Name: 拟南芥线粒体的分离和呼吸测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习从拟南芥组织中分离完整线粒体并进行呼吸测量的方法。该技术利用差速离心和密度梯度离心纯化线粒体，适用于研究植物能量代谢、线粒体组成及环境胁迫响应机制。

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本研究得到了澳大利亚研究理事会植物能源生物学卓越中心（CE140100008）、澳大利亚研究理事会未来奖学金（FT130100112，授予MWM）以及费奥多·林嫩研究奖学金（德国亚历山大·冯·洪堡基金会，授予JS）的支持。

本方案用于从生长在土壤中的拟南芥（Arabidopsis thaliana）器官中分离完整线粒体，采用连续胶体密度梯度法。材料采集后的所有操作均在4 °C下进行。
1. 研磨介质、洗涤缓冲液和梯度溶液的制备
<ol>
	<li>在分离前一日，按 表1 配制 300 mL 研磨缓冲液（不含抗坏血酸和半胱氨酸）以及 200 mL 2 倍洗涤缓冲液，并于 4 °C 冷藏保存。 
	注意：在分离当天早晨，向研磨缓冲液中加入抗坏血酸钠和 L-半胱氨酸（游离碱基），使其终浓度分别为 17.84 mM 和 20.36 mM。若线粒体将用于蛋白质印迹（Western blot）或蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析，则配制不含牛血清白蛋白（BSA）的 2 倍洗涤缓冲液。</li>
	<li>在分离线粒体当天早晨制备梯度液（图1 和 表1）。
	<ol>
		<li>在两个烧杯中分别配制高密度和低密度梯度溶液；每种溶液 35 mL 可满足两根梯度管的需要。</li>
		<li>用去离子水清洗梯度混合器的内外室及聚氯乙烯（PVC）蠕动泵管路，确保所有管路出液均匀。</li>
		<li>将 2 支离心管（50 mL）略微倾斜放置于冰上，并用胶带将 PVC 蠕动泵管出口固定在离心管内壁，以确保梯度液沿管壁缓慢流下。</li>
		<li>关闭内外室之间的连接（黑色手柄向下）。将梯度混合器置于磁力搅拌器上，内室中放入一根小型搅拌子。</li>
		<li>将 35 mL 高密度梯度溶液倒入内室（带管路出口的腔室）。将蠕动泵流速设为快速（300 mL/h），将高密度梯度溶液分装至两支置于冰上的离心管中，直至剩余一半溶液。</li>
		<li>将 35 mL 低密度梯度溶液倒入外室（无管路出口的腔室）。打开内外室之间的连接（将黑色手柄向上推至半开位置），使两种溶液缓慢混合。使用磁力搅拌器轻轻搅拌促进混合。</li>
		<li>将流速调至缓慢（60 mL/h），继续流出溶液，直至所有梯度混合液完全流出，形成两&#160;根 0–4.4 %（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）梯度管。梯度管制备完成后立即置于冰上，待步骤 2.12 使用。 
		注意：梯度液制备完成后，用预冷的去离子水将 2 倍洗涤缓冲液稀释为 1 倍，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 匀浆与线粒体分离
<ol>
	<li>用剪刀从生长在土壤中的4周龄拟南芥植株上切取完整的莲座叶组织，每制备一份样品至少需要80株植物。 
	注意：使用培养10至14天的水培植株，每组至少5个培养皿，或使用在MS培养基上生长的两周龄幼苗 &amp;#38; 可选用MS基本盐混合物（Skoog基本盐混合物）琼脂平板，至少4块。</li>
	<li>将一半已切成小块的植物材料放入预冷至4 °C的大型研钵中，加入75 mL研磨介质（表1），并充分研磨数分钟，直至无大块组织残留。</li>
	<li>用研磨液预润湿4层过滤材料（孔径22 - 25 µm），将匀浆液通过塑料漏斗经这4层过滤材料滤入500 mL锥形瓶中。</li>
	<li>用另外75 mL研磨液研磨剩余的半份组织。</li>
	<li>将匀浆液加入滤材中，并尽可能将匀浆液充分过滤通过。</li>
	<li>用剩余的150 mL研磨液再次研磨过滤材料上残留的组织，再次过滤至500 mL锥形瓶中。</li>
	<li>将过滤后的匀浆液分装至8个预冷的50 mL塑料离心管中，在4 °C条件下，使用固定角转子以2,500 × g离心5 min。</li>
	<li>将上清液倒入干净的离心管（50 mL；避免扰动绿色沉淀），在固定角转子中于4 °C、17,500 x g离心20 min。</li>
	<li>仅保留 &#60;用移液管吸取（或小心倾倒，勿扰动沉淀）3 mL 上清液。使用小号细毛刷在残留的上清液中轻轻重悬沉淀。</li>
	<li>向每管中加入 10 mL 1× 洗涤缓冲液，将 4 个管的样品合并至 1 个洁净的离心管中（即共得到 2 个管）。</li>
	<li>用1×洗涤缓冲液将这些试管补至50 mL，并重复步骤2.7–2.9。</li>
	<li>使用滴管将粗线粒体沉淀汇集至一个离心管中，并用细毛刷充分分散（可使用少量洗涤缓冲液，但最终体积需小于3 mL，以便置于梯度液上方）。用滴管将线粒体悬液轻柔地铺加到两份连续的0–4.4%（w/v）PVP梯度液上。</li>
	<li>按重量平衡试管（使用1x）&#160;洗涤缓冲液），在 4 °C 条件下以 40,000 × g 离心 40 分钟。确保刹车已关闭。线粒体将迁移至管底附近的条带处，或存在于管底的浓溶液中（表现为浑浊的淡黄色条带）； 图2).</li>
	<li>小心吸取线粒体条带上方5 cm的溶液并弃去。</li>
	<li>将含有线粒体的剩余溶液分装至2个洁净离心管中，并用1×洗涤缓冲液补足体积。用塑料封口膜封住管口，反复倒置数次，使胶体密度梯度与线粒体均匀分布。在31,000 × g条件下离心15分钟 g 4 °C 下缓慢减速离心。 
	注意：离心前，确保线粒体和剩余的胶体密度梯度均匀分布，否则胶体密度梯度可能在管底浓缩，阻碍线粒体沉淀。</li>
	<li>吸去上清液，向管中加入1×洗涤缓冲液至50 mL，倒置混匀。在4 °C、31,000 × g条件下离心15分钟，使用慢速刹车。</li>
	<li>吸弃上清液，使用经改造的200 µL吸头（将吸头末端稍上方剪去一部分以增大开口）尽可能将线粒体沉淀收集到最小体积（约500 µL）中。将线粒体转移至1.5 mL离心管中，置于冰上立即使用，或于-80 °C保存。 
	注意：如果线粒体将用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、BN-PAGE 或免疫印迹分析，请在最后洗涤步骤中使用不含 BSA 的 1× 洗涤缓冲液（即，步骤 2.15 和 2.16）。</li>
	<li>使用Bradford法测定线粒体的蛋白质浓度。 
	注意：BN-PAGE 所用样品在 4 °C 下离心分装，沉淀物储存于 -80 °C 直至使用。进行耗氧量测定时，必须使用 freshly isolated mitochondria。</li>
</ol>
3. 耗氧量测定
注意：可使用克拉克型氧电极分析新分离的植物线粒体的耗氧量，从而测定线粒体的完整性、细胞色素 c 途径活性以及替代途径活性。
<ol>
	<li>软件安装
	<ol>
		<li>将已授权的氧气监测软件安装到用于氧气消耗测量的计算机上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>呼吸介质、底物、化学储备液及克拉克型氧电极的制备
	<ol>
		<li>制备呼吸介质（300 mM 蔗糖，10 mM NaCl，5 mM KH2PO4，2 mM MgSO₄4，用于耗氧量测定的缓冲液（含0.1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）、10 mM TES（pH 7.2））。</li>
		<li>准备用于测量线粒体呼吸的底物、抑制剂和效应物表 2可预先制备，并于 -20 °C 保存。 
