Name: 体内在肿瘤微环境中 pH 值、 pO2、氧化还原状态、磷酸盐和谷胱甘肽浓度的 EPR 评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 了解利用低场电子顺磁共振技术在小鼠乳腺癌模型中无创定量评估肿瘤微环境的氧分压、pH值、氧化还原状态及代谢物浓度的方法。该技术为靶向抗癌治疗设计提供重要依据。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 CA194013、CA192064 和 U54GM104942 的支持。感谢 WVCTSI 为 VVK、AB 和 TDE 提供的启动资金。作者感谢 M. Gencheva 博士和 K. Steinberger 在示意图实验方面提供的协助。本内容仅由作者负责，不代表 NIH 的官方观点。

所有动物实验均按照西弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会（WVU IACUC）批准的方案进行。
1. 探针合成与校准
<ol>
	<li>颗粒物 pO2-敏感的 LiNc-BuO 探针 
	注意： LiNc-BuO 微晶的合成与制备方法如参考文献所述13它们非常稳定，可在室温下保存数年。LiNc-BuO 颗粒探针的电子顺磁共振（EPR）线宽是一个 pO2-敏感参数。LiNc-BuO 微晶在从无氧条件至 760 mmHg 氧分压范围内，表现出线宽与氧浓度之间的理想线性依赖关系。 pO2 分压13，其中无氧条件下的本征线宽值及氧依赖性斜率（以 mG/mmHg 为单位）因不同批次的微晶制备而略有差异。因此，每个特定批次均需进行校准。
	<ol>
		<li>称取60 mg的LiNc-BuO微晶。</li>
		<li>为进行氧敏感性校准，将微晶悬浮于3 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中（浓度为20 mg/mL），在5 mL玻璃圆底试管中，于冰上使用探头式超声仪以20 kHz频率、7 W功率超声处理5分钟。</li>
		<li>将1 mL超声处理后的微晶置于L波段（1.2 GHz）电子顺磁共振波谱仪的表面线圈谐振器中的玻璃管内，在生理温度下采集连续波（CW）电子顺磁共振谱 37 &#176;C 氧气浓度分别为 0、1、2、4、8 和 20.9%。通过气体控制器输送的混合气体向溶液中通气，以维持设定的氧气浓度，并使用连接恒温器的水浴装置控制温度。采用以下电子顺磁共振（EPR）波谱仪参数进行信号采集：调制幅度 100 mG，调制频率 100 kHz，扫描宽度 5 G，扫描时间 60 s。</li>
		<li>为了获得更好的信噪比（SNR），应使用等于线宽60%的调制幅度值例如，对于1 G的线宽，使用0.6 G的调制幅度。</li>
		<li>替代性简化的校准步骤：在通入空气的溶液和无氧溶液中记录电子顺磁共振（EPR）谱图14在后一种情况下，根据参考文献，通过向1 mL探针溶液中添加10 mM葡萄糖和100 U/mL葡萄糖氧化酶，以维持样品的无氧状态。14.</li>
		<li>使用洛伦兹函数拟合电子顺磁共振（EPR）谱图以确定线宽（LW）。评估微晶对 pO2 LW 依赖关系的斜率 pO2，即（LW的值空气−LW缺氧)/pO2air，其中 LW空气 和 LW缺氧 分别为空气和缺氧条件下的光谱线宽； pO2air = 152 mmHg</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双功能pH和氧化还原探针，NR 
	注意： NR探针的合成方法如参考文献所述11在室温下，该物质无论是固态还是水溶液状态均保持稳定。合成的NR探针应保存于 4 &#176;C氮超精细分裂，aN，以及信号幅度衰减速率是NR探针对pH敏感的光谱参数（探针pKa = 6.6 时 37 &#176;C，pH敏感范围为5.6至7.6）以及探针微环境的还原能力。
	<ol>
		<li>从冰箱中取出NR，将容器置于室温下回温10 - 15分钟。准确称取6.34 mg NR，溶于1 mL生理盐水中，并使用pH计通过逐滴加入HCl或NaOH将pH调节至7.2。所得NR溶液（10 mM）作为储备液使用。</li>
		<li>按照以下步骤对NR探针进行pH校准（参见参考文献）11首先，将0.1 mL NR储备液加入0.9 mL的2 mM Na-磷酸盐缓冲液（含150 mM NaCl）中。使用pH计，通过逐量加入HCl或NaOH，将所得的1 mM NR溶液滴定至所需pH值。使用连接恒温器的水浴控制温度。</li>
