Name: 利用自动纵向荧光成像气体和温度优化记录仪 (鳄鱼) 对生物发光记者进行灵活测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 了解ALLIGATOR自动纵向荧光成像系统用于生物发光报告基因的长期监测方法。该技术可在变化的细胞外条件下记录培养细胞的基因表达，特别适用于昼夜节律研究。

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我们感谢Cairn Research与我们合作开发此系统，特别是Mark Henson、Jeremy Graham和Joao Correia。我们还要感谢David Welsh和Akhilesh Reddy在设计阶段提供的宝贵讨论，以及Peter Laskey（原属Hamamatsu）协助安排演示相机的借用，同时感谢David Wong对稿件提出的宝贵意见。

1. 细胞接种与温度诱导
注意：本实验方案已使用表达 PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) 融合蛋白的小鼠原代和永生化成纤维细胞进行了严格验证4。若使用其他细胞系进行实验，可能需要进行相应调整。
<ol>
	<li>开始细胞培养之前，将以下物品放入 37 °C 水浴加热：磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）、含0.68 mM乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（PBS+EDTA）、合适的细胞培养基 例如，添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） 100 µg/mL 链霉素和0.25%胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>用预热的 PBS+EDTA 溶液将胰蛋白酶按 1:3 比例稀释，然后放回水浴中。</li>
	<li>取一根125 cm2 含有表达荧光素酶细胞的培养瓶，细胞融合度为70-90%。吸除培养基。加入10 mL预温的PBS。</li>
	<li>吸除 PBS。加入 2.5 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA，将培养瓶放回 37 °C 孵育5分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察。当大多数细胞已从培养瓶底部脱落时，继续下一步操作。如果大部分细胞仍贴附在培养瓶底部，则将其放回培养箱中继续孵育，直至大多数细胞悬浮。</li>
	<li>向培养瓶中再加入 7.5 mL 标准细胞培养基。根据需要，可从中取出 1 mL 用于细胞的进一步传代。</li>
	<li>使用血细胞计数板和台盼蓝对剩余细胞进行密度计数。根据该细胞系的特性，进一步适当稀释细胞。 
	注意：以下实验中，PERIOD2::LUC 成纤维细胞的接种密度为 6 x 10⁵ 至 8 x 10⁵ 个/10 cm 培养皿。3 细胞/厘米²2 和 1 × 104 细胞/厘米²2 96孔板、35 mm培养皿或通道载玻片中</li>
	<li>将种子细胞接种到用于记录的组织培养皿或培养板中。 
	注意：建议使用黑色侧壁、透明底部的培养板，这可在记录开始前评估细胞培养状态，同时减少记录过程中各孔之间的信号干扰。当生物发光水平极低时，应使用白色培养皿/板以最大化光信号检测，但需注意，磷光可能导致背景信号升高，且可持续数小时。</li>
	<li>将培养板放回培养箱，使单层细胞达到100%汇合度（约7天）。 
	注意：一旦细胞长至融合，能够抑制接触的细胞系在定期更换培养基（每5-7天）的条件下，可在实验前维持培养长达三周。</li>
	<li>待细胞融合后，利用施加的温度循环（12小时于 32 °C，12 小时 37 °C) 实验前至少 72 h5,6 （使用由计算机通过串行RS-232端口连接并控制的预设程序循环培养箱）。 
	注意：用于同步细胞节律的温度循环次数可能因细胞系而异，因此可能需要针对其他细胞系进行优化。先前研究也曾采用佛斯科林（forskolin）或地塞米松（dexamethasone）的急性药物刺激来同步细胞节律。7,8.</li>
</ol>
2. NS21 溶液的配制
注意：NS21 是一种无血清添加剂，用于维持神经元及其他细胞培养。它是对一种名为 B27 的类似添加剂的优化，后者为市售产品，可在昼夜节律生物荧光记录过程中作为血清替代物使用9。在下述实验方案的记录培养基中，这两种添加剂可互换使用。自行配制 NS21 是完全可行且成本效益较高的，如 Chen et al.10 所述，本文亦将对此进行描述。
