Name: 单核靶向肽 Amphiphile 胶束合成动脉粥样硬化的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习合成单核细胞靶向肽两亲性胶束用于动脉粥样硬化成像的方法。该技术通过MCP-1肽增强靶向特异性，可区分早期与晚期动脉粥样硬化斑块，为心血管疾病诊断提供新途径。

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作者感谢南加州大学、国家心肺血液研究所（NHLBI，项目编号R00HL124279）、Eli和Edythe Broad创新奖以及授予EJC的L.K. Whittier基金会非癌症转化研究奖所提供的经费支持。作者感谢南加州大学电子显微镜与微分析中心、纳米生物物理学卓越中心、分子表征卓越中心以及转化成像中心在仪器设备方面的协助。

注意：请阅读试剂的材料安全数据表（MSDS），并遵守所在机构规定的全部化学品安全措施。
1. MCP-1 巨噬细胞活化肽的制备
<ol>
	<li>MCP-1 肽的制备
	<ol>
		<li>称取0.25 mmol Fmoc-L-Lys(Boc)-Wang于反应瓶（RV）中。在通风橱内，用5 mL二甲基甲酰胺（DMF）冲洗反应瓶内壁。</li>
		<li>将RV装载到自动台式多肽合成仪上。从C端到N端依次装载预包装的氨基酸小瓶：N'-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-C'。在最后添加一个空瓶，用于最终的脱保护步骤。 
		注意：也可使用相同方案合成序列为 N'-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C' 的乱序肽。</li>
		<li>合成完成后，将反应瓶中的树脂肽用2-3 mL甲醇转移至闪烁瓶中，确保所有树脂均被转移。待树脂沉降至瓶底后，吸除甲醇上清液，并将残留液体蒸发至干燥。再于室温下真空干燥2小时或过夜。</li>
		<li>在通风橱中配制 12 mL 裂解液，其中三氟乙酸（TFA）: 乙二硫醇 : 水 : 三异丙基硅烷的体积比为 94 : 2.5 : 2.5 : 1。轻轻旋动混合裂解液，确保其充分混匀。 
		注意：由于三异丙基硅烷和乙二硫醇对空气敏感，在将三异丙基硅烷和乙二硫醇的储备瓶重新盖紧前，需用氩气吹扫1分钟。</li>
		<li>将合成容器（SV）夹在振荡器臂上，夹持位置靠近SV的下半部分。用2 mL裂解液将肽树脂转移至SV中，确保所有肽树脂均被转移。</li>
		<li>用3 mL裂解液冲洗SV管壁。盖紧SV管盖，以300次/分钟振荡反应4小时。</li>
		<li>称量一个空的50 mL离心管，记录质量。</li>
		<li>孵育4小时后，将SV柱中的裂解肽溶液收集至50 mL离心管中。用剩余的裂解液多次冲洗SV柱。</li>
		<li>用氮气吹干离心管中的裂解肽溶液，直至剩余体积少于4 mL。</li>
		<li>向肽段裂解液中加入36 mL预冷的乙醚。</li>
		<li>将溶液涡旋振荡至完全呈白色或黄色。在 4 °C 条件下以 3,000 x g 离心 5 分钟，倾去上清液。</li>
		<li>加入40 mL预冷的乙醚至试管中。涡旋振荡并再次超声处理。重复离心步骤。倾去上清液。</li>
		<li>用氮气吹扫粗PA沉淀，直至乙醚完全挥发。</li>
		<li>加入20 mL双蒸水，涡旋混匀，并超声处理直至多肽完全溶解于溶液中。</li>
		<li>将溶液冷冻并冻干至干燥。</li>
		<li>肽干燥后，称量含有粗肽的离心管质量。将粗肽溶解于水中，使其浓度为5 mg/mL。</li>
		<li>将25 mg粗制MCP-1肽溶解于5 mL双蒸水中，配制成终浓度为5 mg/mL的溶液。使用C8反相柱，以含0.1%三氟乙酸的水溶液（流动相A）和含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液（流动相B）为流动相，通过高效液相色谱法（HPLC）纯化粗制MCP-1肽。将5 mL肽溶液注入HPLC系统。 
		注意：初始流动相为100%溶剂A，流速为9.0 mL/min。在27分钟内将溶剂A缓慢降低至30%，并在此比例下保持3分钟。随后在3分钟内将梯度恢复至100%溶剂A，并在此比例下保持1分钟，总运行时间为34分钟。柱温保持在55 °C。分析时采用正离子源模式。若三氟乙酸（TFA）对HPLC柱过于酸性，可使用甲酸替代TFA。建议有机相组成梯度上升速率不超过2%/min，以获得更好的分离效果。</li>