		<li>使用L波段EPR波谱仪，记录样品在1.5 mL微量离心管中的EPR谱图。EPR波谱仪采集参数如下：调制幅度为2.5 G；调制频率为100 kHz；扫描宽度为60 G；扫描时间为20 s。</li>
		<li>测量超精细分裂常数（aN) 作为EPR谱图中低场和高场组分之间距离的一半，并将其对pH作图，以获得用于L波段EPR pH测量的校准曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GSH敏感的RSSR探针 
	注意： RSSR探针的合成方法如参考文献所述15. 将合成的NR探针储存于 4 &#176;C脂溶性RSSR二硫代双自由基化合物可轻易穿过细胞膜，与细胞内GSH反应，为GSH的测定提供了一种可靠方法。 在体 使用电子顺磁共振（EPR）16,17。该方法基于高反应速率&#160;与RSSR探针反应，使细胞内主要的GSH硫醇池中的二硫键断裂（见 方案 1导致两个自由基片段之间的自旋交换被取消，表现为双自由基谱成分的减少以及相应单自由基成分的增加。对于双自由基RSSR探针，单自由基成分振幅的增加速率与GSH浓度成正比，是便于检测GSH的EPR谱参数。根据该参数评估GSH浓度 在体 EPR 测量之前，需在相应的温度和 pH 条件下对 RSSR 与 GSH 反应速率进行校准，步骤如下。
	<ol>
		<li>从冰箱中取出 RSSR，将容器置于室温下回温（10–15 分钟）。称取 4.05 mg NR，溶于 1 mL DMSO 溶液中。将配制好的 RSSR 溶液（10 mM）作为储备液使用。</li>
		<li>确定速率常数 k 的值观察，即在适宜的温度和pH条件下，RSSR与GSH的反应如下。</li>
		<li>首先，加入 20 &#181;L 将 RSSR 储存液（10 mM）加入 0.98 mL 的 1 mM Na-磷酸盐缓冲液（pH 7.2，150 mM NaCl）中，配制成 0.2 mM 的 RSSR 探针溶液。</li>
		<li>配制浓度为 1、2 和 5 mM 的 GSH 溶液，溶剂为 pH 7.2 的 0.1 M Na-磷酸盐缓冲液。为准确评估靶器官细胞中 GSH 的浓度，从 体内 测量，这些 体外 校准必须在接近细胞内pH值的pH条件下进行。</li>
		<li>将0.2 mM RSSR溶液与1.3.4步骤中配制的任一种GSH溶液等体积混合，使探针的终浓度为0.1 mM，GSH的终浓度分别为0.5、1或2.5 mM。</li>
		<li>RSSR 与 GSH 溶液混合后立即放入 EPR 谐振腔中，每 12 秒记录一次 EPR 谱，持续 10 分钟。随后计算单自由基谱幅增长的动力学。&#160;使用以下EPR波谱仪采集参数：调制幅度，1 G；调制频率，100 kHz；扫描宽度，60 G；扫描时间，10–60 s。</li>
		<li>将测得的EPR动力学曲线拟合为单指数形式，并计算指数动力学的时间常数。 &#964;. 线性回归（1/&#964; = k观察 &#215; [GSH]）可提供GSH与RSSR反应的观测速率常数数值（例如，在 34 &#176;C 和 pH 7.2，k观察 = 2.8 &#177; 0.2 M-1s-1)11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多功能HOPE探针 pO2pH 和 Pi 评估 
	注意： 单磷酸化三苯甲基HOPE探针的合成方法如参考文献所述12 并保持在 4 &#176;C. HOPE 在 pH 条件下的连续波电子顺磁共振（CW EPR）谱 &#60;&#60; pKa （A - 酸性形式）和 pH &#62;&#62; pKa （B型—基本形式）由磷的超精细裂分引起的双重峰表示，aP典型的仪器设置如下：调制幅度，37.5 mG；调制频率，100 kHz；扫描宽度，0.9 G；扫描时间，20–60 s。在中等pH值（5 &#60; pH &#60; 8) 当A态和B态均存在时，HOPE探针的EPR谱图表现为四重峰。HOPE的单个EPR线宽为a pO2 标记（准确性， &#8776; 1 mmHg pO2 范围：1–100 mmHg）。质子化HOPE（A型）的比例可作为pH值在6至8.0范围内的标记（准确度， &#177; 0.05）。通过谱图模拟提取的质子交换速率值（以 mG 表示）与 Pi 相关，可作为 Pi 的标志物（准确性， &#177; 0.1 mM，范围为0.1–20 mM）。校准程序在生理温度下进行（37 &#176;C），溶液离子强度（NaCl，150 mM）以及HOPE探针浓度为0.2 mM，如先前参考文献所述12,18，如下所述。