<ol>
	<li>开始前，将 表1 中列出的所有组分在室温下平衡 1 小时。</li>
	<li>在冰上将 50 g 牛血清白蛋白溶解于 324 mL 基础培养基（例如，Neurobasal）中。尽量减少搅拌。</li>
	<li>加入所有其他组分，每次加入后轻微搅拌，但仍需确保充分混匀。目标是在开始操作后的 90 分钟内完成所有组分的溶解。</li>
	<li>将最终混合液分装后储存于 -20 °C，待用。避免反复冻融。 
	注意：此混合液在此阶段过于黏稠，无法过滤，但在使用前用培养基稀释后将进行无菌过滤，再添加至细胞中。</li>
</ol>
3. 记录介质的制备
注意：与用于记录长期生物发光的其他设备相比，生物发光培养箱的一个主要优势在于其能够对培养箱进行加湿，并调节 O₂ 和 CO₂ 的分压，从而在成像期间维持细胞的生理状态。2 和 CO2可以使用更广泛的培养基条件来记录生物发光——包括更接近不同类型细胞所占据的生理微环境的条件 体内. 下文我们将介绍改编自 Hastings 的记录培养基的配制方法 等9，我们已将其常规用于培养的成纤维细胞及其他细胞类型。第一种适用于封闭培养条件（无气体交换），第二种适用于生理相关条件，应在加湿环境下配合5% CO₂使用2许多其他变体均是可行且可取的，具体取决于实际应用和细胞类型。
<ol>
	<li>MOPS 缓冲高糖培养基制备 
	注：储存液（1 L）：DMEM 粉末（8.3 g/L）、0.35 mg/mL 碳酸氢钠，5 mg/mL 葡萄糖，0.02 M MOPS、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素。
	<ol>
		<li>在 1,000 mL 量筒中，将 8.3 g DMEM 粉末溶于 900 mL 超纯水中，搅拌 30 分钟，直至所有颗粒完全溶解。</li>
		<li>加入 50 mL 葡萄糖溶液（100 g/L）、20 mL MOPS 溶液（1 M，pH 7.6）、10 mL 100× 青霉素/链霉素溶液，再搅拌 10 分钟。</li>
		<li>加入 4.7 mL 7.5% 碳酸氢钠溶液，继续搅拌 5 分钟。</li>
		<li>用 HCl/NaOH 将培养基 pH 值调节至 7.6（室温下）或 7.4（37 °C）。</li>
		<li>加入超纯水，定容至 1,000 mL。</li>
		<li>通过 0.22 µm 滤膜过滤除菌，4 °C 保存备用。</li>
		<li>实验前，取适量储存液，添加 10% 血清、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、2% NS21 和 1 mM 荧光素，配制成工作液，并通过 0.22 µm 无菌滤膜过滤。</li>
		<li>使用渗透压计测定培养基的渗透压。
		<ol>
			<li>打开渗透压计电源。</li>
			<li>先用超纯水校准渗透压计。在测量杯底部加入 50 µL 水，确保液体中无气泡。将测量杯固定在探头上方，按下“Zero”键，小心将渗透压计臂降至最低点。待读数完成且绿色“result”灯亮起后，再抬起机械臂并取下测量杯。</li>
			<li>使用 50 µL 校准标准液（300 mOsmol/kg）再次校准，按下“Cal”键后再降低机械臂。</li>
			<li>在测量杯底部加入 50 µL 培养基样品，按上述方法测定渗透压。降低机械臂前按下“sample”键。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 5 M NaCl 将渗透压调节至 350 mOsmol/kg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HCO3 缓冲低糖培养基（灌流培养基）制备 
	注：储存液（1 L）：DMEM 粉末（8.3 g/L）、3.7 mg/mL 碳酸氢钠、1 mg/mL 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素。
	<ol>
		<li>在 1,000 mL 量筒中，将 8.3 g DMEM 粉末溶于 900 mL 超纯水中，搅拌 30 分钟，直至所有颗粒完全溶解。</li>
		<li>加入 50 mL 葡萄糖溶液（100 g/L）和 10 mL 100× 青霉素/链霉素溶液，再搅拌 10 分钟。</li>
		<li>加入 49.4 mL 7.5% 碳酸氢钠溶液，继续搅拌 5 分钟。</li>