		<li>使用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱分析各组分，检测预期产物在 m/z 2,890 处的信号。 
		注意：将α-氰基-4-羟基肉桂酸以1 mg/mL的浓度溶于乙腈/水（50:50，体积比）中，配制基质溶液。取0.75 µL基质溶液点样至MALDI靶板，随后加入0.75 µL各组分样品。采用正离子反射模式进行质谱分析，质量扫描范围为500–5,000 Da。</li>
		<li>合并产物组分，吹干乙腈，冷冻后将纯化后的多肽冻干至干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MCP-1 PA 的制备
	<ol>
		<li>准备1.2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺的1.1摩尔过量N-[氨基聚乙二醇-2000] DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺与多肽分别置于不同的闪烁瓶中。用双蒸水溶解两种化合物，配制成约15 mg/mL的溶液。超声处理15分钟，或直至两种溶液完全澄清。 
		注意：DSPE-PEG(2000)-Cy5 的合成采用与 DSPE-PEG(2000)-胺和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能化 Cy5 相同的方案，仅第 1.2.3 步不同，该步中将溶液 pH 值调节至 8.5。</li>
		<li>将DSPE-PEG(2000)-maleimide溶液加入肽溶液中。涡旋混匀并超声处理。</li>
		<li>逐滴加入1 M NaOH（每次1 µL），直至溶液pH达到7。</li>
		<li>用氮气吹扫溶液5分钟。搅拌溶液过夜。</li>
		<li>将溶液冷冻并冻干至干燥。</li>
		<li>待粗产物干燥后，将固体溶于水中，配制成浓度为5 mg/mL的溶液。</li>
		<li>按照上述方法通过高效液相色谱进行纯化。 
		注意：游离肽和DSPE-PEG(2000)应在15–30%有机相比例（体积分数）范围内洗脱，而DSPE-PEG(2000)-MCP-1偶联物应在40–50%有机相比例范围内洗脱。</li>
		<li>使用 MALDI 质谱分析各组分对应的 m/z。DSPE-PEG(2000)-MCP-1 应在 m/z 5,760 处呈现一个宽峰。 
		注意：对于 DSPE-PEG(2000)-MCP-1 的 MALDI 分析，2,5-二羟基苯甲酸最适合作为基质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MCP-1 PAMs 的组装
	<ol>
		<li>在1-dram小瓶中，将1.75 mg MCP-1 PAs溶于3 mL甲醇中。超声处理至MCP-1 PAs完全溶解。 
		注意：对于成像应用，可将Cy5两亲分子以10:90的摩尔比（MCP-1 PA）掺入。</li>
		<li>在氮气氛围下沿圆周运动蒸发甲醇，同时用甲醇冲洗小瓶壁，直至瓶底形成均匀的薄膜。将薄膜真空干燥过夜。</li>
		<li>用 3 mL 水或磷酸盐缓冲液（PBS）水合薄膜，配制成 100 µM 的 MCP-1 PAMs 溶液。轻轻涡旋并超声处理溶液至澄清。在 80 °C 下孵育 30 分钟。 
		注意：升高温度已被证明可加速自组装过程，使肽组分形成最稳定的二级结构，同时降低临界胶束浓度（CMC）。42,43.</li>
		<li>将所得分散液冷却至室温。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. MCP-1 正向别构调节剂的表征
<ol>
	<li>动态光散射（DLS）和zeta电位
	<ol>
		<li>根据DLS或zeta电位仪器的说明，将100 µM的MCP-1 PAM或乱序PAM放入比色皿中。 
		注意：DLS和zeta电位所用的比色皿可能因仪器说明而异。</li>
		<li>使仪器平衡至室温，测定PAM的粒径和表面电荷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）
	<ol>
		<li>将7 µL的50 µM MCP-1 PAM或乱序PAM加到固定在自闭合镊子中的TEM载网上，孵育5分钟，用精细擦拭纸吸去液滴。</li>
		<li>加入7 µL水清洗载网，吸去液滴。</li>
		<li>加入7 µL的1 wt%磷钨酸溶液，作用2分钟，吸去液滴，重复步骤2.2.2。</li>