	<ol>
		<li>从冷冻箱中取出HOPE探针，将容器置于室温下回温（10-15分钟）。</li>
		<li>称取10.7 mg HOPE探针，溶于1 mL生理盐水中，并调节pH至7.4。加入 20 &#181;L 将制备好的HOPE储备液（10 mM）取0.98 mL加入0.98 mL生理盐水中，配制成0.2 mM的HOPE探针溶液。</li>
		<li>使用 pH 电极对 HOPE 探针溶液（0.2 mM）进行滴定校准，加入少量 NaOH 或 HCl 调节 pH，确保样品最终稀释度低于 1%。使用已在相应 pH 范围内校准的 pH 电极测量 pH 值 37 &#176;C 使用美国国家标准局（National Bureau of Standards）推荐的参比溶液的pH值。pH测量期间，使用连接至循环器的夹套反应杯，以精确控制参比溶液和滴定溶液的温度。通过向探针溶液中添加10 mM葡萄糖和100 U/mL葡萄糖氧化酶，维持无氧条件。</li>
		<li>在无氧条件下且不含磷酸盐的环境中，分别于 pH ≤ 5 和 pH ≥ 8 时获取 A 型和 B 型的 EPR 谱。</li>
		<li>使用相应的光谱获取本征光谱参数。即，将光谱线模拟为洛伦兹函数与高斯函数的卷积，其中高斯函数用于近似HOPE探针未分辨的超超精细结构。通过将计算得到的电子顺磁共振（EPR）光谱拟合至实验光谱，可获得参数a的值P 和洛伦兹线宽（&#916;Lpp），由横向弛豫率 1/T 决定2 （其中 1/T2 = (&#8730;3/2)Lpp 用于测量连续波电子顺磁共振（CW EPR）中射频吸收线的导数，以及高斯分布的线宽，G。 
		注意： 以下参数来自按照步骤 1.4.2 中指定条件测得的光谱：aP(A) = 3.63 G，aP(B) = 3.37 G；1/T2(A) = 23.6 mG；1/T2(B) = 9 mG；G(A) = 40 mG；G(B) = 45 mG（参见参考文献）8).</li>
		<li>获取 HOPE 的 EPR 谱 在中等pH值（5 &#60; pH &#60; 8). 模拟所获得的电子顺磁共振（EPR）谱中高场组分，采用参考文献中适用于非耦合或弱耦合体系中多部位间交换的理论19 如前所述18. 利用获得的A态和B态的内禀参数（见步骤1.4.5）以减少变量数目。将计算得到的光谱拟合至实验光谱，以确定A组分的分数（pA），并绘制 p 的依赖关系图A pH值的影响。利用pA 在后续研究中将pH作为pH校准曲线使用。 
		注意： 拟合 pH 依赖性 pA 通过标准滴定曲线可得到解离常数 pK 的值a （HOPE）= 6.98在 体内 研究中，由于需要额外时间采集电子顺磁共振（EPR）谱图中磷超精细分裂的低场与高场组分之间的间隙信号，获取HOPE探针的完整EPR谱图并不现实。因此，在后续示例研究中，仅测量并分析了EPR谱图的高场组分。</li>
		<li>探针校准的 pO2在不同氧气浓度下获取HOPE探针的电子顺磁共振（EPR）谱。</li>
		<li>控制 pO2 通过气体控制器输送的混合气体对溶液进行鼓泡，以调节溶液的值。控制溶液温度（37 &#176;C使用连接至恒温器的水浴装置。</li>
		<li>模拟EPR谱图，并按照步骤1.4.6所述将其拟合至实验谱图，以确定氧诱导弛豫速率的数值。 
		注意： A型和B型HOPE探针的氧诱导弛豫速率值在测量时均为0.49 mG/mmHg 37 &#176;C8.</li>
		<li>为进行[Pi]的探针校准，需在不同磷酸盐浓度下获取HOPE探针的电子顺磁共振（EPR）谱。使用pH值接近pK的HOPE自由基溶液a (pKa = 6.9 时 37 &#176;C)18 并用不同浓度的磷酸盐进行滴定。按照上述步骤中所述，保持温度和气体组成不变。</li>
		<li>模拟EPR谱图，并按照步骤1.4.6所述将其拟合至实验谱图，以确定Pi诱导的交换速率值。 
		注意： Pi诱导的交换速率对[Pi]的依赖性被用于后续研究中的校准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 乳腺癌的小鼠模型