		<li>用 HCl/NaOH 将培养基 pH 值调节至 7.6（室温下）或 7.4（37 °C）。</li>
		<li>加入超纯水，定容至 1,000 mL。</li>
		<li>将溶液通过 0.22 µm 无菌滤膜过滤，4 °C 保存备用。</li>
		<li>实验前，取适量储存液，添加 2% 血清、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、2% NS21 和 1 mM 荧光素，配制成工作液，并通过 0.22 µm 无菌滤膜过滤。</li>
		<li>参照 MOPS 缓冲培养基的方法，使用 5 M NaCl 将渗透压调节至 350 mOsmol/kg。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：每种细胞类型和实验条件下，荧光素浓度应通过实验经验确定。更多详细信息请参见 Feeney et al.11。血清和 NS21（或所用的 B27）的浓度可根据具体应用进行调整。然而，我们建议，除非已有实验证据表明其他条件可行，否则应使用血清和 NS21（或替代的无血清补充剂），因为这些成分有助于细胞存活和贴壁。对于接触抑制效果较差的细胞系，可能需要降低记录培养基中的血清浓度，以避免血清促进的增殖作用带来的干扰效应。
4. 记录
<ol>
	<li>在开始记录之前，将适当的实验用培养基储备液（根据实验需要，来自步骤3.1或3.2）放入 37 °C 水浴加热。</li>
	<li>当培养基加热时，在生物发光培养箱中对相机进行对焦。
	<ol>
		<li>拧下防水加热型中性密度滤光片，并妥善放置。</li>
		<li>将软件设置为以高采集速率录制视频。点击“采集 | 采集设置”，将“曝光时间”设为 0.2 s，动力学循环时间设为 0.3 秒。确保关闭 EM 增益。</li>
		<li>关闭“采集设置”窗口，然后点击“拍摄视频”图标。</li>
		<li>使用调焦筒，旋转相机镜头，直至视频中待记录高度的货架物品清晰对焦。</li>
		<li>通过点击“停止视频”图标来停止视频。</li>
		<li>将加热的中性密度滤光片重新拧回原位；否则会导致EM-CCD相机损坏和/或因冷凝导致物镜起雾。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 O2, CO2并使用生物发光培养箱前面板上的控制面板将温度调节至所需的实验条件。 
	注意：若进行灌流细胞培养，此时应直接进入第5节。</li>
	<li>从组织培养孵箱中取出细胞，吸除培养基，更换为预热的工作液。</li>
	<li>如果在实验过程中不需要对生物发光培养箱进行加湿，则需使用不透气封口膜密封培养皿和培养板。如果需要对生物发光培养箱进行加湿，则不一定必须密封培养皿；但建议对体积较小的培养器皿（如96孔板）使用透气封口膜进行密封，因为在加湿的培养箱中仍可能发生少量蒸发。 
	注意：通过填充培养箱底部的水盘来实现加湿。</li>
	<li>将细胞转移至生物发光培养箱中，关闭培养箱门并固定培养箱盖，确保形成密闭的避光环境。</li>
	<li>选择适合该应用的记录参数。
	<ol>
		<li>点击“采集|采集设置”。</li>
		<li>在“相机设置”面板中，设置：“采集模式”为“动力学”；“曝光时间”为所需的曝光时间（以秒为单位，参见下方注释）；“累积次数”为1；“动力学序列长度”为所需的采集周期数；“动力学循环时间”为所需的成像时间间隔（确保该值大于曝光时间）；“转移速度”为 4.33 µsecs；“增益”设为1；“EM增益”设为所需水平（见下文注释）</li>
		<li>在“自动保存”面板中，将文件类型设置为 .sif 或 .tif。输入文件名并选择合适的保存位置。</li>
		<li>在“卷绕”面板中，将文件类型设置为 tiff。输入文件名并指定适当的保存位置。关闭采集设置窗口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单击“采集信号”按钮开始记录。 
	注意：由于生物发光培养箱可用于多种不同类型的细胞和组织，而这些细胞和组织的生物发光水平各不相同，因此在不同实验之间，采集适当生物发光信号所需的曝光时间也会有所差异。此外，也可通过调整成像的电子倍增（EM）增益来增强所采集信号的强度。对于发光强度未知的新应用，我们建议首先以相对较短的曝光时间（约10分钟）且不启用EM增益的条件下采集一张图像，随后逐步调整曝光时间和EM增益，直至达到理想的记录条件。在大多数情况下，相机像素最大可能强度的10–20%的平均信号水平是较为理想的成像目标。一旦确定了合适的记录参数，即按照上述方法开始进行长时间连续的图像采集。</li>
