Name: 吸收荧光、磁性纳米微粒测定昆虫的吸液能力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习利用荧光磁性纳米颗粒蔗糖溶液评估昆虫的吸液能力，以蓝瓶蝇为模型研究口器结构与取食效率的关系。该方法可测定昆虫从多孔表面摄取液体的生理参数，为昆虫取食机制研究提供有效手段。

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本研究工作由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号为 IOS 1354956。我们感谢佛罗里达大学佛罗里达自然历史博物馆麦克圭尔鳞翅目与生物多样性研究中心的 Andrew D. Warren 博士允许使用蝴蝶图像。

1. 昆虫种类、溶液制备及饲喂装置设置
注意：选择菜粉蝶（Pieris rapae L.，粉蝶科）作为鳞翅目的代表性物种，是因为其在先前关于液体摄取能力及口器形态的研究中已被广泛使用22,23。家蝇（Musca domestica L.，蝇科）和蓝瓶蝇（Calliphora vomitoria L.，丽蝇科）则因其常被观察到在多孔表面取食而被采用13。
<ol>
	<li>从昆虫供应商处订购P. rapae的幼虫，并在人工饲料（见材料表）上饲养，置于环境培养箱中，条件设置为23 °C、光周期18小时光照:6小时黑暗，直至其化蛹并羽化为成虫。订购M. domestica和C. vomitoria的蛹，在与P. rapae相同的环境条件下进行饲养。在取食实验前，成虫自蛹羽化后不再喂食。</li>
	<li>配制20%蔗糖溶液（对照）和20%含纳米颗粒的蔗糖溶液，用于检测液体摄取情况。通过将荧光磁性纳米颗粒（氧化铁，表面包被聚丙烯酸，直径约20 nm）24加入20%蔗糖溶液中（终浓度为1 mg/mL dH2O纳米颗粒与20%蔗糖溶液按1:1混合）来制备纳米颗粒溶液。配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）（将10× PBS用dH2O稀释至1×，pH 7.4），用于解剖操作。</li>
	<li>设置一个取食装置，包括带夹具的手动操作器和独立的取食平台（平坦的基座）（图1）。在取食平台上放置凹面载玻片，并在附近准备好孔径分别为11、20、30、41或60 µm的尼龙网滤膜，以及孔径为1、5、8或10 µm的膜滤器，用于后续取食实验。</li>
</ol>
2. 喂养方案
<ol>
	<li>将昆虫的身体、足和翅膀包裹在折叠的纸巾中，调整昆虫位置，使其头部和口器暴露在外。将昆虫的翅膀置于两片显微镜载玻片之间，并用操作器上的夹具固定载玻片，使昆虫悬置于 feeding stage 上方。图1).</li>
	<li>使用移液器将30 µL的20%蔗糖溶液或20%蔗糖纳米颗粒溶液滴加到凹面载玻片的中央。将一张特定孔径的滤纸置于凹面载玻片上，使滤纸中心与纳米颗粒溶液液滴对齐。液滴与滤纸接触后，溶液将沿滤纸扩散并填充滤纸孔隙（图1). 