<ol>
	<li>MMTV-PyMT 自发性肿瘤模型
	<ol>
		<li>使用 4–8 周龄雌性 Friend 病毒 B 型易感性/NIH（FVB/N）小鼠乳腺肿瘤病毒启动子（MMTV）多瘤病毒中 T 抗原（PyMT+）小鼠，其已自发形成乳腺肿瘤，用于 体内 EPR 研究。</li>
		<li>为比较正常乳腺组织与肿瘤组织的微环境，使用年龄匹配的同窝雌性小鼠作为对照，该小鼠缺乏 PyMT 癌基因（PyMT−，“野生型”）20。</li>
		<li>在异氟烷麻醉下，每周对小鼠进行一次 L 波段 EPR 波谱分析，持续四周（见下文探针递送方法）。</li>
		<li>使用空气-异氟烷混合气体（3% 异氟烷）麻醉小鼠，并将小鼠置于可调节的实验台上，呈右侧卧位，使肿瘤（乳腺组织）靠近表面线圈谐振器。</li>
		<li>小鼠定位后，通过瘤内（i.t.）注射给予探针，调节 EPR 波谱仪，并采集 5–10 分钟的 EPR 谱图。</li>
		<li>在同一 EPR 检测过程中，测量 2–3 个乳腺肿瘤（来自 MMTV-PyMT+ 小鼠）或无肿瘤的乳腺组织（来自 PyMT− 小鼠）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原位 MET-1 肿瘤模型
	<ol>
		<li>在 37 °C、5% CO2 和 95% 相对湿度条件下，使用含 10% 胎牛血清（FBS）、10 µg/mL 胰岛素、5 ng/mL 重组人表皮生长因子（rhEGF）和 1% PSA（青霉素 G 钠、硫酸链霉素和两性霉素 B）的 DMEM 培养基，在 T175 培养瓶中培养 FVB/N 背景的 Met-1 小鼠乳腺癌细胞，至约 80% 汇合度。</li>
		<li>吸除培养基，并用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）（1.54 mM KH2PO4、155 mM NaCl 和 2.71 mM Na2HPO4-7H2O，不含氯化钙或氯化镁，pH = 7.4）冲洗贴壁细胞。</li>
		<li>加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液并轻轻摇动培养瓶以消化细胞；细胞脱落后，向培养瓶中加入 10 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，收集细胞悬液。</li>
		<li>将细胞悬液在 4 °C 下以 132 × g 离心 10 分钟。使用血细胞计数板计数细胞，并重悬于最低量 DMEM 培养基中，调整浓度为每 100 µL 含 1 × 106 个细胞。</li>
		<li>使用胰岛素注射器（29G1/2 针头），缓慢将 100 µL 肿瘤细胞悬液注射至 8 周龄雌性 FVB/N 野生型小鼠第 4 对乳腺脂肪垫中。</li>
		<li>每隔一天通过触诊监测肿瘤形成情况（约 2–3 周后出现）、肿瘤生长（肉眼观察）及小鼠健康状况（肉眼观察）。</li>
		<li>每周使用游标卡尺测量一次肿瘤尺寸，并利用以下公式计算肿瘤体积： 
		<img alt="图 " src="/files/ftp_upload/56624/56624eq1v2.jpg" /></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 探针递送用于 体内 功能测量
<ol>
	<li>使用颗粒状 LiNc-BuO 探针（方案 I）进行 pO₂ 测量2 通过植入已内化LiNc-BuO微晶的肿瘤细胞，如前所述在原位肿瘤模型中进行测量14,21 如下所述。
	<ol>
		<li>对于MET-1肿瘤模型，为实现LiNc-BuO微晶在MET-1细胞内的内化，将LiNc-BuO微晶悬浮于DMEM中，浓度为20 mg/mL，在冰上将悬液置于5 mL玻璃圆底试管中，使用探头式超声仪在20 kHz、7 W功率条件下超声处理5分钟。</li>
		<li>添加 100 &#181;L 将2 mg LiNc-BuO悬浮液加入含约30%汇合度MET-1细胞的T75培养瓶中，培养液体积为10 mL。所有操作均在生物安全柜中进行，培养基中含青霉素和链霉素以减少潜在污染。</li>
		<li>将细胞置于培养箱中孵育 37 &#176;C 72 小时或直至细胞汇合度达到约 80%。</li>