</ol>
5. 灌注组织培养（可选）
注意：如引言所述，生物发光培养箱适用于非标准组织培养系统的成像。这在灌注式细胞培养系统的开发中得到了例证。
<ol>
	<li>按照第1节所述方法，将细胞接种至带有鲁尔接头的单通道载玻片上，通道深度为0.6或0.8 mm，培养基为含10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素的DMEM。按步骤3.2所述配制灌流培养基。</li>
	<li>记录前，使用内径（I.D.）为1 mm的ETFE管和内径（I.D.）为1 mm的硅胶管、弯头、公/母鲁尔接头，组装所需灌流系统的管路，如图2A所示。 
	注：管路主要部分为ETFE管，两端各使用约2 cm长的硅胶管段将ETFE管连接至鲁尔接头，后者再与通道载玻片相连。</li>
	<li>通过灌注70%乙醇对管路进行灭菌，随后用无菌PBS冲洗。</li>
	<li>从培养箱中取出通道载玻片中的细胞培养物，吸除旧培养基，并更换为预热的灌流培养基。</li>
	<li>用预热的灌流培养基填充一支20 mL注射器。</li>
	<li>将管路连接至缓冲液载玻片（见图2），但暂不连接含细胞的载玻片，用灌流培养基冲洗整个管路及缓冲液载玻片（3–5 mL）。</li>
	<li>连接含细胞的载玻片，并用额外1 mL培养基冲洗整个系统，以去除任何气泡。</li>
	<li>将整个系统转移至生物发光培养箱中。</li>
	<li>在不脱离管路的前提下，将装有培养基的注射器安装至注射泵上，并通过泵推动再灌注1 mL培养基，确保系统内无气泡残留。</li>
	<li>在泵上设置所用注射器的直径。 
	注：本实验所用20 mL注射器的直径为19.13 mm。</li>
	<li>将泵的流速设定为50 µL/h，并启动运行。</li>
	<li>在开始记录前，确保所有载玻片和管路中无气泡，因为气泡经过细胞单层时会影响荧光素酶的表达。如有必要，可进一步灌注培养基以排除气泡。</li>
	<li>关闭生物发光培养箱门，继续执行步骤4.7以开始记录。</li>
</ol>
6. 记录过程中的处理
注意：有时需要在记录过程中对细胞进行处理，例如施加药理学或激素类试剂。在此类情况下，必须小心操作细胞，以防止处理过程中细胞振荡重置。因此，保持细胞处于恒定温度尤为关键，因为温度是细胞昼夜节律的主要授时因子5,6。
<ol>
	<li>在停止记录前，预先准备好所有处理所需的组分。</li>
	<li>准备一个37 °C的化学恒温垫。</li>
	<li>停止设备记录，取出需要处理的培养皿并放置在恒温加热垫上。</li>
	<li>按实验要求对培养物进行处理后，放回原先位置的生物发光培养箱中。</li>
	<li>重新开始记录。</li>
</ol>
7. 分析
注意：生物发光培养箱产生的数据为一系列单独的图像。我们主要使用 Fiji12 来管理这些图像，然后导出每个感兴趣区域（ROI）的平均像素强度数据，以供进一步分析。
<ol>
	<li>在 Fiji 中打开图像堆栈，通过点击“Image | Adjust | Brightness/Contrast”并调节滑动条，使图像的亮度和对比度处于适合观察生物发光信号的范围内。</li>
	<li>使用“分析|工具|ROI管理器”中的ROI管理器选择感兴趣的区域。</li>
	<li>单击“ROI manager | More | Multimeasure”以导出选定区域的平均信号。</li>
	<li>将所得数据复制到分析软件中。</li>
	<li>手动调整数据的时间基准，使其与成像的时间间隔一致，（即，15、30 或 60 分钟间隔（表示为 0.25、0.5 或 1 小时），而不是 Fiji 提供的图像编号。 
	注意：现在可以进行进一步分析，例如周期的确定。为此，可使用以下公式进行非线性回归分析： 
	<img alt="线性项阻尼谐振运动方程，结合指数衰减与余弦函数。" src="/files/ftp_upload/56623/56623eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 
	其中 y 是信号， x 相应的时间， m 是趋势线的斜率， c 是趋势线的 y 轴截距，振幅是波形峰值高于趋势线的高度 k 是衰减常数或阻尼速率（即 1/k 是半衰期，相位是余弦波在 x 轴上的偏移，周期是完成一个完整循环所需的时间13. R2 值用于指示拟合优度。也可采用其他分析方法。应从分析中排除采集数据的前24小时，因为在此期间细胞生物发光可能表现出短暂的、非昼夜节律性的变化，这是对培养基更换的急性反应所致。</li>
</ol>