	注意：将滤纸置于液滴上方，而非相反，以尽量减少昆虫取食区域滤纸表面可能存在的纳米颗粒。</li>
	<li>使用操纵器将昆虫定位，使其口器的远端区域仅能接触取食装置上湿润的滤纸图1用昆虫针将口器伸展到滤纸上，让昆虫取食45秒。</li>
	<li>为尽量减少昆虫取食滤纸表面可能存在的液膜，应将口器置于与载玻片平坦部分接触的滤纸区域上即，而不是载玻片凹陷部分的正上方）。如果昆虫没有表现出取食兴趣，可用昆虫针将口器固定在滤纸上，持续整个取食时间。</li>
</ol>
3. 解剖步骤
<ol>
	<li>将 PBS 溶液置于 50 mm 的表面皿中，确保溶液量足以覆盖昆虫身体。将表面皿置于体视显微镜下，并将昆虫解剖器械（弹簧式显微解剖剪、昆虫针、尖头解剖镊）放置在体视显微镜旁。</li>
	<li>饲喂后，将昆虫从滤纸上取出，闭合双翅并用手持住。使用弹簧式显微解剖剪去除昆虫的头部、足和翅膀，并将昆虫放入表面皿中的 PBS 溶液内（图 2）。</li>
	<li>如有需要，可在解剖前对昆虫进行麻醉。用镊子夹住昆虫腹部远端附近的体壁外骨骼。主手持弹簧式显微解剖剪，从腹部后端开始，沿腹部侧面朝前方向剪开外骨骼，直至到达胸部。操作时需特别注意仅剪开外骨骼，避免损伤昆虫体内的消化道（图 2）。</li>
	<li>继续使用解剖剪对外骨骼进行额外剪切，打开腹部以暴露内部的消化道（图 2）。借助昆虫针移除腹部外骨骼、脂肪体及其他组织，并将其移出表面皿以便后续处理，仅保留胸部和消化道在表面皿中。 
	注意：解剖后将暴露出嗉囊，该结构为囊状（消化道的延伸部分），位于胸部与腹部交界处附近。</li>
	<li>若嗉囊未暴露，可用剪刀对胸部进行额外切口，直至显露出嗉囊。一旦可见嗉囊，即剪除昆虫其余部分，仅在表面皿中保留带有嗉囊的消化道（图 2）。 
	注意：鳞翅目昆虫的嗉囊几乎透明，质地类似玻璃纸；若未充满液体或未扩张，或在解剖过程中被剪破，则可能难以辨认。</li>
	<li>使用尖头解剖镊将嗉囊转移至盖玻片（24 mm × 24 mm）上，用于后续成像（图 2）。</li>
</ol>
4. 摄入纳米颗粒的测定
<ol>
	<li>使用精细尖头解剖镊子小心地将嗉囊放置在盖玻片上，注意避免破损。在倒置共聚焦显微镜下使用CY3通道（或相差模式）以20倍放大倍数进行成像。解剖后应立即对嗉囊成像，以防其干燥。</li>
	<li>将一根磁力搅拌子（长度41.3 mm，直径8 mm）握在非操作显微镜载物台的手掌中。将磁力搅拌子在嗉囊附近来回摆动（距离嗉囊约10 mm），每次来回摆动持续约1秒（图2）。</li>
	<li>摆动磁力搅拌子的同时，观察嗉囊内纳米颗粒的存在情况。一边缓慢前后移动载物台，一边通过显微镜目镜观察近乎透明的嗉囊内部是否有纳米颗粒的运动。若嗉囊中存在纳米颗粒，表明已成功摄食，这些颗粒将随磁力搅拌子的摆动而同步波动（图2）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

