用 3 d-印刷模具制作细胞播种和组织环自组装用的自定义琼脂糖井

该程序的总体目标是创建用于制造各种尺寸的自组装组织环的定制细胞接种模具。这种方法使我们能够从人体细胞中创建三维组织环，可用于评估组织结构、强度和功能。这种技术的主要优点是它是一种简单的方法，可用于制造具有自定义尺寸的自组装生活用纸的模具。

要开始该过程，请使用计算机辅助设计软件创建所需尺寸的模具图纸。将 CAD 文件发送到高分辨率 3D 打印机。使用在 50 摄氏度下稳定的光泽表面的塑料打印模具。

用刷子、清洁剂和水彻底清洗打印的模具。用蒸馏水冲洗模具，然后在架子上风干。选择在 PDMS 固化温度下稳定的 3D 打印塑料非常重要。

加热过程中转移到 PDMS 上的残留物可能会影响环的形成。接下来，在一次性称重船中测量 25 克 PDMS 碱基。按重量比 1：10 的比例添加固化剂，并剧烈搅拌，直到基料和固化剂充分混合。

然后，将实验室胶带固定在模具的侧面，以在带有打印孔的表面周围形成一堵约 1 厘米高的壁。确保磁带壁上没有缝隙。将 PDMS 混合物倒入 3D 打印模具中。

在真空室中对 PDMS 进行脱气 30 到 60 分钟，或直到没有气泡残留。在 50 摄氏度下固化 PDMS 2 到 4 小时，或直到 PDMS 足够坚固，可以从模具中取出。然后，撕下胶带，小心地将 PDMS 底片与模具分开。

将 PDMS 阴性试剂放入 60 摄氏度的烘箱中孵育 1 小时，以确保其完全固化。然后，用清洁剂和水彻底清洗底片。用蒸馏水冲洗模具并风干。

在制造琼脂糖模具之前，对 PDMS 负片、一对钝镊子和任何其他所需工具进行高压灭菌。要开始制备，请在 DMEM 中制备并高压灭菌至少 50 毫升 2% 的琼脂糖。在环播种前一天准备琼脂糖孔。

将 4 毫升熔融琼脂糖移液到高压灭菌的 PDMS 负片中，注意不要将模具装得太满。然后，将熔融的琼脂糖移液到琼脂糖孔柱的腔中。使用移液器吸头去除所有气泡。

最终的琼脂糖表面必须是平坦的。让琼脂糖冷却约 10 分钟。然后，使用钝镊子小心地将冷却的琼脂糖模具与 PDMS 负片分开。

将模具正面朝上放入六孔板的一个孔中。向板孔中加入适当的完全培养基，使琼脂糖孔完全浸没。使用前将琼脂糖孔在 37 摄氏度下平衡过夜。

首先，在 15 厘米的培养皿中，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳气氛中培养大鼠主动脉平滑肌细胞，直到达到 70% 汇合。制备所需的琼脂糖霉菌并在夜间平衡后，用 5 毫升磷酸盐缓冲盐水冲洗培养皿两次。去除 PBS 后，向培养皿中加入 3 毫升 0.25% 的 tripzin。

在 37 摄氏度下孵育 2 到 3 分钟，或直到细胞从培养皿中升起。用 3 毫升完全培养基中和 tripzin。将细胞转移到锥形管中，轻轻移液细胞直至完全重悬。

用等体积的台盼蓝染料稀释等分的细胞悬液，并用血细胞计数器计数细胞。然后，将悬浮液以 200 倍 G 离心 5 分钟。去除上清液，将细胞重悬于完全培养基中，以达到每毫升 1000 万个细胞的浓度。

确保环形成一致的最重要步骤是优化您正在使用的细胞系的细胞数量和培养基。接下来，获得平衡的琼脂糖孔。小心地从琼脂糖外部和琼脂糖孔内吸出所有培养基，注意不要刺穿孔的底部。

50 μL 细胞悬液移液到每个孔中。在琼脂糖孔的外部加入 2 mL 新鲜培养基，不要让培养基溢出到孔中。将板在 37 摄氏度下在 5% CO2 气氛中孵育过夜，以使细胞聚集。

然后，从琼脂糖外部吸出培养基。向板孔中加入 4.5 毫升新鲜培养基，使琼脂糖孔充满，并将整个琼脂糖模具完全浸没。继续孵育板，直到组织环充分发育，每天更换培养基。

然后，使用镊子轻轻地将每个组织环从其柱子上滑出。立即固定环进行组织学检查，或使用环进行功能或机械评估。3D 打印允许更灵活的模具设计。

柱子直径很容易变化，如图所示，我的大鼠平滑肌细胞环围绕直径为 2 毫米、4 毫米和 12 毫米的柱子制造。还从原代人 SMC、人间充质干细胞和诱导多能干细胞来源的 SMC 制备了组织环。这些环被用作体外组织模型，用于评估组织功能和机械强度。

虽然这种方法最初是为了制造和建模血管组织而设计的，但它也可用于制造其他组织类型的节段，例如软骨、骨骼肌和心脏组织。这种方法为研究人员提供了一种简单的方法来创建自定义模具来制造不同尺寸的 3D 组织环。这些环可用于评估由不同细胞类型制成的工程组织的结构、机械性能和功能。