		<li>在进行TEM分析前将TEM载网干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>圆二色（CD）光谱
	<ol>
		<li>使用仪器前，提前开启氮气5–10分钟。</li>
		<li>在比色皿中加入300 µL空白溶液（水或PBS）。</li>
		<li>在室温下，以190–265 nm波长范围、0.2 mm光程、1 s积分时间和1 nm带宽采集光谱，重复测量3次。</li>
		<li>在与步骤2.3.3相同的条件下，测量100 µM MCP-1肽、MCP-1 PAM、乱序肽和乱序PAM，并扣除空白值。</li>
		<li>使用聚赖氨酸基光谱的线性插值法拟合数据。</li>
		<li>关闭仪器，关闭仪器后等待10分钟再关闭氮气。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体外 MCP-1 别构调节剂的分析
<ol>
	<li>体外 生物相容性
	<ol>
		<li>在补充有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和0.05 mM 2-巯基乙醇的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养并扩增WEHI 274.1小鼠单核细胞至第5代。 
		注：WEHI 274.1为悬浮细胞。培养时应每隔2–3天更换一次培养基。</li>
		<li>将含细胞的培养基用移液器转移至无菌50 mL离心管中，在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸除旧培养基，并在离心管中加入10 mL新鲜培养基重悬细胞。缓慢混匀直至细胞均匀分散。使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>将细胞稀释至每孔90 µL培养基中含有4,000个单核细胞，每孔加入90 µL细胞悬液至96孔板中。孵育24小时。 
		注：避免使用96孔板外周的孔，以减少蒸发和温度变化带来的差异。外周孔中加入100 µL PBS。</li>
		<li>在分别灭菌的微量离心管中，将0.15 µmol MCP-1肽、MCP-1 PAM、错序肽或错序-PAM溶于150 µL PBS中。进行系列稀释，制备每种样品浓度为1、10和100 µM的溶液各65 µL。</li>
		<li>将各浓度样品10 µL加入含有WEHI 274.1细胞的孔中（每孔总体积100 µL，共6行，总计96孔）。孵育72小时。</li>
		<li>每孔加入10 µL MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑）。孵育1小时。</li>
		<li>使用酶标仪在490 nm波长下或根据制造商说明检测吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 胶束结合实验
	<ol>
		<li>在6孔板每孔中加入2 mL含100 µM Cy5标记的MCP-1 PAM（DSPE-PEG(2000)-Cy5与MCP-1 PA摩尔比为10:90）的培养基，接种500,000个单核细胞。孵育1小时。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟收集WEHI 274.1细胞，吸除上清液。</li>
		<li>用2 mL PBS重悬并洗涤细胞，4 °C下以300 × g离心5分钟，吸除PBS。重复用2 mL PBS洗涤一次，吸除PBS。</li>
		<li>加入2 mL冷的4%多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将固定后的细胞用移液器转移至6孔板内无菌玻璃盖玻片上，在400 × g下离心5分钟。</li>
		<li>去除多聚甲醛，用2 mL PBS洗涤并冲洗一次。用1 mL PB重悬。 
		注：冲洗时避免破坏盖玻片上的细胞。</li>
		<li>在载玻片上滴加10 µL含90%甘油的PBS溶液。使用针头和镊子小心取出盖玻片，擦干边缘，轻轻将盖玻片细胞面向下放置于载玻片上。</li>
		<li>用透明指甲油轻轻封固盖玻片边缘，置于冰箱中冷藏，待成像时取出。</li>
		<li>使用配备Cy5激发波长（λexcitation = 650 nm）激光器的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