昆虫口器功能的传统研究主要基于宏观形态学分析（例如，鳞翅目昆虫的喙被认为功能类似于吸管25,26）；然而，近年来结合实验证据的研究已促使人们对昆虫口器的复杂性及其结构-功能关系的理解发生了范式转变2,12,13,22,27。尽管现代成像技术（如扫描电子显微镜23、共聚焦显微镜22、显微计算机断层扫描（micro-CT）28以及激光消融断层成像（图3））为形态学的精细研究提供了可能，...

许多昆虫类群具有适应摄取液体食物的口器（喙），例如花蜜、腐烂果实、树液（例如 双翅目1、鳞翅目2、膜翅目3）、木质部汁液（半翅目4）、眼泪（鳞翅目5）以及血液（虱毛目6、蚤目7、双翅目7、半翅目8、鳞翅目9）。昆虫摄取液体的能力与生态系统健康（例如 传粉作用10）、疾病传播4,11、生物多样性形成2,12以及趋同进化研究13密切相关。尽管食物来源多种多样，某些液食性昆虫的共同特征是能够获取微量液体，这些液体可能局限于微米或纳米级液滴、液膜或孔隙表面。
鉴于吸食液体的昆虫种类繁多（占所有动物物种的20%以上14,15），且能够以多种食物来源为食，理解它们的取食行为和液体摄取机制在许多领域中具有重要意义。例如，昆虫口器的功能在仿生技术的发展中发挥了作用，如微流控装置，这类装置能够通过类似于昆虫摄食的方法实现微量液体的采集16。然而，研究液体摄取机制的一个基本问题在于，不仅需要了解昆虫如何摄取液体，还需获得支持该机制的实验证据。仅以行为（如使用喙器探触12,17）作为摄食的指标是不够的，因为这并不能确认液体是否成功被摄取，也无法确定液体在昆虫体内输送的路径。此外，在液体量较少的条件下开展实验更能模拟自然摄食情境，因为在自然界中液体资源通常是有限的2,12。
利用X射线相位衬度成像技术研究了君主斑蝶（Danaus plexippus L.）如何从多孔表面摄取少量液体12。君主斑蝶通过喙部表面角质突起（背侧 legulae）之间的间隙，利用毛细作用将局限于微小孔隙中的液体引入食物通道。进入的液体在食物通道壁上形成液膜，随后因Plateau不稳定性而增长并坍缩成液桥12,18，再由头部的吸泵作用将液桥输送至蝴蝶的消化道。尽管X射线相位衬度成像技术是观察昆虫体内液体流动的理想工具12,19,20,21，但该技术并不普及，因此亟需一种更为便捷的方法，以快速评估昆虫摄取和吞咽液体的能力。
确定进食机制是否 D. plexippus 适用于其他鳞翅目昆虫以及双翅目昆虫（这两类群均从多孔表面摄取液体），Lehnert 等13 应用了一种用于评估昆虫从多孔表面摄取少量液体能力的技术，该技术在此详细报道。尽管本文所述方案针对使用湿润多孔表面的研究，但该方法可经调整用于其他研究，例如涉及积液取食机制的研究。此外，该技术的应用还可拓展至微流控和仿生技术等其他领域。

<table><tbody><tr><td>20% 蔗糖溶液</td><td>Domino Sugar</td><td></td><td>用于与 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制蔗糖溶液的糖</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10X 浓缩液用 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释至 1X，用于昆虫解剖</td></tr><tr><td>单凹载玻片</td><td>AmScope</td><td>BS-C6</td><td>进食阶段设置所必需的载玻片</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>NY6004700 (60 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>NY4104700 (41 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>NY3004700 (30 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>NY2004700 (20 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700 (11 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>TCTP04700 (10 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>TETP04700 (8 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>TMTP04700 (5 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>EMD Millipore</td><td>RTTP04700 (1 &amp;micro;m)</td><td>需要尼龙网滤膜和 Isopore 滤膜以形成昆虫进食用的多孔表面</td></tr><tr><td>虹膜显微解剖剪</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>用于解剖的剪刀</td></tr><tr><td>昆虫针（#1）</td><td>Bioquip Products</td><td>1208B1</td><td>解剖和进食试验中使用的针</td></tr><tr><td>超细头解剖镊</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>624684</td><td>解剖器械</td></tr><tr><td>Leica M205 C 体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 C</td><td>用于解剖的体视显微镜</td></tr><tr><td>倒置共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>用于检测磁性纳米颗粒的荧光显微镜</td></tr><tr><td>Fisherbrand PTFE 一次性搅拌子</td><td>Fisherscientific</td><td>S68067</td><td>用于检测纳米颗粒的磁体</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>用于在进食试验中固定昆虫的纸巾</td></tr><tr><td>家蝇（Musca domestica）蛹</td><td>Mantisplace.com</td><td></td><td>实验用昆虫</td></tr><tr><td>蓝瓶蝇（Calliphora vomitoria）蛹</td><td>Mantisplace.com</td><td></td><td>实验用昆虫</td></tr><tr><td>菜粉蝶（Pieris rapae）幼虫</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>144102</td><td>实验用昆虫</td></tr><tr><td>Finnpipette F1&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4641080N</td><td>用于分配液体的微量移液器</td></tr><tr><td>Finntip 250 移液器吸头</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9400250</td><td>微量移液器吸头</td></tr><tr><td>显微镜玻璃盖玻片（=盖片）（24 x 24 mm）</td><td>AmScope</td><td>CS-S24-100</td><td>用于在共聚焦显微镜下观察昆虫嗉囊的盖玻片</td></tr></tbody></table>

