利用自动纵向荧光成像气体和温度优化记录仪 (鳄鱼) 对生物发光记者进行灵活测量
December 13th, 2017
基因编码荧光是一种受欢迎的非侵入性的转基因记者。使用自动纵向荧光成像气体和温度优化记录仪 (鳄鱼), 使纵向记录从生物发光细胞在广泛的条件。在这里, 我们展示了如何在生理节律研究的背景下使用鳄鱼。
该系统的总体目标是允许在广泛的细胞外条件下（包括在恒定培养基灌注下）轻松观察生物发光报告基因。该方法可用于纵向观察培养细胞和组织的生物发光。该技术的主要优点是它允许在不同的细胞外介质和气体条件下从细胞中进行记录，这在大多数现有系统中是不可能的。
虽然我们在这里在昼夜节律实验的背景下演示了这项技术，但它可以很容易地应用于其他需要生物发光或荧光记录的系统，时间尺度从几天到几周不等。要开始该程序，请将培养的细胞接种在组织培养皿或板上。在 37 摄氏度下孵育细胞，直到单层达到 100% 汇合。
在实验之前，使用计算机控制的循环培养箱每 32 小时在 37 和 12 摄氏度之间交替，至少持续 72 小时，以同步细胞节律。培养物内和培养物之间的细胞昼夜节律振荡的稳健同步对于实验可重复性至关重要。我们通过在每次记录之前应用每日温度循环来实现这一目标，通过模拟体温节律来同步细胞。
或者，药理学同步也可能非常有效。接下来，将 8.3 克高葡萄糖 DMEM 粉末与 900 毫升超纯水混合。将溶液搅拌 30 分钟以完全溶解粉末。
然后，向溶液中加入 50 毫升 100 克/升葡萄糖溶液、20 毫升 pH 7.6、1 摩尔 MOPS 溶液和 10 毫升 100 倍青霉素链霉素溶液。将混合物搅拌 10 分钟。然后，加入 4.7 毫升 7.5% 碳酸氢钠溶液，再搅拌混合物 5 分钟。
在室温下使用盐酸或氢氧化钠将 pH 值调节至 7.6。向溶液中加入超纯水，使最终体积达到 1 升。通过 0.22 微米无菌过滤器将溶液过滤到无菌培养瓶中。
将过滤后的储备培养基储存在 4 摄氏度。在进行实验之前，在所需量的储备培养基中补充 10% 血清、2 毫摩尔 GlutaMAX、2% NS21 和 1 毫摩尔荧光素。将所得工作介质通过 0.22 微米无菌过滤器。
使用氯化钠的 5 摩尔溶液将工作介质渗透压调节至 350 毫摩尔。然后，在水浴中将培养基加热至 37 摄氏度。接下来，要开始聚焦生物发光培养箱相机，请拧下不透水的加热中性密度过滤器。
在仪器软件中，将曝光时间设置为 0.2 秒，将动力学循环时间设置为 0.3 秒。验证电子倍增增益是否已关闭，然后关闭设置窗口并开始视频录制。使用聚焦圆筒旋转相机镜头，直到相应样品架上的测试物品清晰对焦。
然后，停止视频录制。更换中性密度过滤器并移除测试项目。接下来，使用生物发光培养箱正面的控制面板设置实验所需的氧气、二氧化碳和温度水平。
对于加湿实验，请装满培养箱底部的水盘。从组织培养箱中取出细胞，并用预热的工作培养基替换培养基。对于小体积的加湿实验，请用透气薄膜或胶带密封板。
将板放入生物发光培养箱中。关闭培养箱并拧紧门盖，以排除系统光线。然后，在仪器软件中，将采集模式设置为 kinetic。
设置所需的曝光时间。将累积设置为 1，将动力学序列长度设置为所需的采集周期数，将动力学周期时间设置为所需的成像间隔。将换档速度设置为 4.33 微秒，增益为 1，EM 增益为所需电平。
然后，将自动保存文件类型设置为 sif 或 tiff。为自动保存文件命名并设置其文件路径。将假脱机文件类型设置为 sif 或 tiff。
为文件堆栈命名并设置其文件路径。关闭设置窗口并开始记录数据。数据收集完成后，将采集的图像堆栈导入图像处理软件。
调整亮度和对比度以获得最佳生物发光效果。然后，选择感兴趣的区域并导出所选区域的平均信号。将数据复制到分析软件中以进行进一步处理。
为了开始实验，将细胞接种在带有 Luer 连接器且通道深度为 0.6 或 0.8 毫米的单通道载玻片上。培养并夹带细胞。准备并加热碳酸氢盐缓冲低葡萄糖 DMEM 灌注培养基。
接下来，切割五段内径为 1 毫米的 2 厘米长的硅管。切割 1.2 米、10 厘米和 30 厘米内径为 1 毫米的乙烯四氟乙烯管。用 70% 乙醇对管路消毒，并用无菌 PBS 冲洗管路。
使用灭菌硅胶管将 1.2 米 ETFE 管连接到无菌母 Luer 连接器和无菌弯头 Luer 连接器。使用此组件将灌注培养基注射器连接到空的 Luer 通道载玻片。接下来，用预热的灌注培养基替换细胞培养基。
在 20 毫升无菌注射器中加入预热的灌注培养基。使用硅胶管将 10 厘米 ETFE 管与鲁尔接头安装在一起，然后将管子连接到载玻片上。通过管道和通道载玻片冲洗 3 至 5 mL 灌注培养基。
然后，将 30 厘米的 ETFE 管安装到含有细胞的通道载玻片上。将 10 厘米 ETFE 管的自由端连接到细胞通道载玻片的另一端，以形成完整的灌注系统。通过管道和载玻片冲洗 1 毫升灌注培养基以排除气泡。
将灌注系统运输到生物发光培养箱。将充满灌注介质的注射器固定在注射泵中，小心不要断开管道。使用注射泵通过灌注系统冲洗 1 毫升灌注培养基。
输入泵上的注射器直径，并将流速设置为每小时 50 微升。在实验开始时，灌注系统中没有气泡至关重要，因为这些气泡会破坏生物发光信号。启动泵并立即关闭生物发光培养箱门。
拧紧门盖以排除系统光线。按照静态组织培养物的说明采集和分析数据。使用每日温度循环夹带六块 PER2 LUC 成纤维细胞板，并使用生物发光培养箱成像。
分析来自选定孔的图像并量化生物发光输出。PER2 LUC 细胞也在灌注条件下成像，以评估酪蛋白激酶抑制剂对 PER2 LUC 表达的影响。将结果与在静态条件下用相同浓度的抑制剂处理的细胞进行了比较，结果显示静态条件下的周期延长明显更大。
发现灌注条件下周期延长的幅度接近体内观察到的幅度。观看此视频后，您应该对如何使用 ALLIGATOR 进行静态和灌注生物发光实验有很好的了解。
概述
本文介绍了一种称为ALLIGATOR的自动化纵向荧光素酶成像系统，旨在用于非侵入性监测基因表达。该系统允许在不同细胞外条件下对培养细胞进行生物发光记录，特别适用于昼夜节律研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 生物发光成像
背景
- 基因编码的荧光素酶作为基因表达的报告器。
- 现有系统往往限制了在不同条件下观察生物发光的能力。
- ALLIGATOR通过允许纵向研究解决了这些限制。
- 这种技术特别适用于昼夜节律实验。
研究目的
- 展示ALLIGATOR在监测生物发光报告器方面的能力。
- 提供一种观察细胞在不同条件下响应的方法。
- 提高昼夜节律研究中的实验可重复性。
使用的方法
- 使用温度循环进行细胞培养和同步。
- 准备专门的培养基以进行生物发光记录。
- 利用生物发光孵化器在受控条件下进行实验。
- 使用图像分析软件进行数据采集和处理。
主要结果
- 成功同步细胞的昼夜节律。
- 在不同细胞外条件下有效地记录生物发光。
- 展示了ALLIGATOR在不同实验设置中的多功能性。
- 在其他生物系统中超出昼夜节律的潜在应用。
结论
- ALLIGATOR是进行基因表达纵向研究的有价值工具。
- 该系统提高了长期观察细胞行为的能力。
- 未来的应用可能扩展到需要生物发光监测的各个领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Longitudinal bioluminescence monitoring under physiologically relevant conditions remains a critical gap in target validation and pathway interrogation. The ALLIGATOR system addresses this by enabling high-sensitivity, high-throughput imaging across variable gas, temperature, and perfusion conditions, reducing physiological artifacts in mechanistic studies. This flexibility supports predictive confidence in early discovery by aligning in vitro observations with in vivo dynamics, particularly for circadian and dynamic signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional dynamics under near-physiological extracellular conditions, improving target hypothesis testing.
