使用3D打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

本实验的总体目标是制备可定制的细胞接种模具，用于构建不同尺寸的自组装组织环。该方法可利用人类细胞生成三维组织环，用于评估组织的结构、强度和功能。该技术的主要优势在于，它是一种制备具有自定义尺寸的自组装组织模具的简便方法。

开始实验前，使用计算机辅助设计软件绘制所需尺寸的模具图纸。将CAD文件发送至高分辨率3D打印机，用具有光洁表面且在50摄氏度下保持稳定的塑料材料打印模具。

用刷子、洗涤剂和水彻底清洗打印好的模具。用蒸馏水冲洗模具，并将其置于支架上自然晾干。选择一种在PDMS固化温度下稳定的3D打印塑料非常重要。

在加热过程中转移到聚二甲基硅氧烷（PDMS）上的残留物可能会影响环的形成。接下来，用一次性称量舟称取25克PDMS基础剂。按重量比1:10加入固化剂，并充分搅拌，直至基础剂与固化剂完全混合。

然后，用实验室胶带围绕模具边缘固定，形成一个围绕印有孔穴面、高度约为一厘米的围挡。确保胶带围挡无任何缝隙。将PDMS混合物倒入3D打印的模具中。

将PDMS置于真空室中脱气30至60分钟，直至无气泡残留。在50摄氏度下固化PDMS两至四小时，直至PDMS充分固化并可从模具中取出。然后移除胶带，小心地将PDMS负模从模具上分离。

将PDMS阴模置于60摄氏度的烘箱中孵育1小时，以确保其完全固化。然后用洗涤剂和水彻底清洗阴模，再用蒸馏水冲洗模具，并使其自然风干。

在制备琼脂糖模具之前，对PDMS阴模、一对钝头镊子以及任何其他所需工具进行高压灭菌。开始制备时，配制至少50毫升含2%琼脂糖的DMEM培养基，并进行高压灭菌。应在环形接种前一天制备琼脂糖孔。

用移液器将四毫升熔融琼脂糖加入已灭菌的PDMS阴模中，注意不要过度填充模具。然后，将熔融琼脂糖加入用于琼脂糖井柱的空腔中。使用移液器吸头去除所有气泡。

最终的琼脂糖表面必须平整。让琼脂糖冷却约10分钟。然后，使用钝头镊子小心地将冷却的琼脂糖模具从PDMS负模上分离。

将模具正面朝上放置于六孔板的一个孔中。向孔板的孔内加入适量的完全培养基，使琼脂糖孔完全浸没。使用前在37摄氏度下平衡琼脂糖孔过夜。

首先，在一个15厘米的培养皿中，将大鼠主动脉平滑肌细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的环境中培养，直至达到70%的汇合度。待所需的琼脂糖模具制备完成并在过夜平衡后，用5毫升磷酸盐缓冲液冲洗培养皿两次。移除PBS后，向培养皿中加入3毫升0.25%的tripzin。

在37摄氏度孵育两到三分钟，或直至细胞从培养皿上脱落。用三毫升完全培养基中和胰蛋白酶。将细胞转移至锥形管中，并轻轻吹打，直至细胞充分重悬。

取细胞悬液一份，加入等体积的台盼蓝染液稀释，用血细胞计数板计数细胞。然后以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于完全培养基中，调整细胞浓度至每毫升1000万个细胞。

确保环状结构形成一致性的最关键步骤是优化所用细胞系的细胞数量和培养基。接下来，获取已平衡的琼脂糖孔。小心吸除琼脂糖周围以及琼脂糖孔内的所有培养基，注意不要刺破孔的底部。

将50微升细胞悬液移液至每个孔中。在琼脂糖小孔外周加入2毫升新鲜培养基，注意避免培养基流入小孔内。将培养板置于37摄氏度、5% CO2气氛中孵育过夜，以使细胞聚集。

然后，吸除琼脂糖外部的培养基。向孔板中加入 4.5 毫升新鲜培养基，使琼脂糖孔完全充满，并确保整个琼脂糖模具完全浸没在培养基中。继续培养孔板直至组织环充分发育，每天更换一次培养基。

然后，使用镊子轻轻地将每个组织环从支柱上滑下。立即对组织环进行固定以用于组织学分析，或直接用于功能或机械性能评估。3D 打印技术使得模具设计更加灵活。

通过改变柱状结构的直径，可轻松制备不同直径的组织环，例如围绕直径为2、4和12毫米的柱体所构建的大鼠平滑肌细胞环。此外，还利用原代人平滑肌细胞、人骨髓间充质干细胞以及由诱导性多能干细胞分化而来的平滑肌细胞成功制备了组织环。这些组织环被用作体外组织模型，用于评估组织功能与机械强度。

尽管该方法最初旨在制造和模拟血管组织，但也可用于制造其他类型组织的片段，例如软骨、骨骼肌和心肌组织。该方法为研究人员提供了一种简便的方式，以创建定制模具来制造具有不同尺寸的三维组织环。这些组织环可用于评估由不同类型细胞构建的工程化组织的结构、力学性能和功能。