荧光磁性纳米颗粒的摄取用于测定昆虫的液体吸收能力

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

吸食液体的昆虫会摄取多种液体，这些液体在环境中以液滴、液膜形式存在，或局限于微小孔隙中。研究液体摄取过程需要评估口器结构与功能之间的关系；然而，以往对液体摄取机制的推断主要基于结构形态的观察，有时缺乏实验验证。本文报道了一种利用少量液体评估蝴蝶（鳞翅目）和蝇类（双翅目）液体摄取能力的新方法。将昆虫喂食含有荧光磁性纳米颗粒的20%蔗糖溶液，溶液置于特定孔径的滤纸上。随后取出昆虫的嗉囊（用于储存液体的内部结构），置于共聚焦显微镜下观察。用磁铁在嗉囊附近移动，检测其中是否存在纳米颗粒，从而判断昆虫是否能够摄入液体。该方法揭示了一种在鳞翅目和双翅目昆虫从多孔表面取食时可能普遍存在的摄食机制（毛细作用和液桥形成）。此外，该方法还可用于研究多种吸液昆虫的取食机制，包括在疾病传播和仿生学中具有重要意义的种类，以及可能涉及纳米或微米级通道、需要验证液体运输过程的其他研究。

研究流体取食昆虫在取食能力上的模式差异，需要明确取食发生的时间。本文所述方案用于检验鳞翅目和双翅目昆虫中的限孔径假说13。限孔径假说认为，若孔隙的直径小于取食通道的直径，流体取食昆虫便无法从充满液体的孔隙中取食12。来自多孔表面的液体必须通过Plateau不稳定性18形成稳定的液桥，以克服将液体保留在孔隙中的毛细压力，并为吸泵作用提供可接触的液面。具有不同取食通道尺寸的昆虫（图3）预计在能够取食的最小孔径上存在差异。
每种生物的限制性孔径根据其个体在滤纸上摄食特定孔径时，有50%的受试个体能够摄食的能力来计算。13. 以20%蔗糖溶液（对照）饲喂的昆虫，其嗉囊中未发现纳米颗粒。解剖昆虫以检测纳米颗粒是否被...