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</ol>

不存在利益冲突。

本文所述方案适用于灌注条件和静态条件下的哺乳动物细胞培养。然而，ALLIGATOR 可轻松适配于其他模型系统。事实上，已有研究证明，该系统可作为在持续黑暗条件下维持的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）运动、睡眠及外周基因表达节律同步监测的优良平台15。 此外需指出，根据具体应用需求，可选用本文所述以外的其他类型相机。我们预计，通过配备适当的滤光片，当前装置的改进版本原则上也可用于荧光定量分析。
唯一可能不适用ALLIGATOR的情况是需要特别高空间分辨率的应用，例如哺乳动物视交叉上核的器官型切片中PER2::LUC表达的时空组织成像，或其他小型组织切片的成像。
ALLIGATOR 能够实现许多以往使用传统记录技术难以完成的实验。与现有的生物发光检测方法相比，ALLIGATOR 在可使用的细胞培养皿或载玻片类型、外部培养环境条件、灵敏度以及持续检测能力方面均具有更高的灵活性。
这一点在当前正从传统的二维细胞培养模型向三维类器官和流动培养系统转变的背景下尤为重要。因此，预计ALLIGATOR将提供一种可调节的方法，能够在多种条件下持续数天乃至数周地检测生物发光信号。

荧光素酶作为基因表达和蛋白质活性报告基因的应用，已成为分子和细胞生物学研究中一种流行的技术。这一技术在生物钟研究领域尤为适用，因为萤火虫荧光素酶的合成动力学及其催化失活特性非常适合报告基因表达在约24小时生物钟周期中的纵向变化。因此，荧光素酶被广泛用作多种生物体中的生物钟报告基因，包括真菌、植物、果蝇和哺乳动物1,2,3,4。
在定量昼夜节律基因表达时 体外，通常使用光电倍增管（PMT）来记录生物发光信号。然而，基于PMT的测量灵活性有限，通常仅限于特定预设尺寸的培养板或培养皿。此外，使用PMT监测样本时无法获取任何空间信息，因此在成像那些荧光素酶表达存在空间异质性的样本时，可能导致信息丢失。进一步地，由于PMT及其相关电子元件在标准细胞培养孵育箱的加湿环境中容易发生故障，因此使用PMT进行的长期荧光素酶记录必须在非加湿孵育箱中进行。因此，细胞培养皿必须严格密封，以防止因蒸发导致的水分流失，培养基也必须使用3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），而非CO2/碳酸氢盐缓冲系统，其功能为 体内 并常规用于哺乳动物组织培养。
由于这些限制，使用光电倍增管（PMT）测量生物发光通常对实验过程中细胞的培养条件施加了严格限制。为了克服这些问题，并扩大可能的实验条件范围，我们采用了一台标准的 CO2/N2 170 L 组织培养孵育箱，并通过加装水冷式电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机、防雾光学系统以及对温度和气体浓度的数字化控制进行了改造。该系统被命名为“自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪”（Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas and Temperature-Optimized Recorder），简称 ALLIGATOR。ALLIGATOR 显著提高了生物发光成像的灵活性，不仅可实现对标准组织培养板的高通量成像（最多可同时检测 6 块 96 孔或 384 孔板），还可用于非标准的组织培养系统，例如在微流控装置中培养的灌注细胞。该仪器还支持在加湿条件下进行成像，并可对 CO2 和 O2 的分压以及温度进行可变调控。
以下方案描述了一种利用ALLIGATOR设备（下文简称“生物发光培养箱”）对哺乳动物细胞和组织培养系统进行生物发光记录的方法。然而需要注意的是，该系统也非常适用于多种其他生物系统和情境下的生物发光成像，经过适当改造后，也可用于荧光成像。

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III 血清</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>基础培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>超氧化物歧化酶</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>全转铁蛋白</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3（三碘-L-甲状腺原氨酸）</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-肉碱</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-半乳糖</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>皮质酮</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>亚油酸</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>α-亚麻酸</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>硫辛酸</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>醋酸视黄醇</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>全反式视黄醇</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D,L-α-生育酚</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D,L-α-生育酚醋酸酯</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠溶液</td><td>Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R 培养箱&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖溶液</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 干粉</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>内径 1 mm 硅胶管&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>弯头鲁尔接头</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>雄性鲁尔接头</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-slide luer I 0.6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak 20 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>内径 1 mm ETFE 管</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂 (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD 相机</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase 等温垫</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>加热型中性密度滤光片&amp;nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>定制产品</td><td></td></tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>已停产</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg 校准标准液</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>测量容器</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>聚焦圆筒</td><td>Cairn Research</td><td>定制产品</td><td></td></tr><tr><td>NE-1600 可编程注射泵</td><td>Pump Systems inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis 软件</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