		<li>吸弃培养基。用10 mL PBS洗涤细胞5次。加入5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。收集细胞。按照上述2.2.4步骤所述条件离心。取部分细胞样品，用台盼蓝染色法检测细胞活率及数量。</li>
		<li>将细胞重悬于浓度为 1 x 106 每 100 &#181;L 最小必需培养基（minimal DMEM）</li>
		<li>使用胰岛素注射器，缓慢注射 100 &#181;L 将含有内化LiNc-BuO微晶的细胞悬液注入8周龄雌性FVB/N小鼠的第4对乳腺脂肪垫中&#160;野生型小鼠，如步骤 2.2.5 中所述。</li>
		<li>按照步骤 2.2.6 和 2.2.7 所述，监测肿瘤的起始与生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在自发性或原位模型中使用颗粒状 LiNc-BuO 探针（方案 II）。将 LiNc-OBu 微晶注射至目标部位， 例如使用胰岛素注射器将，注入正常乳腺组织或乳腺肿瘤中。</li>
	<li>可溶性探针
	<ol>
		<li>使用麻醉机通过吸入空气-异氟烷混合气体（流速1.0 L/min，异氟烷浓度2-3%）对小鼠进行麻醉，并将其放置于电子顺磁共振（EPR）波谱仪的检测间隙中。</li>
		<li>调节仪器，然后注入 NR（10-30 &#181;L，10 mM），HOPE探针（10−30 &#181;L，0.5–2 mM）溶于生理盐水（pH 7.2）或溶于DMSO的RSSR探针10 &#181;L，10 mM）溶液（i.t.）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体内 功能测量
<ol>
	<li>进行电子顺磁共振（EPR）波谱测量时，使用麻醉机通过吸入空气-异氟烷混合气体对小鼠进行麻醉，具体操作如步骤 3.3.1 所述。</li>
	<li>使用 L 波段（1.2 GHz）EPR 波谱仪进行功能测量，步骤如下：
	<ol>
		<li>将表面线圈谐振器放置于正常乳腺组织或乳腺肿瘤表面，并调节波谱仪。</li>
		<li>在植入后数周内，对植入的颗粒探针采集 5−10 分钟的 EPR 谱；对于可溶性探针，则在注射探针后立即采集 5−10 分钟的 EPR 谱。</li>
		<li>分析 NR 探针的 EPR 谱，确定其超精细分裂常数 aN 和信号强度 I(t)。利用步骤 1.2.4 中获得的校准曲线，将 aN 值转换为 pH 值。将信号强度 I(t) 衰减速率分析为相对于初始强度 I(t = 0) 的相对变化，以任意单位每秒（s-1）计算。</li>
		<li>将 GSH 敏感型 RSSR 探针 EPR 谱中单自由基组分的增加拟合为单指数函数，获得指数动力学的时间常数，用于计算 GSH 浓度。</li>
		<li>按照步骤 1.4.5 所述方法，将多功能 HOPE 探针的高场组分 EPR 谱与实验谱进行拟合，得到 pH、pO2 和 Pi 的数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 统计学分析
<ol>
	<li>进行数据处理和统计分析。对于符合正态分布的数据集，使用皮尔逊相关系数检验（Pearson's r Correlation test）；对于数据分布正态性被拒绝的数据集，使用斯皮尔曼等级相关分析（Spearman's Rank Order Correlation）进行相关性分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法可实现对化学肿瘤微环境（TME）关键参数的无创体内评估，这些参数包括pO2、pH、氧化还原状态、间质无机磷（Pi）浓度以及细胞内谷胱甘肽（GSH）浓度。磁共振技术，如磁共振成像（MRI）和低场电子顺磁共振（EPR），是无创体内分析这些TME参数的首选方法。MRI能够可视化解剖结构，但缺乏功能敏感性。相比之下，EPR技术结合功能性自旋探针使用时，可对微环境的局部参数提供功能敏感性。据我们所知，目前尚无其他方法能够在活体受试者中同时评估诸如pO2、pHe、Pi、氧化还原状态和GSH等具有生理重要性的体内化学TME参数。
所描述的实验方案基于使用低场L波段电子顺磁共振（EPR）技术及专门设计的顺磁性探针。文中介绍了四种探针 图1 可被视为一种有效的 体内 肿瘤微环境评估检测。探针的可获得性是所述方法的重要先决条件 体内 EPR ...