MCP-1 PAM 是一种前景广阔的分子成像平台，由亲水性靶向肽和驱动纳米颗粒自组装特性的疏水性尾部组成。这种靶向单核细胞的胶束可通过简单的合成与纯化步骤制备 MCP-1 肽和 DSPE-PEG(2000)-MCP-1。PAM 具有多种适用于体内分子成像的优良特性，例如可在温和条件下自组装、具有内在的可生物降解性，以及结构和化学多样性，从而能够整合其他成像基团或靶向肽，实现向特定目标部位的选择性递送。通过改变肽段、疏水性尾部或胶束浓度，可调节其粒径、形状和组成，从而为多种应用提供最优的化学和物理性质22,33。
本方案存在一些局限性，需予以说明。首先，由于PAMs依赖疏水相互作用驱动，因此必须构建亲水性的靶向肽，以使靶向部分能够暴露于胶束表面。如果肽序列本身具有疏水性，可在C端添加一至两个亲水性氨基酸进行调整，但氨基酸的添加可能影响肽在胶束内部的二级结构，从而改变其在天然蛋白状态下的性质44...

心血管疾病仍然是全球主要的死亡原因， worldwide每年约有1730万人死于心血管疾病1。心血管疾病的发生与动脉粥样硬化有关，这是一种动脉内斑块积聚的病理状态，会阻碍血液和氧气向身体细胞的输送2,3。动脉粥样硬化的发展过程涉及动脉的增厚与硬化，由炎症反应、脂质代谢紊乱以及斑块积聚共同驱动，最终可能导致斑块破裂和心肌梗死4,5。内皮细胞表达多种细胞因子和黏附分子，其中包括单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），后者可与单核细胞表面的C-C趋化因子受体（CCR2）结合6,7,8。在斑块形成的早期阶段，氧化型胆固醇促使单核细胞转化为巨噬细胞，从而放大局部的炎症反应，导致组织损伤，并形成不稳定或易损斑块9,10。
传统上，动脉粥样硬化通过血管造影或超声等解剖成像技术评估管腔狭窄程度来判断11,12。然而，这些方法仅能检测动脉壁的严重狭窄，无法识别动脉粥样硬化的早期阶段，因为早期斑块生长会引发动脉重塑，以维持血管直径和血流速度12,13,14。因此，血管造影会低估动脉粥样硬化的实际患病率。此外，近年来单光子发射计算机断层扫描、正电子发射断层扫描和磁共振成像等非侵入性成像技术已被用于表征斑块形态，因其可提供斑块的初步细节和特征信息。然而，这些成像方式常受限于灵敏度不足、空间分辨率较低，或需要使用电离辐射，使得在不同阶段对斑块进展进行成像更加困难15,16,17。目前仍缺乏一种能够特异性识别动脉粥样硬化各阶段斑块的成像递送系统。
纳米颗粒已显示出成为一种新兴平台的潜力 体内 斑块靶向与诊断18,19,20,21特别是，PAMs 因其化学多样性以及能够容纳多种基团、组成、尺寸、形状和表面功能化而具有优势22. 肽两亲分子（PAs）由亲水性肽段和疏水性尾部组成 &#34;头部基团&#34; 连接疏水性尾链，通常为脂质；这种两亲性结构赋予其自组装能力，并可在颗粒表面多价展示肽段22,23,24肽的头部基团可通过肽之间的折叠和氢键作用影响颗粒的形状25已发现通过β-折叠相互作用折叠的肽可形成棒状胶束，而α-螺旋构象则可形成球形和棒状胶束22,23,24,25,26,27在亲水性肽段与PAMs的疏水性尾部之间可引入聚乙二醇（PEG）连接臂，以屏蔽肽段表面电荷，从而增强纳米颗粒在体循环中的可利用性28,29,30,31PAMs 的优势还在于其具有生物相容性，并已证明具有广泛的应用范围32,33胶束的水溶性相较于其他基于纳米颗粒的系统具有优势，例如某些不溶于水的聚合物纳米颗粒，后者必须悬浮在增溶剂中才能用于注射34此外，由于能够制备出在特定刺激下发生解离的PAMs，使其成为可控的细胞内药物递送的理想候选载体35.
通过与CCR2受体结合并在主动脉弓中聚集，PAMs既往已被开发用于靶向单核细胞，以监测主动脉中动脉粥样硬化病变的不同阶段9。在ApoE-/-小鼠中，单核细胞的聚集程度与斑块进展呈正比36。此外，研究发现，具有易破裂的晚期斑块的患者体内单核细胞含量更高37。因此，将PAMs进行修饰以整合MCP-1具有重要意义，因为它能够提高靶向特异性，并区分动脉粥样硬化的早期与晚期病变。这些概念验证研究还证实，PAMs具有足够的安全性可用于临床前研究，并可通过肾脏清除38。由于单核细胞浸润和炎症反应也存在于其他多种疾病中，MCP-1 PAMs有望被应用于动脉粥样硬化以外其他疾病的治疗与诊断8,39,40,41。
本文报道了一种高度可扩展且自组装的 MCP-1 PAMs 的制备方法，该颗粒在动脉粥样硬化成像应用中表现出最佳的粒径、表面电荷以及对单核细胞的特异性靶向能力。