		注意：使用 NaOH 在使用前将有机酸等酸性溶液的 pH 中和至 7.0。</li>
		<li>将呼吸介质预热至与检测室相同的温度（25 °C）。</li>
		<li>按照制造商提供的说明书组装克拉克型氧电极。</li>
		<li>将1 mL空气饱和水（空气饱和水的制备方法：将少量去离子水置于大锥形瓶中，剧烈振荡）加入测量室中。开启搅拌器，请点击 &#34;搅拌速度&#34; 按钮。单击 &#34;开启&#34; 按钮并将搅拌速度设置为 65 rpm。点击 &#34;好的&#34; 继续。在 25 °C 下持续搅拌水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氧电极的校准
	<ol>
		<li>将用于校准的水加热至与检测室相同的温度（25 °C）。</li>
		<li>等待电流稳定后，校准氧电极。</li>
		<li>开始校准氧电极时，单击 &#34;校准&#34; 按钮，选择 &#34;液相校准&#34; 然后 &#34;空气饱和水&#34;</li>
		<li>新窗口将打开（氧气校准（液相）- 第1步，共5步）。选择要校准的通道（电极控制盒所连接的通道）并输入变量（设置 &#34;腔室温度&#34; 至 25 °C 并 &#34;大气压&#34; 至 101.32 kPa）。点击 &#34;好的 &#34;继续。</li>
		<li>在下一步（5步中的第2步）中，设置搅拌速度（65 rpm）并点击 &#34;好的&#34; 继续。</li>
		<li>在5个步骤中的第3步，等待信号达到平台期。术语 &#34;达到平稳状态，按“确定”继续&#34; 将出现在框中。单击 &#34;好的&#34; 继续。</li>
		<li>在5个步骤中的第4步，通过加入5 mg连二亚硫酸钠在腔室中建立无氧环境。点击 &#34;好的&#34; 继续。 
		注意：氧浓度下降应在曲线中可见，并应降至0。</li>
		<li>在校准的最后一步（共5步中的第5步），等待信号达到平台期。该术语 &#34;达到平稳状态，按“确定”继续&#34; 将出现在框中。单击 &#34;好的&#34; 继续。</li>
		<li>点击 &#34;保存校准&#34; 保存校准。新窗口将打开。单击 &#34;好的&#34; 确认保存氧气控制箱的新校准。 
		注意：成功校准后，标记 &#34;氧气（nmol/mL）&#34; 将显示在 y 轴上。</li>
		<li>校准后，用水冲洗测量室至少5至10次，以彻底清洁。向测量室中加入1 mL呼吸介质，静置数分钟使膜达到平衡，直至耗氧曲线呈线性。</li>
		<li>调整耗氧量曲线的刻度，以获得良好的斜率视图。点击 &#34;缩放 XY&#34; 并输入变量（设置 &#34;氧气&#34; 0 - 300 &#34;时间轴&#34; 0 - 45 分钟</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体完整性测定
	<ol>
		<li>打开活塞后，向反应室中加入970 µL空气饱和的呼吸介质。</li>
		<li>使用剪去尖端的移液枪头，向反应室中加入30 µL分离的线粒体或150 µg总线粒体蛋白（根据线粒体分离后测定的蛋白量确定，后续计算中需包含总蛋白量）。</li>
		<li>使用磁力搅拌器（65 转/分钟）在 25 °C 下持续搅拌线粒体悬液，使溶液与空气充分饱和。</li>
		<li>将腔室与柱塞密封，点击 &#34;开始录制&#34; 记录氧气消耗量，并等待氧气消耗曲线稳定（1 - 2 分钟）。</li>
		<li>加入10 mM抗坏血酸和25 µM细胞色素后，手动测定氧气消耗速率 c 5 分钟以获得 &#34;在加入去垢剂之前&#34; 速率 
		注意：若需在轨迹图中直接标注底物、抑制剂和效应物的添加，请单击 &#34;添加事件标记&#34; 按钮并输入相应的标签名称。点击 &#34;好的&#34; 继续。</li>
		<li>加入0.05%（v/v）去垢剂后，人工测定3分钟内的氧气消耗速率 &#34;去垢剂处理后&#34; 速率。点击 &#34;停止录制。&#34;</li>
		<li>点击 &#34;变化率表格&#34; 按钮。图形界面上将出现两条垂直线形式的游标。点击并拖动这一对速率游标至轨迹中所需位置，以定义速率区间。使用左侧速率游标沿轨迹移动整个速率区间，使用右侧速率游标设定速率区间范围本身。在沿轨迹移动速率区间游标时，氧气监测软件会自动在两条游标之间绘制最佳拟合直线。</li>
		<li>在确定所需的时间间隔和位置后，用鼠标右键单击两个光标中的任意一个，并在表格中输入该速率，然后选择 &#34;添加速率至表格。” 点击 &#34;添加&#34; 单击按钮以确认在主费率表中显示该费率。</li>
		<li>通过将线粒体完整性数值相除来计算线粒体完整性 &#34;在加入去垢剂之前&#34; 速率由 &#34;去垢剂处理后&#34; 速率，以百分比表示，从100中减去该值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体呼吸的测定
	<ol>
		<li>打开活塞，向反应室中加入970 µL空气饱和的呼吸介质。使用切尖吸头的移液器，向反应室的呼吸介质中加入500 µM ATP以及30 µL分离的线粒体或150 µg总线粒体蛋白。</li>
		<li>使用磁力搅拌子在25 °C下以65 rpm持续搅拌线粒体悬液。</li>
		<li>关闭活塞，点击 &#34;开始录制&#34; 记录耗氧量，等待1-2分钟，直至耗氧速率稳定（此时耗氧量曲线呈线性）。加入5 mM琥珀酸。记录约2分钟的耗氧速率。 
		注意：若要在轨迹图中直接标记底物、抑制剂和效应物的添加，请单击 &#34;添加事件标记&#34; 按钮并输入相应的标签名称。点击 &#34;好的&#34; 继续。</li>
		<li>加入1 mM二磷酸腺苷（ADP），继续记录2分钟的氧气消耗速率。</li>
		<li>加入1 mM NADH，记录4至8分钟内的氧气消耗速率。该速率代表细胞色素氧化酶介导的呼吸能力。</li>
		<li>加入1 mM氰化钾（KCN）（或2.5 µM粘菌素B/myxothiazol，或5 µM抗霉素A），以抑制细胞色素 c 通路，并继续记录约2分钟，以观察通过替代氧化酶的氧气消耗。</li>
		<li>加入5 mM二硫苏糖醇（DTT）和10 mM丙酮酸以充分激活替代氧化酶。继续记录5–7分钟：此即替代氧化酶的活性容量。</li>
		<li>加入 500 µM 没食子酸丙酯（nPG），记录 2 分钟。此步骤用于评估无法通过化学方法抑制的残余氧消耗速率。将该速率从其他记录的速率中扣除，因其很可能非线粒体来源。在细胞色素氧化酶抑制后仍持续发生的氧消耗 c 且AOX途径（由KCN和nPG抑制）很可能源于分离线粒体中作为污染物存在的过氧化物酶9.</li>
		<li>点击 &#34;停止录制。&#34;</li>
		<li>点击 &#34;变化率表格&#34; 按钮，然后通过右键点击两个光标中的任意一个，并选择将速率输入表格中 &#34;添加速率至表格&#34;. 点击 &#34;添加&#34; 单击按钮以确认在主费率表中显示该费率。 
		注意：当添加溶解于有机溶剂中的效应物时（例如抗霉素A、nPG、粘霉素</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Day, D. A. <a target="_blank" href="https://santai.ichotels.com.tr/lib/download/asin=1493926381">Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology.</a> Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