吸液性昆虫能够从多孔表面获取微量液体。本实验方案描述了一种利用含荧光磁性纳米颗粒的喂养溶液，直接测定昆虫从多孔表面摄取液体能力的方法。

吸液性昆虫会摄取环境中以液滴、液膜或微小孔隙中液体形式存在的多种液体。关于液体……

本实验的总体目标是利用混合了荧光磁性纳米颗粒的蔗糖溶液，评估液态取食昆虫取食过程中各项生理参数。该方法有助于回答昆虫学领域的一些关键问题，例如昆虫口器结构与功能之间的关系以及昆虫的取食机制。该技术的主要优势在于，能够确定昆虫是否能够摄取以液滴形式或液膜形式存在的液体。本演示使用蓝瓶苍蝇，因为其液体摄取能力和口器形态已有充分记录。也可使用家蝇、菜粉蝶及其他以液体为食的昆虫。获取蝇蛹后，将其置于环境培养箱中，在每日18小时光照、23°C条件下培养。成虫从蛹中羽化后，在实验前不要喂食。实验用食物需配制含20%蔗糖溶液，并加入每毫升0.5毫克的纳米颗粒。然后，准备一个由操纵器、夹具和饲喂平台组成的饲喂装置。在饲喂阶段，使用凹面载玻片盛放食物。同时准备多种不同孔径的尼龙网滤膜和膜滤器，以覆盖凹面载玻片。首先将昆虫的身体、足和翅膀包裹在折叠的纸巾中。仅使头部和口器部分暴露。操作时，通过捏紧昆虫的翅膀使其固定。现在，将包裹在纸巾中的翅膀置于两片载玻片之间并固定。然后夹紧两张载玻片，并将夹子固定在操作器上。接着，使用操作器将昆虫固定在饲喂装置上方。随后，将30微升饲喂溶液滴加到凹面载玻片的中央，并用一片多孔滤纸覆盖溶液。液滴会沿着滤纸扩散并填充其孔隙。接下来，将昆虫放置在适当位置，使其口器远端能够接触到湿润的滤纸，且仅能接触到载玻片的平坦部分，无法从凹面区域取食。此时，使用昆虫针将昆虫口器伸展至滤纸上，让昆虫取食45秒。如果昆虫没有表现出取食兴趣，使用解剖针将口器保持在滤纸上持续45秒以完成取食。至此，取食程序结束。进行解剖时，向一个50毫升的培养皿中加入足量的PBS，以浸没昆虫身体。将此装置与所有解剖工具一同置于显微镜下。现在，从滤纸上取下昆虫，保持其翅膀闭合。然后，使用弹簧显微解剖剪去除头部、足和翅膀，并将胸部和腹部放入 PBS 中。解剖肠道时，首先抓住腹部远端的体壁，从后端开始沿侧面向前剪开体壁直至胸部。操作时需特别小心，确保仅剪开体壁，避免损伤消化道。接着，在昆虫针的辅助下，去除腹部体壁、脂肪体及其他组织，直至培养皿中仅剩胸部和消化道。现在识别嗉囊。它是一个囊状结构，位于胸部与腹部连接处附近。如有需要，可对胸部进行额外剪开，以暴露嗉囊。然后，剪除剩余的胸部组织，仅保留消化道和嗉囊。为检测是否摄入了纳米颗粒，首先使用尖头解剖镊子将嗉囊转移至盖玻片上，以便成像观察。操作时需小心，避免嗉囊破裂。立即使用倒置共聚焦显微镜在20倍放大倍数下，通过CY3通道或相差模式对作物进行成像。为识别已摄入的纳米颗粒，将磁力搅拌子在作物附近约10毫米处来回移动，每次往复运动持续约1秒。挥动磁铁的同时，缓慢移动操作台，以观察近乎透明的嗉囊内纳米颗粒的运动情况。如果嗉囊中存在纳米颗粒，它们将与磁力搅拌子同步摆动。昆虫从多孔表面取食溶液时，必须通过 Plateau 不稳定性形成稳定的液桥，以克服将液体保留在孔隙中的毛细管压力。据预测，昆虫取食通道的尺寸将决定其能够取食的最小孔径。在解剖昆虫以检测其是否摄入纳米颗粒后，对其口器进行成像，以测量食物通道的尺寸。对于蝇类，测量了假气管和口部开口的直径。对摄入的纳米颗粒进行分析表明，昆虫远端口器导管尺寸与昆虫能够取食的最小孔径之间存在密切关系。这种关系在近端口器部分并未观察到。因此，双翅目昆虫的液体摄取首先发生在假气管中，而非口部开口处，且毛细作用在取食过程中必然发挥重要作用。观看本视频后，您应该能够充分理解如何将纳米颗粒溶液喂食给昆虫、解剖昆虫以分离其嗉囊，并随后检查嗉囊中的纳米颗粒。在进行该操作时，解剖过程需格外小心。如果嗉囊破裂，其中的液体内容物和纳米颗粒可能溢出，从而破坏您的样本。

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科研

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生物学

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荧光磁性纳米颗粒的摄取用于测定昆虫的液体吸收能力

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