<table><tbody><tr><td>1,2-乙二硫醇</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>10 mL 一次性血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯离心管</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>用于多种应用</td></tr><tr><td>2,5-二羟基苯甲酸，99%</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AC165200050</td><td>用于基质辅助激光解吸电离（MALDI）</td></tr><tr><td>25 mL 一次性血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇，50 mM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31350010</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>5 mL 一次性血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>用于多种应用</td></tr><tr><td>75 cm² 培养瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-680-65</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>75 mL 反应容器</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>用于 MTS 检测</td></tr><tr><td>乙腈，HPLC 级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A998SK-4</td><td>用于 HPLC 纯化</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃，1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>用于 PAM 合成</td></tr><tr><td>长尖头硼硅酸盐玻璃移液管</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>用于多种应用</td></tr><tr><td>盖玻片，0.16–0.19 mm，22 × 22 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-542B</td><td>用于共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>Cy5 胺</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>用于多肽偶联</td></tr><tr><td>乙醚，ACS 级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>E138-1</td><td>用于多肽沉淀</td></tr><tr><td>一次性注射器，20 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-817-54</td><td>用于 HPLC 纯化</td></tr><tr><td>双纽鲍计数板</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) 胺</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>用于多肽偶联</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) 马来酰亚胺</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>用于多肽偶联</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS 酯&amp;nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>用于与 Cy5 偶联</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基-高葡萄糖</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>D5796-500ML</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10438026</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-Wang 树脂，100–200 目</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>甲酸，Optima LC/MS 级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A117-50</td><td>用于 HPLC 纯化</td></tr><tr><td>甘油</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>用于共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>手动计数器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S90189</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>磁力搅拌子，卵形</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>用于多肽偶联</td></tr><tr><td>甲醇，ACS 认证级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A412-4</td><td>用于 PAM 合成</td></tr><tr><td>MTS 细胞增殖比色法检测试剂盒</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>用于 MTS 检测</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺，测序级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1160-4</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>N-甲基吗啉</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AC416780250</td><td>用于固定细胞</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010049</td><td>用于多种应用</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素，10,000 U/mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>多肽合成容器，25 mL&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>CG186011</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>磷钨酸&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A248-25</td><td>用于透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>哌啶</td><td>Spectrum</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>普通载玻片，75 × 25 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-550-A3</td><td>用于共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>无菌试剂储液槽&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>自闭合镊子</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>用于透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>TEM 支持膜</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>用于透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>三氟乙酸&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP618-500</td><td>用于多肽裂解和 HPLC 纯化</td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>用于多肽裂解</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>通用锯齿镊</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>用于共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;CRL-1679</td><td>小鼠单核细胞</td></tr><tr><td>自动化台式多肽合成仪</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 台式多肽合成仪</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸，99%</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>476870-2G</td><td>用于基质辅助激光解吸电离（MALDI）</td></tr></tbody></table>

用于动脉粥样硬化成像的靶向单核细胞肽两亲性胶束的合成

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要成因，而心血管疾病是全球首要死因，每年导致1730万人死亡。动脉粥样硬化也是猝死和心肌梗死的主要原因，其由不稳定的斑块破裂并突然阻塞血管所引发。目前的成像技术无法区分稳定斑块与易破裂的不稳定斑块。肽两亲性胶束（PAMs）可克服这一局限，因其可被修饰多种靶向基团，特异性结合病变组织。研究表明，单核细胞是动脉粥样硬化的早期标志物，大量单核细胞聚集与易破裂斑块相关。因此，靶向单核细胞的纳米颗粒可用于区分动脉粥样硬化的不同阶段。为此，本文描述了一种靶向单核细胞的PAMs（单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）PAMs）的制备方案。MCP-1 PAMs在温和条件下合成并自组装形成直径约15 nm、表面电荷接近中性的纳米颗粒。 体外, PAMs 具有良好的生物相容性，并对单核细胞具有高结合亲和力。本文所述方法在动脉粥样硬化及其他炎症性疾病的一系列应用中展现出良好前景。

MCP-1 PAM 的制备 
将 MCP-1 蛋白的 CCR2 结合基序（氨基酸残基 13-35）[YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] 或随机肽段 [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] 在 N 末端添加一个半胱氨酸残基进行修饰。采用 Fmoc 介导的固相合成法，使用自动多肽合成仪合成 MCP-1 肽段。粗产物通过 C8 柱反相高效液相色谱（HPLC）在 50 °C 条件下，以含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的乙腈/水混合液进行纯化，并通过基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱进行表征（图 1）。含半胱氨酸的肽段通过硫醚键与 DSPE-PEG2000-马来酰亚胺偶联，生成 DSPE-PEG(2000)-肽段偶联物。室温反应 24 小时后，粗产物通过 HPLC 进行纯化（图 2）。DSPE-PEG(2000)-Cy5 通过 NHS 酯反应合成。将 DSPE-PEG(2000)-MCP-1 与 ...