使用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（alligator）灵活检测生物发光报告基因

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

基于荧光素酶的细胞基因表达报告系统被广泛用于生物活性的长期及终点检测。例如，在昼夜节律研究中，将荧火虫荧光素酶与钟控基因融合，可产生持续多天的稳定细胞生物发光节律。以往用于生物发光定量的光电倍增管（PMT）或基于传统显微镜的方法存在技术局限，通常要求在记录期间将细胞和组织维持在非生理性的条件下，导致灵敏度与通量之间存在权衡。本文报道了一种对先前方法的改进，实现了高灵敏度、高通量的长期生物发光成像，支持多种培养条件，包括可调节的气体环境与湿度控制，并兼容多种不同的组织培养板和培养皿。这种自动化长时程荧光素酶成像气体与温度优化记录系统（ALLIGATOR）还可观察细胞单层或组织中荧光素酶表达的空间差异，而这是传统方法难以实现的。我们重点阐述了与现有方法相比，ALLIGATOR在检测荧光素酶活性方面提供的极大灵活性。

本文概述了一种使用 ALLIGATOR（生物发光培养箱）对哺乳动物细胞进行生物发光成像的实验方案。该技术在对生物发光系统进行成像时，可灵活调整物理装置和细胞外环境。文中描述了简单的静态组织培养（图1，补充视频1）和灌注式细胞培养（图2，补充视频2）两种方法，但该系统还可用于多种其他装置的成像。所有数据均采用第7节中所述方法进行定量分析。
图1A 显示了来自6块96孔板的PER2::LUC成纤维细胞生物发光记录示例视频4。最外侧的孔中未接种细胞，因为本实验无需使用这些孔。细胞经历了不同的温度同步处理：一组先在32 °C下培养12小时，随后在37 °C下培养12小时，如此循环72小时；另一组则顺序相反（先37 °C 12小时，再32 °C 12小时，循环72小时），之后均在恒定的37 °C条件下进行记录。每小时采集一次持续60分钟的曝光图像。图1B 对其中两种处理条件进行了定量分析。
图2A 显示了灌注组织培养系统的装置示意图。该系统由两个通过管路连接的通道载玻片组成，培养基由注射泵驱动流经细胞。其中第一个通道载玻片作为可透气体的气泡捕获装置（缓冲载片），不接种细胞；第二个载玻片则含有待记录生物发光信号的细胞。本系统获得的代表性记录视频如图所示 图 2B每15分钟采集一次，持续15分钟。在此过程中，细胞在标准灌注条件下培养，或在含有酪蛋白激酶抑制剂PF670462的条件下培养。已有研究表明，PF670462可延长昼夜节律周期，并降低培养的哺乳动物细胞中生物钟基因表达节律的振幅14PER2::LUC 表达的影响如图所示 图2C （上图）与在标准静态细胞培养条件下用相同浓度药物处理的细胞相比 图 2C （下图），周期量化的结果如图所示 图 2D由此可见，在两种条件下，PF670462 处理均影响 PER2::LUC 的表达。然而，在灌流条件下经 PF670462 处理的细胞周期延长约 3 小时（3 ± 0.9 小时），而在静态条件下经药物处理的细胞则表现出更显著的周期延长，周期达到 &gt;48 h。该数据可通过第7节所述的阻尼余弦函数进行拟合（额外平方和F检验） 与 一条直线，p &lt;0.0001）。有趣的是，在灌流条件下周期延长的程度与观察到的结果更为接近 体内14.
<img alt="生物发光检测结果；PER2::LUC 表达；时间进程图；温度循环 32°C-37°C。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：数据示例。 （A）永生化 PER2::LUC 细胞在生物发光培养箱中，6 块 96 孔板的生物发光示例视频截图。需进行定量分析的孔已在 补充视频 1 中用黄色标出。（B）A 图中生物发光信号的定量结果。两组各 3 块细胞板分别采用反相位的温度循环（12 小时，32 °C；12 小时，37 °C）进行同步化，以产生相反相位的 PER2 蛋白表达（n = 6，均值 ± 标准误）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="灌流系统示意图、发光结果、时间分辨图和柱状图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：使用CK1δ抑制剂进行灌流。（A）灌流系统的示意图。（B）在灌流条件下对PER2::LUC细胞进行生物发光记录的视频截图示例。用于定量分析的示例区域以黄色标出。（C）在灌流与静态条件下，PER2::LUC成纤维细胞的生物发光定量结果（有或无3 µM CK1抑制剂PF670462，n = 3，均值 ± 标准误）。生物发光信号已根据最小值和最大值进行归一化处理。（D）周期分析（双因素方差分析，Holm-Sidak多重比较检验）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度（μM）</td>
			<td>储存液浓度（mg/mL）</td>
			<td>配制 400 mL NS21 所需量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛血清白蛋白</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>过氧化氢酶</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>谷胱甘肽</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰岛素</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>超氧化物歧化酶</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>全转铁蛋白</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3（三碘甲状腺原氨酸）</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-肉碱</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙醇胺</td>
			<td>16</td>
			<td>液体（1 g/mL）</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-半乳糖</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>腐胺</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>亚硒酸钠</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮质酮</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>亚油酸</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>α-亚麻酸</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硫辛酸</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>孕酮</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0.04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素A醋酸酯</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>全反式视黄醇</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-α-生育酚</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-α-生育酚醋酸酯</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：NS21的配制。
补充视频 1：孔板生物发光示例视频。在生物发光培养箱中，6 块 96 孔板中永生化 PER2::LUC 细胞的生物发光示例视频截图。待定量的孔以黄色高亮显示。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">请点击此处下载该文件</a>
补充视频 2：灌流条件下 PER2::LUC 细胞生物发光记录的示例视频截图。 用于定量分析的示例区域以黄色标出。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">请点击此处下载该文件。</a>