通常，从拟南芥叶片中分离线粒体可从大约80至100株3至4周龄的植株中获得最多达3 mg的线粒体，尽管通过充分研磨通常可以获得超过5 mg的产量。产量随生长条件而变化，并随着叶片衰老而显著下降，尽管线粒体结构在衰老过程中似乎保持良好9。获得高产量最关键的步骤之一是研磨方法，用于裂解细胞以释放线粒体。虽然市面上有多种机械研磨设备可供选择，但对于拟南芥而言，使用研钵和研杵研磨在产量方面始终能获得良好效果，因其可在对细胞器损伤较小的情况下有效裂解细胞。机械研磨器虽然速度快，但需要优化，且所需研磨程度可能因组织类型而异。使用研钵和研杵时，研磨前先用刀片或剪刀将组织切碎，通常更为方便且高效。如前所述，所有操作步骤均需在4 °C下进行，从研磨结束到获得洗涤后的纯化线粒体沉淀，整个过程大约需要4小时。由于试管或梯度混合器上残留的微量去污剂或其他试剂会显著降低产量，因此这些实验中使用的所有组件均需避免使用去污剂清洗，且不得用于其他实验。最后，重要的是线粒体在梯度中需与其他组分充分分离，以便能够将其取出并进行洗涤。如果条带过于靠近管底，说明轻液与重液的混合方式需要调整，应使更多重液在混合前倾倒；相反，如果条...