- Operational Value: Supports longitudinal tracking of reporter activity without disrupting culture integrity, reducing well-to-well variability.
- Predictive Value: Enhances mechanistic de-risking by capturing temporal gene expression patterns relevant to drug target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, spatially resolved bioluminescence readouts across monolayers, enabling detection of heterogeneous responses in cell populations.
- Operational Value: Compatible with standard tissue culture plates and perfusion setups, allowing integration into existing screening workflows.
- Scalability Value: Facilitates longitudinal assay formats over days to weeks, supporting chronic dosing and adaptive response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Alignment: Permits evaluation of luciferase reporters under conditions mimicking in vivo temperature and gas fluctuations, improving preclinical predictability.
- Pathway Continuity: Supports longitudinal assessment of clock-controlled or stress-responsive pathways across discovery to preclinical transition.
- Biomarker Readiness: Enables spatial and temporal mapping of reporter expression, aiding in biomarker trajectory modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The ALLIGATOR system fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization, particularly for targets with circadian or dynamic expression patterns. It enables continuous monitoring of pathway modulation, supporting go/no-go decisions based on temporal response profiles rather than endpoint snapshots.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of transcriptional regulators and signaling pathways under physiologically relevant cycling conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence signals suitable for compound library screening in kinetic formats.
- Analytics: Generates exportable intensity and spatial data for downstream modeling of oscillation period, amplitude, and phase.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by simulating body-temperature rhythms and media perfusion.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, adaptable platform for repeated use across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing artifacts from static, non-physiological culture conditions.
- Operational Value: Standardizes long-term bioluminescence acquisition across variable environmental parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by revealing sustained vs. transient target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dynamic response fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture synchronization, luciferase reporter systems, and environmental control.
- Dependent on access to a temperature- and gas-regulated bioluminescence incubator with imaging capability.
- Necessitates standardized media preparation and luciferin supplementation protocols for reproducible signal.
- Involves adaptation considerations when transitioning between static, perfused, and gas-variable experimental modes.
- Limited by the need for luciferase-expressing models and compatibility with opaque or pigmented culture vessels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Cell Seeding and 3-(N-Morpholino)propanesulfonic Acid (MOPS)-buffered High Glucose Medium Preparation
2:52
Bioluminescent Imaging of Static Tissue Cultures
6:31
Bioluminescent Imaging of Perfused Tissue Cultures
9:19
Results: Bioluminescent Imaging of Mammalian Cells Using an ALLIGATOR
10:11
Conclusion