基因编码的荧光素酶是一种常用的非侵入性基因表达报告分子。利用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（ALLIGATOR），可在多种条件下对生物发光细胞进行长期连续记录。本文展示了ALLIGATOR在昼夜节律研究中的应用方法。

使用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（ALLIGATOR）灵活检测生物发光报告基因

基于荧光素酶的细胞基因表达报告系统被广泛用于生物活性的长期及终点检测。在……

该系统的主要目标是能够在多种细胞外条件下（包括持续培养基灌注条件下）方便地观察生物发光报告信号。该方法可用于对培养的细胞和组织进行长期的生物发光检测。该技术的主要优势在于，它允许在细胞外培养基和气体条件变化的情况下进行记录，而这一点在大多数现有系统中是无法实现的。尽管本文以昼夜节律实验为背景展示该技术，但它也可轻松应用于其他需要在数天至数周时间尺度上进行生物发光或荧光记录的系统。开始实验时，将培养的细胞接种于组织培养皿或培养板中。将细胞在37摄氏度下孵育，直至单层细胞达到100%汇合度。实验开始前，使用计算机控制的循环培养箱，每12小时在32和37摄氏度之间交替一次，至少持续72小时，以同步细胞节律。培养物内部及不同培养物之间的细胞昼夜节律振荡的稳健同步，对实验的可重复性至关重要。我们通过在每次记录前施加每日温度循环来实现这一目标，该循环通过模拟体温节律来同步细胞。此外，药理学同步化方法也可能非常有效。接下来，将8.3克高糖DMEM粉末与900毫升超纯水混合。搅拌溶液30分钟，以充分溶解粉末。然后，向溶液中加入 50 毫升 100 克/升葡萄糖溶液、20 毫升 pH 7.6 的 1 摩尔 MOPS 溶液以及 10 毫升 100 倍青霉素-链霉素溶液。搅拌混合物 10 分钟。接着，加入 4.7 毫升 7.5% 碳酸氢钠溶液，并继续搅拌混合物 5 分钟。使用盐酸或氢氧化钠在室温下将 pH 值调节至 7.6。加入超纯水使溶液终体积达到一升。通过 0.22 微米无菌滤膜将溶液过滤至无菌烧瓶中。将过滤后的储备培养基在 4 摄氏度保存。在进行实验前立即取所需量的储备培养基，添加 10% 血清、2 毫摩尔 GlutaMAX、2% NS21 和 1 毫摩尔荧光素。将配制好的工作培养基经 0.22 微米无菌滤器过滤。使用五摩尔的氯化钠溶液将工作培养基的渗透压调节至350毫渗摩尔。然后，在水浴中将培养基加热至37摄氏度。接下来，为开始聚焦生物发光培养箱的相机，拧下防水加热型中性密度滤光片。在仪器软件中，将曝光时间设置为 0.2 秒，动力学循环时间设置为 0.3 秒。确认电子倍增增益已关闭，然后关闭设置窗口并开始视频录制。使用调焦旋钮旋转相机镜头，直至相应样品架上的测试物品清晰对焦。然后，停止视频录制。重新装上中性密度滤光片，并移除测试样品。接下来，使用生物发光培养箱前面的控制面板，设置实验所需的氧气、二氧化碳和温度水平。对于需要加湿的实验，需在培养箱底部的水盘中加水。从组织培养箱中取出细胞，将培养基更换为预热的工作培养基。