本文介绍了一种涉及单核细胞靶向肽两亲性分子胶束的合成与表征方法，以及用于检测该胶束生物相容性和与单核细胞结合能力的相应实验方案。

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要诱因，而心血管疾病是全球首要死因，每年导致1730万人死亡。

本实验方案的总体目标是合成用于动脉粥样硬化成像的单核细胞靶向肽两亲性分子胶束。该方法有助于回答心血管领域中关于动脉粥样硬化斑块诊断成像的关键问题。该技术的主要优势在于，将肽两亲性分子胶束与MCP-1结合，可实现更高的靶向特异性，并能区分早期与晚期动脉粥样硬化病变。该技术的应用可延伸至动脉粥样硬化不同阶段斑块的诊断，因为易发生破裂的晚期斑块患者体内的单核细胞数量更高。尽管该方法可为动脉粥样硬化的研究提供见解，也可应用于其他疾病，例如癌症。将与我共同演示该实验操作的是来自我们实验室的研究生 Jonathan Wang。首先，在反应容器中称取 0.25 毫摩尔的 fmoc-L-赖氨酸-bach-wong-树脂。将容器转移至化学通风橱中，并用 5 毫升二甲基甲酰胺冲洗容器内壁。将反应容器以及从C端到N端的预装氨基酸试剂瓶装载到自动台式多肽合成仪上，末端需包含一个空瓶，用于最后的脱保护步骤。完成合成反应后，将反应容器中的多肽和树脂转移至含有两到三毫升甲醇的闪烁瓶中，直至所有树脂均被转移。待树脂沉降至瓶底后，吸除上清液，使树脂在空气中自然干燥，随后在室温下进行真空干燥至少两小时。当闪烁瓶完全干燥后，使用夹具将合成装置的下半部分固定在摇臂上，并向闪烁瓶中加入两毫升裂解溶液。将肽树脂的全部体积转移至合成容器中，并用三毫升新鲜裂解液冲洗容器内壁。然后将容器盖紧，于300次/分钟振荡条件下反应四小时。振荡孵育结束后，将裂解后的肽溶液收集至已称重的50毫升锥形管中，并用剩余的裂解液多次冲洗合成容器。用氮气吹干裂解后的肽溶液，直至离心管中剩余溶液体积少于四毫升，然后向裂解后的肽溶液中加入36毫升冰乙醚。涡旋振荡所得溶液。当悬浮液完全变为白色或黄色时，通过离心沉淀肽。 将肽重新悬浮于40毫升预冷的乙醚中，再次涡旋并超声处理肽溶液。经过第二次离心并倾去上清液后，用氮气吹扫粗肽两亲性分子沉淀物以使其干燥。当乙醚明显蒸发后，向试管中加入20毫升重蒸水，涡旋并超声处理试管，直至肽完全溶解于溶液中。将溶液冷冻并冻干至干燥。然后再次称量离心管，将粗肽溶解于水中，浓度为每毫升五毫克。接着，将全部粗MCP-1肽溶液注入高效液相色谱仪（HPLC）中。使用基质辅助激光解吸电离质谱法分析各组分，检测预期产物在质荷比 2,890 处的信号。然后合并含有产物的组分。吹干乙腈，将纯化后的多肽冷冻并冻干至完全干燥。为制备MCP-1肽两亲分子（peptide amphiphiles，PAs），首先将冻干的肽溶解于水中，浓度为15毫克/毫升，并将该肽溶液与15毫克/毫升的DSPE-PEG 2000胺反应性脂质溶液混合。逐滴加入一当量氢氧化钠，直至溶液pH值达到7。随后用氮气吹扫5分钟，再持续搅拌过夜。第二天早晨，将溶液冷冻并冻干。当粗产物干燥后，将固体溶解于水，配制成每毫升含五毫克的溶液，并按前述方法通过高效液相色谱法纯化该肽。为制备PA膜，取1.75毫克MCP-1 PAs溶解于3毫升甲醇中，置于1 dram小瓶内，超声处理直至MCP-1 PA完全溶解。在氮气条件下旋转小瓶使其做圆周运动，同时将残留的甲醇从瓶壁上冲洗下来，蒸发甲醇至瓶底形成均匀的薄膜。将薄膜真空干燥过夜。次日早晨，加入三毫升水水合薄膜，配制成100微摩尔的MCP-1 PAM溶液，并轻轻涡旋振荡并超声处理溶液至澄清。将溶液在 80 摄氏度下孵育 30 分钟，然后冷却所得分散液。在接下来的代表性实验中，使用乙腈-水混合物中含 0.1% 三氟乙酸的条件，在 50 摄氏度下通过 CA 柱反相高效液相色谱纯化 MCP-1 和随机肽，并如前所示通过基质辅助激光解吸电离质谱法进行表征。将含有半胱氨酸的多肽通过硫醚键偶联至DSPE-PEG 2000 二酰胺上，生成DSPE-PEG 2000 多肽偶联物，并使用C4柱通过高效液相色谱法进行纯化。对靶向单核细胞的PAMs进行动态光散射分析和透射电子显微镜成像，结果显示其为分散性良好的球形纳米颗粒，且具有轻微正电的Zeta电位。圆二色光谱分析证实，MCP-1多肽被成功整合到胶束中，并增强了其二级结构。将单核细胞与浓度高达100微摩尔的MCP-1肽、MCP-1肽两亲分子（PAM）、错序肽及错序PAM共孵育72小时，结果表明这些肽具有良好的细胞活力和生物相容性。通过共聚焦显微镜可进一步确认单核细胞对MCP-1 PAM的特异性结合能力，相较于错序PAM表现出明显差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过MCP-1肽的合成与纯化，以及MCP-1肽两亲分子的制备和胶束组装，来构建靶向单核细胞的肽两亲分子胶束体系。请务必注意，使用化学试剂可能具有极高危险性，操作此类材料时，必须采取预防措施，例如阅读材料安全数据表（MSDS），并在化学通风橱内进行操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