植物线粒体研究的历史可追溯到100多年前1早在20世纪50年代初，人们便通过差速离心法首次分离得到了完整的线粒体。20世纪80年代，胶体密度梯度技术的出现使得线粒体可在无需经历渗透压调节的情况下实现纯化。尽管梯度离心纯化的线粒体适用于大多数实验目的，但由于质谱技术具有高度敏感性，即便是相对微量的污染物也可能被检测到，并可能被错误地定位为线粒体组分。2游离流动电泳可用于去除质体和过氧化物酶体污染3，但自由流电泳是一种高度专业化的技术，绝大多数研究并不需要。此外，在确定蛋白质定位时，需要牢记蛋白质在细胞中可能存在双重或多重靶向现象。已有超过100种蛋白质被报道同时靶向叶绿体/质体和线粒体。4，且已知有多种蛋白质靶向线粒体和过氧化物酶体5此外，特定刺激下蛋白质的重新定位， 例如 氧化应激是细胞生物学中一个新兴的研究主题6因此，在研究相关生物学背景时，需要考虑蛋白质的定位，并采用多种方法来确定和验证其位置。2.
线粒体通常通过匀浆法从植物组织中分离，此过程需在打破细胞壁以释放线粒体与避免损伤线粒体之间取得平衡。传统上，使用马铃薯和花椰菜时，匀浆过程采用家用搅拌机或榨汁机在含有多种组分的缓冲液中制备液体提取物，以维持线粒体活性。&#160;从豌豆叶片（常用于线粒体分离的材料，使用约10天龄的幼苗）中分离线粒体时，由于叶片组织较软，可利用搅拌机裂解细胞。随着拟南芥（Arabidopsis thaliana）T-DNA插入型基因敲除品系的广泛应用，为开展功能研究而纯化线粒体的需求促使了从叶片、根或花组织中分离线粒体方法的发展。总体而言，适用于其他植物的方法效果良好7，但前提是必须优化材料的研磨条件。对于拟南芥，可通过多种方式实现（见下文），且不同组织类型（根与地上部分）之间存在差异。连续梯度离心的条件也可进一步优化，因为来自不同器官或发育阶段的线粒体密度不同，其在梯度中的迁移行为也会有所差异。因此，为实现最佳分离效果，可调整梯度介质的密度以确保获得最优的分离结果。
线粒体纯化后可用于多种研究，包括蛋白质和tRNA摄取实验、酶活性测定、呼吸链功能检测以及蛋白质印迹分析。分离的线粒体还可用于蛋白质丰度的质谱分析。靶向多反应监测（MRM）分析可实现特定蛋白质的定量，但需要较大量的方法开发。相比之下，采用二甲基或其他同位素标记进行定量则更为简便。8提供了一种发现式方法，用于识别整个蛋白质组中的差异，从而揭示新的生物学见解。