对于使用小体积液体的加湿实验，应用透气膜或透气胶带密封培养板。将培养皿放入生物发光培养箱中。关闭培养箱并扣紧门盖，以隔绝外部光线进入系统。然后，在仪器软件中将采集模式设置为动态监测模式。设置所需的曝光时间。将累加次数设为1，动力学序列长度设为所需的采集周期数，动力学循环时间设为所需的成像时间间隔。设置转移速度为4.33微秒，增益为1，EM增益为所需的水平。然后，将自动保存文件类型设置为 sif 或 tiff。命名自动保存文件并设置其文件路径。将拼接文件类型设置为 sif 或 tiff。为文件命名并设置其保存路径。关闭设置窗口并开始记录数据。数据采集完成后，将获取的图像序列导入图像处理软件中。调整亮度和对比度，以获得生物发光的最佳观察效果。然后选择感兴趣区域，并导出所选区域的平均信号值。将数据复制到分析软件中进行进一步处理。实验开始时，将细胞接种于带有鲁尔接头、通道深度为 0.6 或 0.8 毫米的单通道载玻片上。培养并同步化细胞，同时配制并预热碳酸氢盐缓冲的低糖 DMEM 灌注培养基。接下来，用内径为一毫米的硅胶管切割五段两厘米长的管段。再分别切割一段1.2米、一段10厘米和一段30厘米长的内径为一毫米的乙烯四氟乙烯管。用70%乙醇对管路进行消毒，并用无菌PBS冲洗管路。使用灭菌的硅胶管将1.2米长的ETFE管连接至无菌的雌性鲁尔接头和无菌的弯头鲁尔接头。使用此组件将灌注培养基注射器连接至一个空的鲁尔通道载玻片。随后，用预热的灌注培养基替换细胞培养基。用预热的灌注培养基填充一支20毫升无菌注射器。使用硅胶管将带有鲁尔接头的10厘米ETFE管路连接至载玻片。向管路和通道载玻片中灌注3至5毫升灌注培养基，进行冲洗。然后，将30厘米长的ETFE管路连接至含有细胞的通道载玻片上。将10厘米长的ETFE管路的游离端连接到细胞通道载玻片的另一端，以构成完整的灌流系统。通过管路和载玻片冲洗1毫升灌流培养基，以排除气泡。将灌注系统转移至生物发光培养箱中。将装有灌注培养基的注射器固定在注射泵上，注意不要断开管路连接。使用注射泵将一毫升灌注培养基冲洗通过整个灌注系统。在泵上输入注射器直径，并将流速设置为 50 微升每小时。实验开始时灌注系统中不得有气泡，因为气泡可能干扰生物发光信号。启动泵后立即关闭生物发光培养箱的门。固定门盖以排除系统中的光线。按照静态组织培养所述方法获取并分析数据。使用每日温度循环对六块 PER2 LUC 成纤维细胞培养板进行同步化，并利用生物发光培养箱进行成像。对选定孔中的图像进行了分析，并对生物发光信号进行了定量。同时在灌注条件下对PER2 LUC细胞进行成像，以评估酪蛋白激酶抑制剂对PER2 LUC表达的影响。将结果与在静态条件下使用相同浓度抑制剂处理的细胞进行比较，结果显示静态条件下周期显著延长。在灌注条件下，周期延长的程度接近体内观察到的水平。观看本视频后，您应能充分理解如何使用 ALLIGATOR 进行静态和灌注式生物发光实验。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

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