肿瘤微环境在癌症进展和治疗中的关键作用正日益受到重视1在实体瘤TME的重要生理参数中，组织缺氧2酸中毒3,4，高还原能力5，细胞内GSH浓度升高6,7，以及间质性无机磷8 有充分记录。非侵入性 体内 pO2pH、Pi、GSH 和氧化还原状态的评估可为肿瘤微环境（TME）中的生物学过程提供独特见解，并有助于推进抗癌药物及靶向 TME 治疗策略的临床前筛选工具。磁共振成像（MRI）和低场电子顺磁共振（EPR）技术在组织中具有合理的射频穿透深度，因此是无创评估这些 TME 参数的最合适方法。MRI 主要依赖于水质子成像，广泛应用于临床环境中以提供解剖学分辨率，但缺乏功能分辨率。磷-31 核磁共振（31基于内源性磷酸盐信号的磷核磁共振（P-NMR）测量细胞外无机磷浓度和pH值在肿瘤微环境表征中具有潜在应用价值，但通常会被高出数倍的细胞内无机磷浓度所掩盖9,10相比之下，电子顺磁共振（EPR）测量依赖于对特异性设计的顺磁性探针进行光谱学检测和成像，从而实现功能分辨率。值得注意的是，外源性EPR探针相较于外源性核磁共振（NMR）探针具有优势，原因在于EPR本身具有更高的内在灵敏度，且不存在内源性背景EPR信号。近年来已开发出一种兼具pH和氧化还原双功能的氮氧自由基探针。11 多功能三苯甲基探针12&#160;提供了无与伦比的机遇 体内 同时测量肿瘤微环境（TME）的多个参数，并进行与探针分布和测量时间无关的相关性分析。据我们所知，目前尚无其他方法可同时评估 体内 活体受试者中具有生理学意义的化学肿瘤微环境参数，例如 pO2pHePi、氧化还原态和谷胱甘肽。
用于 活体 功能测量的探针：
图1展示了用于获取肿瘤微环境（TME）参数的顺磁性探针的化学结构，这些探针包括颗粒型和可溶型探针。体内电子顺磁共振（EPR）测氧中，颗粒型探针因其高功能灵敏度、在活体组织中的稳定性以及极低的毒性等优势而优于可溶型探针。例如，与可溶型探针相比，颗粒型探针在组织植入部位的滞留时间更长，可实现对组织pO2长达数周的纵向测量。另一方面，可溶型探针则在空间分辨测量方面优于颗粒型探针，可通过基于EPR的成像技术实现，并且能够同时分析多种功能参数（pO2、pH、Pi、氧化还原状态和GSH）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg" /> 
图1. 用于肿瘤微环境评估检测的顺磁性探针的化学结构。 包括颗粒状pO2探针LiNc-BuO（R = -O(CH2)3CH3），以及可溶性探针：兼具pH和氧化还原双重功能的探针NR；GSH敏感型探针RSSR；以及可检测细胞外&#160;微环境中的pO2、pH和无机磷酸盐（Pi）的多功能HOPE探针。 这些探针的合成方法已在所提供的参考文献中详细描述11,12。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>L波段电子顺磁共振波谱仪</td><td>德国 Magnettech</td><td></td><td>L波段（1.2 GHz）电子顺磁共振（EPR）波谱仪，用于体外和体内顺磁性分子谱图的采集</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;温度 &amp;和气体控制器&amp;nbsp;</td><td>Noxygen，德国</td><td></td><td>温度 &amp;温度与气体控制器，用于控制和调节温度及气体成分&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH（还原型谷胱甘肽）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&amp;nbsp; 小鼠</td><td>内部</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 小鼠乳腺癌细胞</td><td>内部</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6野生型小鼠&amp;nbsp;</td><td>杰克逊实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝排斥染料&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（IsoFlo）</td><td>雅培实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>sigma-奥德里奇</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>sigma-奥德里奇</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>sigma-奥德里奇</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda 循环器 E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计 Orion</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiNc-BuO 探针</td><td>内部</td><td></td><td>八(正丁氧基)萘菁探针的合成参照文献13进行</td></tr><tr><td>NR探针</td><td>内部</td><td></td><td>硝基氧化物探针根据参考文献11合成。</td></tr><tr><td>RSSR探针</td><td>内部</td><td></td><td>二硝基氧化物探针根据参考文献15合成。</td></tr><tr><td>HOPE &lt;em&gt;探针&lt;/em&gt;</td><td>内部</td><td></td><td>单磷酸化三芳基甲基探针根据参考文献12合成。</td></tr></tbody></table>