单核靶向肽 Amphiphile 胶束合成动脉粥样硬化的研究

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利用小分子CLT1肽靶向对比剂进行前列腺癌的MR分子成像

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我们展示了用于癌症光声成像的含金纳米棒细胞载体的制备方法，并探讨了其可行性。...

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一种简便高效的可逆二硫键交联胶束制备方法

病毒来源的肽段与抗体偶联物（ACs）相结合是一种日益受到关注的方法，因其具有增强分子载荷在肿瘤细胞内蓄积的潜力。本实验方案利用常规方法评估肽段偶联效率、抗体偶联物及其载荷在细胞内的积累情况以及肿瘤靶向性，可为研究人员在关键的早期研发阶段提供支持。...

利用病毒衍生肽修饰抗体偶联物的初步评估：提高细胞摄取与增强肿瘤靶向性

单核细胞在周围动脉疾病背景下对动脉生成具有重要的介导作用。本方案利用基底膜样基质和活体显微技术，在股动脉结扎小鼠模型中研究单核细胞注射后的单核细胞归巢及肿瘤相关血管生成。...

小鼠外周动脉疾病模型中单核细胞归巢与肿瘤相关血管生成的活体显微成像

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慢性炎症状态下单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成的定量分析

本文介绍了一种在小鼠模型中定量检测血液单核细胞趋化活性的实验方案，用于评估营养、药物和遗传干预对血液单核细胞的影响，并利用单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）负载的基底膜来源凝胶塞来表征小鼠模型中由血液单核细胞衍生的巨噬细胞。...

体内单核细胞趋化活性的定量分析及血液单核细胞来源巨噬细胞的表征

本文描述了利用自组装三维支架培养人类神经前体细胞的方法。我们提供了一种从支架中释放细胞的方案，以便后续对细胞进行分析，例如通过流式细胞术。该方案可适用于其他细胞类型，以开展深入的机制性研究。...

三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

学习合成单核细胞靶向肽两亲性胶束用于动脉粥样硬化成像的方法。该技术通过MCP-1肽增强靶向特异性，可区分早期与晚期动脉粥样硬化斑块，为心血管疾病诊断提供新途径。

用于动脉粥样硬化成像的靶向单核细胞肽两亲性胶束的合成

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