人脑神经前体细胞神经发育表型的快速检测 (npc)
2018年3月2日
神经发育过程, 如增殖, 迁移和突起的生长, 往往是不安的精神疾病。因此, 我们提出的协议, 快速和重现性评估这些神经发育过程中的人类 iPSC 派生的 npc。这些协议还允许评估相关生长因子和疗法对 NPC 发展的影响。
该方案的总体目标是以快速和可重复的方式表征人类神经前体细胞的早期大脑发育过程，并定义重要的细胞外因子在调节这些过程中的作用。这种方法可以帮助解决神经精神病学和神经发育障碍领域的重要问题，例如所有受影响的个体是否都具有相同的细胞异常，或者，每个人是否都表现出一个人的特定功能障碍？我们方案的主要优点是快速、高度可重复且易于实施。
虽然这种方法可用于深入了解神经发育障碍，但它也可用于研究神经退行性和神经精神疾病，例如阿尔茨海默氏症和抑郁症。其中一些方法的视觉演示是必要的，因为某些技术涉及将细胞从一个培养皿移动到另一个培养皿或需要形态学分析，最好通过视觉演示进行传达。为了提升人神经前体细胞，吸出培养基并用 1X 磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞一次。
吸出磷酸盐缓冲盐水，并向含有神经前体细胞的孔中加入 500 μL 1X 细胞分离溶液。然后，将板在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。接下来，使用 P1000 移液器加入 500 微升维持在室温下的磷酸盐缓冲盐水，以洗涤和去除细胞。
然后，将磷酸盐缓冲盐水中的细胞转移到 15 毫升锥形管中。用 1 毫升磷酸盐缓冲盐水再次清洗孔，然后将洗涤液转移到试管中。接下来，将细胞以 300 G 离心 5 分钟以形成沉淀。
然后，弃去上清液，将沉淀重悬于 1 至 5 mL 预热的 DMEM F12 培养基中。在 24 孔板中一式三份的孔中接种 100， 000 个细胞。46 小时后，将氚化胸苷加入培养基中，并在 37 摄氏度下孵育 2 小时。
然后，去除培养基后，加入 300 微升预热的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，并在 37 摄氏度下孵育 20 分钟，以将细胞分离并释放 DNA。然后，打开细胞采集器并启动泵。将滤纸放入细胞收获器中。
继续将细胞采集仪的试管收集在一个空的空白托盘中。然后，按 prewash 以润湿滤纸。将收集管放入样品孔中并开始。
使用热光源干燥滤纸，并在托盘上排列相应的样品瓶。将纸屑打孔到样品瓶中，然后向每个样品瓶中加入 2 毫升液体闪烁混合物。在作机器之前，将样品瓶在闪烁计数器中孵育 1 小时，以获得每个样品每分钟的计数，该计数反映了活性 DNA 合成。
在 35 毫米培养皿中接种 500， 000 个细胞。然后，向各个方向搅拌培养皿以均匀分布细胞。接下来，将细胞在 37 摄氏度下孵育 46 小时。
然后，向培养物中加入每毫升 2 微升 5 毫摩尔 EdU 并孵育 2 小时。接下来，解离并沉淀细胞。向细胞沉淀中加入 3 mL 30% 扩增培养基，含或不含生长因子或药物。
将1 毫升细胞悬液铺在预包被的培养皿上，并在 37 摄氏度下孵育板 2 小时。为了研究培养物中的神经前体细胞数量，两天后，标记并制备微量离心管。然后，从孔中吸出培养基，加入 200 μL 1X 细胞分离溶液，并在 37 摄氏度下孵育板 15 分钟。
细胞分离后，向每个孔中加入 300 μL 1X 磷酸盐缓冲盐水。使用 P1000 移液器将细胞溶液移液数次，然后将细胞从板中分离。然后，将细胞溶液转移到准备好的 1.5 毫升试管中，并将试管倒置 2 到 3 次。
使用移液管，将 50 微升细胞从试管中抽出，并添加到 0.5 毫升试管中的台盼蓝溶液中。然后，使用血细胞计数器对细胞进行计数。为了形成神经球，将 1 毫升 100% 扩增培养基移液到没有任何涂层基材的 35 毫米培养皿中。
然后，在每个板中加入 100 万个神经前体细胞，并在 37 摄氏度下孵育板 48 至 96 小时。为了准备用于神经球迁移的板，将 ECM 模拟凝胶等分试样溶解在 6 毫升 30% 扩增培养基中。在六孔板的单孔中加入 1 毫升含 30% 扩增培养基的 ECM 模拟凝胶。
然后，将板在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。要对神经球进行铺板，请使用移液管从 35 毫米培养皿中收集培养基中的细胞，并将它们转移到锥形管中。然后，以 100 G 离心管以沉淀神经球。
然后，将沉淀重悬于 1 至 3 mL 预热的 30% 扩增培养基中。接下来，将 200 微升重悬的神经球移液到含有 ECM 模拟凝胶和 30% 扩增培养基的六孔板中，然后摇动板。然后，将板在 37 摄氏度下孵育 48 小时。
用 30% 扩增培养基吸出 ECM 模拟凝胶，然后使用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟。要分析神经球，请使用 10 倍放大倍率的相差设置捕获图像。使用 NIH ImageJ 软件测量神经球的平均迁移。
在 ImageJ 上，使用手绘线条工具跟踪神经球的外轮廓。然后，使用 measure 函数计算轨迹面积，并追踪球体的内部单元质量。从总神经球面积中减去内部细胞质量以量化平均迁移。
免疫细胞化学染色研究细胞骨架蛋白和转录因子如 SOX2 、 PAX6 和 nestin 在第 3 代时神经前体细胞中的表达。接下来，捕获相差图像以识别携带神经突的细胞。从图像中，突起等于或长于两个细胞体的细胞被认为是带神经突的，而突起短于两个细胞体的细胞不被认为是带神经突的。
为了确认神经球的形成，捕获了相差图像，显示在 72 小时时间点收集的神经球大小在 80 微米到 120 微米之间，因此可用于迁移测定。为了确定增殖能力，神经前体细胞在对照或成纤维细胞生长因子条件下生长，并染色以检测 EdU 的存在。相差荧光图像显示，如 EdU 染色所示，用成纤维细胞生长因子处理的细胞具有更高比例的参与 S 期的细胞。
接下来，为了检查神经突生长，在对照条件下测定细胞并与 PACAP 进行比较。捕获相差图像，显示 PACAP 处理下具有神经突的细胞数量增加。然后，为了了解神经球迁移，用 PACAP 神经肽处理细胞。
获得的相差图像显示，与对照组相比，神经球迁移增加。我们的方案包含许多技术和测定方法，每种方法都需要不同的时间。掌握后，平均分析可能需要 2 到 3 小时来设置，分析 30 分钟到 3 小时。
在执行这些程序时，确保您使用的是高质量的神经前体细胞，并且这些细胞在除神经球测定外的所有条件下完全解离并均匀分布至关重要。遵循这些程序，可以进行其他分析，包括蛋白质印迹、QRT-PCR、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以表征潜在机制。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
该协议快速且可重复地表征了人类神经前体细胞（NPCs）中早期脑发育过程。它还定义了细胞外因素对这些过程的影响，有助于理解神经精神和神经发育障碍。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经发育
- 神经精神病学
- 细胞生物学
背景
- 神经发育过程可能在神经精神疾病中被破坏。
- 理解这些过程对于解决受影响个体的细胞异常至关重要。
- NPC评估协议可以提供对各种疾病的洞察。
- 视觉演示增强了对复杂技术的理解。
研究目的
- 评估人类iPSC衍生的NPC中的神经发育过程。
- 评估生长因子和治疗药物对NPC发育的影响。
- 探索神经精神障碍中的细胞异常。
使用的方法
- 通过形态分析表征NPC。
- 评估细胞外因素的影响。
- 快速且可重复的细胞处理协议。
- 复杂技术的视觉演示。
主要结果
- 协议有效地评估神经发育过程。
- 生长因子显著影响NPC发育。
- 方法为神经发育和神经退行性疾病提供洞察。
- 视觉辅助改善了对细胞处理技术的理解。
结论
- 该协议快速、高度可重复且易于实施。
- 它可以解决神经精神病学中的关键问题。