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>AOX抗体</td><td>来自Tom Elthon</td><td></td><td>Elthon等，1989</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>来自葫芦属植物的抗坏血酸氧化酶</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Bovogen</td><td>BSAS 1.0</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL底物</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Criterion Stain-Free预制胶（8-16%，18孔）</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678104</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>氰化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>细胞色素c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3131</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Difco琼脂，颗粒状</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td> Gamborg B-5基础培养基</td><td>Austratec</td><td>G398-100L</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td> Gamborg维生素溶液（1000倍浓缩）</td><td>Austratec</td><td>G219-100ML</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP偶联物</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706516-2ml</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）-HRP偶联物</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706515-2ml</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C7352-100G</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Murashige &amp; Skoog基础盐混合物（MS）</td><td>Austratec</td><td>M524-100L</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>粘杆菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5580</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Ndufs4抗体</td><td>来自Etienne Meyer</td><td></td><td>Meyer等，2009</td></tr><tr><td>正丙基没食子酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>化学试剂，胶体密度梯度介质</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮（PVP40）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>连二亚硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>钠-L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4034-100G</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Chem-Supply</td><td>SA030</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>焦磷酸四钠（Na4P2O7 &amp;middot; 10H2O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Midi硝酸纤维素转移试剂盒</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704271</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>化学试剂，去垢剂</td></tr><tr><td>Western封闭试剂</td><td>Sigma</td><td>11921681001</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td>设备</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>Isolab</td><td>50 mL</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-26XP</td><td>设备</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Nalgene</td><td>3117-9500</td><td>设备</td></tr><tr><td>循环水浴</td><td>Julabo</td><td>1124971</td><td>连接至氧电极室</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>Isolab</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>滴管</td><td></td><td>3 mL</td><td></td></tr><tr><td>固定角转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>设备</td></tr><tr><td>漏斗</td><td>Per Alimenti</td><td>14 cm</td><td>用于过滤</td></tr><tr><td>梯度制备器</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4120</td><td>用于制备梯度</td></tr><tr><td>磁力搅拌器ATE</td><td>VELP Scientifica</td><td>F20300165</td><td>设备</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>过滤材料</td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>Jamie Oliver</td><td>花岗岩，6英寸</td><td>设备</td></tr><tr><td>O2view</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td>氧气监测软件</td></tr><tr><td>Oxygraph Plus系统</td><td>Hansatech Instruments</td><td>1187253</td><td>克拉克型氧电极</td></tr><tr><td>画笔</td><td>Artist first choice</td><td>1008R-12</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>塑料石蜡膜</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>用于制备梯度</td></tr><tr><td>PVC蠕动泵管</td><td>Gilson</td><td>F117930</td><td>用于制备梯度</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VELP Scientifica</td><td>OCB</td><td>设备</td></tr></tbody></table>