体内 epr 评估肿瘤微环境中的 ph、po2、氧化还原状态以及磷酸盐和谷胱甘肽浓度

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

本方案展示了基于低场电子顺磁共振（EPR）技术结合功能性顺磁探针在提供肿瘤微环境（TME）化学特征定量信息方面的应用能力，包括 pO2pH、氧化还原状态、间质无机磷酸盐（Pi）浓度和细胞内谷胱甘肽（GSH）的检测。特别是，一种 recently developed 可溶性多功能三苯甲基探针的应用提供了无与伦比的机会 体内 p的同时测量H, pO2 和 Pi in E细胞外空间（HOPE探针）。使用单个探针测量这三个参数，可实现参数间的相关性分析，且不受探针分布和测量时间的影响。

使用 LiNc-BuO 探针评估组织 pO2：
按照步骤1.1中所述方法，我们对新制备的LiNc-BuO微晶悬浮液进行了校准。 图2 显示了LiNc-BuO探针的典型线宽氧依赖性，以及在缓冲液悬浮体系和雌性C57Bl/6小鼠乳腺肿瘤组织中测得的代表性EPR谱图，肿瘤组织通过注射内化颗粒的细胞诱导成瘤（步骤3.1）。利用线宽校准可计算组织中的氧浓度 pO2 值 （相当于图 (b) 所示光谱的 7.5 mmHg） 图2).
<p class="jove_content...

采用可溶性硝酰基和三苯甲基探针，利用低场（L波段，1.2 GHz）电子顺磁共振技术，对乳腺癌小鼠模型肿瘤微环境中具有生理学意义的参数进行评估。

体内 EPR 评估肿瘤微环境中的 pH、pO2、氧化还原状态以及磷酸盐和谷胱甘肽浓度

本方案展示了基于低场电子顺磁共振（EPR）技术与功能性顺磁性物质联用的能力……

该体内电子顺磁共振技术的总体目标是在癌症动物模型的临床前研究中，对局部组织微环境中的生理相关参数进行定量且无创的评估。该技术基于氟化场APR与特殊设计的功能性顺磁探针相结合，可提供有关组织氧合状态、休眠状态下的循环肿瘤细胞（CDT）、间质有机磷酸盐及细胞内浓度的定量信息。这种无创技术为深入了解肿瘤微环境及肿瘤发生过程提供了独特视角，可能有助于未来针对肿瘤微环境的抗癌治疗策略的合理设计。该技术的应用拓展了多功能APR探针参数与大脑之间关联的研究，从而为潜在的生物学机制提供了进一步的见解。除我本人和Andrey之外，参与演示该实验操作的还包括Marieta Gencheva、Dr. Benoit Driesschaert，以及来自IMMR中心的研究生Kayla Steinberger。制备颗粒状氧敏感探针时，首先称取60毫克微晶。为进行氧敏感性校准，将微晶悬浮于3毫升Dolbecco改良Eagle培养基中。在5毫升玻璃圆底试管中，将样品置于冰上，使用探头式超声仪以7瓦功率、20千赫频率超声处理5分钟。接下来，将1毫升超声处理后的微晶放入L波段EPR波谱仪的表面线圈谐振器中的玻璃管内。在37摄氏度的生理温度下，分别在氧浓度为0、1、2、4、8和20.9%的条件下采集连续波EPR谱。为制备兼具pH和氧化还原双功能的探针，将6.34毫克探针溶解于1毫升生理盐水中。使用 pH 计，通过逐次加入少量盐酸或氢氧化钠，将 pH 值调节至 7.2。为进行硝酰探针的 pH 校准，首先将 0.1 毫升探针储备液加入到 0.9 毫升的 2 毫摩尔磷酸钠缓冲液（含 150 毫摩尔氯化钠）中。然后使用 pH 计，通过逐次加入盐酸或氢氧化钠，将所得的 1 毫摩尔探针溶液滴定至所需 pH 值。使用L波段电子顺磁共振（EPR）波谱仪，记录样品在1.5毫升微量离心管中的EPR谱图。为制备对谷胱甘肽（GSH）敏感的RSSR探针，将4.05毫克探针溶解于1毫升DMSO溶液中。接下来，测定RSSR与GSH反应的速率常数。为此，首先将20微升RSSR储备液加入0.98毫升含1毫摩尔磷酸缓冲液（pH 7.2）和150毫摩尔氯化钠的溶液中，配制成0.2毫摩尔的RSSR探针溶液。然后将等体积的0.2毫摩尔RSSR溶液与其中一种GSH溶液混合，使探针的终浓度为0.1毫摩尔，GSH的终浓度分别为0.5、1或2.5毫摩尔。RSSR溶液与GSH溶液混合后立即放入EPR谐振腔中，每12秒记录一次EPR谱，持续10分钟。然后计算多功能HOPE探针在检测氧、pH和无机磷酸盐（Pi）时单自由基谱幅增加的动力学。将10.7毫克探针溶解于1毫升生理盐水中，并将pH调节至7.4。随后，取20微升上述配制的储备液加入0.98毫升生理盐水中，得到0.2毫摩尔的探针溶液。对于pH探针校准，通过加入少量氢氧化钠或盐酸滴定0.2毫摩尔的探针