- 获得的洞察可以为疾病的治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid phenotyping of human neural precursor cells (NPCs) enables early-stage interrogation of neurodevelopmental mechanisms relevant to neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders. This approach provides a scalable, reproducible platform for assessing the impact of growth factors and compounds on proliferation, migration, and differentiation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. Integration of these assays into discovery pipelines accelerates disease-relevant hypothesis testing and portfolio triage for CNS drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assessment of disease-relevant cellular phenotypes in human NPCs.
- Supports functional validation of targets affecting proliferation, migration, and differentiation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying responses to growth factors and candidate drugs.
- Provides a platform for comparative analysis across patient-derived and control NPCs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput assays for proliferation and migration readouts.
- Enables reproducible quantification of neurite outgrowth and neurosphere migration.
- Supports assay scalability and cross-laboratory reproducibility for compound screening.
- Prepares validated NPC systems for downstream molecular and phenotypic analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cellular phenotypes with disease-relevant mechanisms implicated in neurodevelopmental disorders.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical model validation.
- Supports identification of translational biomarkers linked to early neurodevelopmental processes.
- Facilitates risk-adjusted advancement of CNS therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This NPC-based phenotyping platform fits at the intersection of early discovery, target validation, and preclinical research for CNS indications.
- Discovery Biology: Provides quantitative assays for hypothesis testing of proliferation, migration, and differentiation in human NPCs.
- Screening: Offers reproducible, scalable readouts for compound and growth factor effects on neurodevelopmental phenotypes.
- Analytics: Generates quantitative outputs (e.g., DNA synthesis, migration area) enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges early cellular phenotypes to disease mechanisms and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-throughput platform for diverse neurodevelopmental and neuropsychiatric research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target and pathway selection for CNS disorders.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible assays for early-stage decision making.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human stem cell culture and neural differentiation protocols.
- Needs access to imaging, cell counting, and molecular analysis instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for assay reproducibility.
- Adaptation may be needed for different hiPSC lines or disease models.
- Assay throughput and analysis time depend on operator proficiency and infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
Collecting NPCs for Plating of Experimental Conditions
2:30
Neural Precursor Cell DNA Synthesis Assay
3:47
S Phase Entry Assay
4:39
Neural Precursor Cell Number Assay
5:41
Neural Precursor Cell Neurosphere Migration Assay
7:58
Results: Use of Phase-contrast and Fluorescence Microscopy to Study the Proliferation, Migration, and Neurite Outgrowth of Neural Precursor Cells
9:51
Conclusion