线粒体的分离与呼吸功能测定 拟南芥

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

线粒体是植物中参与多种代谢途径的重要细胞器，最显著的功能是通过氧化还原化合物（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2））生成三磷酸腺苷（ATP）。拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组的完整注释使其成为应用最广泛的植物模式系统，因此有必要从多种器官（叶片、根或花）中纯化线粒体，以充分利用当前可用于研究拟南芥线粒体生物学的各种工具。线粒体的分离通常通过多种方法对组织进行匀浆，随后进行一系列差速离心步骤，获得粗线粒体沉淀，再通过连续胶体密度梯度离心进一步纯化。随后通过多次离心步骤去除胶体密度介质。从100 g新鲜叶片组织起始，通常可获得2 - 3 mg线粒体。对这些线粒体进行的呼吸实验显示，其典型呼吸速率为100 - 250 nmol O2 min-1 mg总线粒体蛋白-1（NADH依赖性速率），并能够利用多种底物和抑制剂来确定被氧化的底物种类以及替代氧化酶和细胞色素末端氧化酶的活性能力。本实验方案描述了利用连续胶体密度梯度从拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中分离线粒体的方法，以及对纯化植物线粒体进行高效呼吸活性测定的技术。

通过本方案，我们能够利用SDS-PAGE和免疫印迹法检测不同的线粒体蛋白。如图3A所示，从水培组织中分离的蛋白足以检测到微弱的条带（2 µg）。信号强度随上样量的增加而相应增强。对于从平板培养组织中分离的线粒体（图3B），可通过交替氧化酶抗体的免疫检测分析不同基因型对高光胁迫处理的响应。
线粒体的完整性、细胞色素c通路活性以及替代通路活性可通过新鲜分离的线粒体样品进行测定。在所述的分离过程中，线粒体完整性得以良好保持（图4A）。向分离的线粒体中添加不同的底物、抑制剂和效应物后，细胞色素c通路和替代氧化酶通路的氧气消耗会受到影响（图4B）。
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由于线粒体仅占植物细胞的一小部分，因此需要对其进行纯化以开展多种研究。可通过匀浆处理，随后进行差速离心和密度梯度离心，从多种植物器官中分离得到高度纯化的线粒体组分。