in-vivo-epr-assessment-ph-po2-redox-status-concentrations-phosphate

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

体内在肿瘤微环境中 pH 值、 pO2、氧化还原状态、磷酸盐和谷胱甘肽浓度的 EPR 评价

在乳腺癌脑转移小鼠模型中，利用生物发光成像技术监测缺氧诱导因子-1α活性，以观察颅内肿瘤缺氧的发展过程。...

in vivo 生物发光成像技术在小鼠模型中对乳腺癌脑转移瘤缺氧动态的观察

此处，结合实时监测肿瘤细胞代谢， 体内 用于评估新型抗癌靶点或药物能否增强肿瘤细胞对DNA损伤类化疗药物敏感性的转移模型，包括鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型。...

评估癌症药物增敏效果 体外 和 体内

一种新的电子顺磁共振（EPR）方法——快速扫描EPR（RS-EPR）被用于二维光谱空间成像，该方法优于传统的连续波（CW）技术，并为相关研究开辟了新的途径 体内 成像。结果在250...

快速扫描电子顺磁共振为生理重要参数的成像开辟了新途径 体内

本文描述了一种动物模型的建立，该模型可用于直接检验肿瘤缺氧对转移的影响，并解析其作用机制。尽管本文所述实验主要针对尤文肉瘤，但类似方法也可应用于其他类型的肿瘤。...

体内 模型用于检测缺氧对肿瘤转移的影响

我们介绍一种非侵入性的体内成像方案，该方案流程简化且成本效益高，利用化学发光的鲁米诺类似物L-012，对小鼠全层皮肤缺损伤口模型中产生的活性氧（ROS）进行可视化和定量分析。...

体内成像小鼠伤口模型中的活性氧

电子顺磁共振（EPR）波谱法是检测自由基的明确方法。利用特异性自旋探针，可实现对细胞不同区室中自由基的检测。本文介绍一种实用且高效的生物样本采集方法，便于样本的处理、保存和转移，以进行EPR测量。...

在室温和77 K条件下对生物样品进行电子顺磁共振研究的应用

我们描述了两种方法，用于评估与转移微环境（TMEM）通道功能及癌细胞内渗相关的短暂性血管通透性，该方法通过向小鼠静脉注射高分子量（155...

利用活体成像与固定组织分析评估与癌细胞播散相关的转移门户介导的血管通透性肿瘤微环境

我们开发了一种可重复的方法，以高细胞分辨率可视化非水解性荧光三磷酸腺苷（ATP）（一种ATP类似物）的内化过程。我们使用独立的实验验证了该方法 体外 和 体内 人肿瘤细胞系和移植人肿瘤组织的免疫缺陷小鼠的检测。...

通过大胞饮作用介导的ATP内化在人肿瘤细胞及肿瘤异种移植小鼠中的荧光显微镜检测

我们描述了一种用于培养、维持及可视化已转移至腹膜表面的人类癌症组织的实验方案。切除的肿瘤标本使用振动切片机进行切割，并在可渗透性插入式培养装置中进行培养，以增强氧气供应并提高细胞存活率，随后通过共聚焦显微镜和流式细胞术进行成像及后续分析。...

培养与成像 离体 从切除的人类肿瘤标本制备类器官型腹膜假黏液瘤组织切片

采用脉冲电子顺磁共振技术对小鼠肿瘤的定量三维氧分布图进行了无创成像。利用超声B型成像和能量多普勒成像获取解剖结构和血管结构信息。将两种模态的图像叠加，实现多参数肿瘤分析。...

肿瘤缺氧评估：通过电子顺磁共振进行体内三维氧成像

了解利用低场电子顺磁共振技术在小鼠乳腺癌模型中无创定量评估肿瘤微环境的氧分压、pH值、氧化还原状态及代谢物浓度的方法。该技术为靶向抗癌治疗设计提供重要依据。

体内 EPR 评估肿瘤微环境中的 pH、pO₂、氧化还原状态以及磷酸盐和谷胱甘肽浓度

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