</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>大鼠 SMC</td>
			<td>0.5、1 或 3 × 106</td>
			<td>2、4 或 12 mm</td>
			<td>3 天</td>
			<td>本研究；不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC 来源的 SMC11</td>
			<td>0.6 × 106</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 天</td>
			<td>收缩性测试、单轴拉伸试验、组织学分析</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人源 SMC22</td>
			<td>0.4 × 106</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2、7 或 14 天</td>
			<td>单轴拉伸试验、组织学分析</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人源 MSC14</td>
			<td>0.4 × 106</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 天</td>
			<td>单轴拉伸试验、组织学分析、环融合与管状压缩测试、向软骨组织分化</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：使用不同类型细胞制备环状结构所需的细胞数量。

本方案描述了一种利用定制的3D打印塑料模具制备不同尺寸自组装组织环的平台。将PDMS倒入3D打印模具中固化形成阴模，然后将琼脂糖注入固化的PDMS阴模中成型。将细胞接种至所得的琼脂糖孔中，细胞在其中聚集形成组织环。

使用3D打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

工程化组织已开始应用于临床组织修复与替代，并正在被开发为药物筛选和人类疾病研究的工具……

本实验的总体目标是制备可定制的细胞接种模具，用于构建不同尺寸的自组装组织环。该方法可利用人类细胞生成三维组织环，用于评估组织的结构、强度和功能。该技术的主要优势在于，它是一种制备具有自定义尺寸的自组装组织模具的简便方法。开始实验前，使用计算机辅助设计软件绘制所需尺寸的模具图纸。将CAD文件发送至高分辨率3D打印机，用具有光洁表面且在50摄氏度下保持稳定的塑料材料打印模具。用刷子、洗涤剂和水彻底清洗打印好的模具。用蒸馏水冲洗模具，并将其置于支架上自然晾干。选择一种在PDMS固化温度下稳定的3D打印塑料非常重要。在加热过程中转移到聚二甲基硅氧烷（PDMS）上的残留物可能会影响环的形成。接下来，用一次性称量舟称取25克PDMS基础剂。按重量比1:10加入固化剂，并充分搅拌，直至基础剂与固化剂完全混合。然后，用实验室胶带围绕模具边缘固定，形成一个围绕印有孔穴面、高度约为一厘米的围挡。确保胶带围挡无任何缝隙。将PDMS混合物倒入3D打印的模具中。将PDMS置于真空室中脱气30至60分钟，直至无气泡残留。在50摄氏度下固化PDMS两至四小时，直至PDMS充分固化并可从模具中取出。然后移除胶带，小心地将PDMS负模从模具上分离。将PDMS阴模置于60摄氏度的烘箱中孵育1小时，以确保其完全固化。然后用洗涤剂和水彻底清洗阴模，再用蒸馏水冲洗模具，并使其自然风干。在制备琼脂糖模具之前，对PDMS阴模、一对钝头镊子以及任何其他所需工具进行高压灭菌。开始制备时，配制至少50毫升含2%琼脂糖的DMEM培养基，并进行高压灭菌。应在环形接种前一天制备琼脂糖孔。用移液器将四毫升熔融琼脂糖加入已灭菌的PDMS阴模中，注意不要过度填充模具。然后，将熔融琼脂糖加入用于琼脂糖井柱的空腔中。使用移液器吸头去除所有气泡。最终的琼脂糖表面必须平整。让琼脂糖冷却约10分钟。然后，使用钝头镊子小心地将冷却的琼脂糖模具从PDMS负模上分离。将模具正面朝上放置于六孔板的一个孔中。向孔板的孔内加入适量的完全培养基，使琼脂糖孔完全浸没。使用前在37摄氏度下平衡琼脂糖孔过夜。首先，在一个15厘米的培养皿中，将大鼠主动脉平滑肌细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的环境中培养，直至达到70%的汇合度。待所需的琼脂糖模具制备完成并在过夜平衡后，用5毫升磷酸盐缓冲液冲洗培养皿两次。移除PBS后，向培养皿中加入3毫升0.25%的tripzin。在37摄氏度孵育两到三分钟，或直至细胞从培养皿上脱落。用三毫升完全培养基中和胰蛋白酶。将细胞转移至锥形管中，并轻轻吹打，直至细胞充分重悬。取细胞悬液一份，加入等体积的台盼蓝染液稀释，用血细胞计数板计数细胞。然后以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于完全培养基中，调整细胞浓度至每毫升1000万个细胞。确保环状结构形成一致性的最关键步骤是优化所用细胞系的细胞数量和培养基。接下来，获取已平衡的琼脂糖孔。小心吸除琼脂糖周围以及琼脂糖孔内的所有培养基，注意不要刺破孔的底部。将50微升细胞悬液移液至每个孔中。在琼脂糖小孔外周加入2毫升新鲜培养基，注意避免培养基流入小孔内。将培养板置于37摄氏度、5% CO2气氛中孵育过夜，以使细胞聚集。然后，吸除琼脂糖外部的培养基。向孔板中加入 4.5 毫升新鲜培养基，使琼脂糖孔完全充满，并确保整个琼脂糖模具完全浸没在培养基中。继续培养孔板直至组织环充分发育，每天更换一次培养基。然后，使用镊子轻轻地将每个组织环从支柱上滑下。立即对组织环进行固定以用于组织学分析，或直接用于功能或机械性能评估。3D 打印技术使得模具设计更加灵活。通过改变柱状结构的直径，可轻松制备不同直径的组织环，例如围绕直径为2、4和12毫米的柱体所构建的大鼠平滑肌细胞环。此外，还利用原代人平滑肌细胞、人骨髓间充质干细胞以及由诱导性多能干细胞分化而来的平滑肌细胞成功制备了组织环。这些组织环被用作体外组织模型，用于评估组织功能与机械强度。尽管该方法最初旨在制造和模拟血管组织，但也可用于制造其他类型组织的片段，例如软骨、骨骼肌和心肌组织。该方法为研究人员提供了一种简便的方式，以创建定制模具来制造具有不同尺寸的三维组织环。这些组织环可用于评估由不同类型细胞构建的工程化组织的结构、力学性能和功能。

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科研

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Bioengineering

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