线粒体是植物中参与多种代谢途径的重要细胞器，最显著的功能是从……中生成三磷酸腺苷（ATP）

分离完整且纯净的植物线粒体的总体目标是研究呼吸作用、线粒体组成、生物发生及代谢过程。该方法有助于回答植物能量生物学中的关键问题，例如在环境条件变化下线粒体在胁迫耐受性中的重要性。该技术的主要优势在于，能够从相对少量的植物组织中分离出足量的纯净、完整且具有功能活性的线粒体。演示该实验步骤的是来自我实验室的 Wenhui Lyu 和 Jennifer Selinski。在线粒体分离当天，用去离子水清洗梯度灌注器和聚氯乙烯蠕动泵管，以制备梯度液。将两个 50 mL 离心管倾斜放置在冰上，使蠕动泵管的出口接触离心管管壁。然后将黑色杠杆向下转动，关闭内室与外室之间的连接。将带有磁力搅拌子的密度梯度倾注器放入磁力搅拌器的内室中。随后，向内室加入35 mL高密度梯度溶液。将一半的高密度梯度溶液通过蠕动泵以每小时300 mL的速度分装到两个预置冰上的离心管中。然后将35 mL低密度梯度溶液倒入外层腔室中。立即向上扳动黑色杠杆至半位，以恢复内腔与外腔之间的连通，使溶液轻柔混合。以每小时 60 mL 的速度将整个梯度混合物从腔室中排出，形成两条连续的 0% 至 4.4% PVP 梯度。使用前务必始终将梯度置于冰上。研磨植物组织时切勿过度，否则线粒体会被破坏。对于单次制备，从至少80株生长在土壤中、四周大的拟南芥植株上切下完整的莲座状组织。然后将一半切碎的植物组织加入预冷的大研钵中，研钵中已含有75 mL研磨缓冲液。接着用研磨缓冲液润湿四层过滤材料，其孔径为20至25 m。使用塑料漏斗将匀浆液通过四层过滤材料进行过滤，并收集到500 mL锥形瓶中。另取75 mL研磨液用于研磨另一半组织，然后将全部匀浆液合并至过滤材料中，尽可能充分过滤。使用 150 mL 研磨液在过滤材料上研磨所有剩余组织，并滤入 500 mL 锥形瓶中。将滤过的匀浆分装至八个预冷的 50 mL 塑料离心管中。在 4 °C 条件下，以 2,500 ×g 的固定角度转子离心 5 分钟。将上清液倒入干净的离心管后，使用固定角转子在4摄氏度条件下以17,500 g离心20分钟。离心后在管中保留3 mL上清液。然后用细毛刷轻轻将沉淀物在剩余的上清液中重新悬浮。向每支试管中加入 10 mL 单倍洗涤缓冲液，将全部四支试管的样品合并至一支离心管中，共得到两支离心管。用单倍洗涤缓冲液将体积调至 50 mL，重复离心步骤。用极少量洗涤缓冲液，以细毛刷充分重悬沉淀，然后使用滴管将粗线粒体沉淀收集至一支试管中。然后用滴管将线粒体悬液小心地铺在两层连续的 0% 至 4% PVP 梯度上。使用单倍洗涤缓冲液平衡离心管重量，在 4°C 条件下以 40,000 g 离心 40 分钟。注意关闭离心机刹车。小心吸取线粒体条带上方五厘米的溶液。然后将线粒体溶液分装至两支干净的离心管中，并用单倍洗涤缓冲液充满。用塑料封口膜封住管口，倒置数次，使胶体

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

拟南芥线粒体的分离和呼吸测量

本文介绍了一种利用光谱荧光法测定分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔开放的实验方案。该检测方法包括同时测量线粒体的Ca2+处理能力、线粒体膜电位以及线粒体体积。同时，还描述了获取高质量且具有功能活性的心脏线粒体的操作步骤。...

离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

许多编码线粒体蛋白的mRNA与线粒体外膜相关联。本文描述了一种旨在分离酵母线粒体及其相关mRNA和核糖体的亚细胞分级分离方法。该方案可应用于在不同条件下培养的细胞。 关键词：线粒体，mRNA，核糖体，亚细胞分级分离，酵母 为了揭示线粒体附近 mRNA...

分离与酵母线粒体相关的mRNAs以研究局部翻译机制

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。...

从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

本文所述方法提供了利用少量小鼠骨骼肌分离的线粒体进行基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。这些实验能够检测常用动物模型中线粒体氧消耗的机制性变化与适应性改变。...

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本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。...

从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

在此实验中，从一只麻醉的猪体内取出股四头肌组织样本，并通过差速离心法分离线粒体。随后，采用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。...

通过差速离心法从骨骼肌中分离完整线粒体用于高分辨率呼吸测定

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

提供了一种对拟南芥（Arabidopsis...

高通量、稳健且高度时间灵活的拟南芥种子表面灭菌方法

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。...

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

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高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法的可行性和有效性预示着植物研究进入单细胞时代。本文介绍了一种分离特定拟南芥（Arabidopsis...

植物细胞类型的分离与转录组分析

学习从拟南芥组织中分离完整线粒体并进行呼吸测量的方法。该技术利用差速离心和密度梯度离心纯化线粒体，适用于研究植物能量代谢、线粒体组成及环境胁迫响应机制。

线粒体的分离与呼吸功能测定拟南芥

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