电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

结合离子选择性微电极的巨斑片技术是一种用于检测和定量离子流的多功能方法。具体而言，该方法可用于测量细胞膜上表达的电中性离子转运体——钠-氢交换体（NHE）活性所产生的质子流。钠-氢交换体在质膜附近产生质子梯度，此处以橙色环状区域表示。

通过全细胞膜片钳记录技术结合质子选择性微电极方法，可测量细胞膜两侧的质子梯度。将质子选择性微电极移至靠近细胞表面的位置（如位置A所示），记录质子从细胞向外流动的情况；再移至远离细胞表面的位置，记录溶液中游离质子的浓度（如位置B所示）；随后再次返回靠近细胞膜的位置A，进行重复性、振荡式的移动。A与B之间的电压差被记录下来，该电压差反映了NHE活性的水平。

转运离子（如质子）穿过细胞膜的过程影响着生命活动的基本环节。因此，pH 值的变化受到多种分子的严格调控，其中包括钠-质子交换体，即一种位于质膜上的质子排出系统。结合全细胞膜片钳技术的振荡式 pH 微电极是一种研究钠-质子交换体活性介导的质子流的新方法。

该方法的应用克服了通常用于测量钠-质子交换体活性的技术存在的一些主要局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率较低以及对细胞内环境的控制不够理想。我将与我的合作者 Victor Babich 博士共同演示该方法，Matthew Henry 博士将担任解说。

我们将通过测量钠-质子交换体同工型3的活性来演示该方法的应用，该交换体是跨肠和肾上皮水盐吸收的主要调节因子。用于测量质子浓度的质子选择性微电极由标准硼硅酸盐玻璃管制成。使用常规双拉程序，通过垂直拉制仪将外径为1.2毫米、无细丝的硼硅酸盐玻璃电极拉制成型。

获得直径为两到三微米的移液器吸头。将移液器放入支架容器中，移液器吸头朝上放置。接着，配制混合液以对移液器进行硅化处理。

将其倒入一个广口瓶中，并紧紧盖上盖子。将移液器在硅化混合液中孵育24至48小时。操作时需小心，务必在通风良好的化学通风橱中，于室温条件下配制混合液并对移液器进行硅化处理。

用适当的离子选择性树脂填充移液管，并将其尖端朝下垂直小心地放入烧杯架中。为准备膜片钳实验，首先使用垂直拉制仪，按照常规双步拉制程序，从外径为2毫米、内径为1.4毫米的薄壁硼硅酸盐玻璃管中拉制膜片钳移液管。将微细拉制仪安装在倒置显微镜的载物台上，以制备宽口径的移液管尖端。

将移液管置于显微拉针仪粗铂丝附近。使用脚踏开关接通电流以开启加热功能。加热显微拉针仪粗铂丝中部覆盖的低熔点玻璃，随后将移液管尖端移近熔化的软玻璃处。

加热使铂丝略微向中心移动。铂丝回到初始位置，移液管尖端断裂。重复该操作直至获得所需的尖端直径，最后加热以使尖端光滑。

使用显微拉针仪抛光后，移液器尖端的直径为10微米。使用较粗的铂丝具有优势，因为通电后其膨胀程度较小，且因电流过大导致铂丝和移液管过热的可能性较低。在使用胰蛋白酶解离细胞并终止胰酶消化后，需将细胞置于摇床中轻轻振荡培养，以防止细胞聚集成团。

胰蛋白酶消化后最多进行两小时。电生理实验装置包含一个温度控制器，用于调节灌流系统中溶液的温度。所有实验均在约37摄氏度下进行。

以及一个光学滤光片切换器，用于控制荧光成像的滤光轮；一个灌流系统阀门控制器，用于调节灌流系统阀门的开启与关闭；以及一个温度控制器，用于调节记录室的温度。

用于观察波形的示波器和膜片钳放大器。运行此Capmeter软件的计算机，以及用于记录离子选择性微电极信号的静电计。

并使用差分放大器来放大静电计的信号。电生理装置还配备有带载物台控制器的倒置显微镜、左右两侧各有一个带控制器的显微操作器，以及带有在线溶液加热器的灌流系统。将离子选择性微电极移液管安装到显微操作器后，用细胞内液反向填充膜片钳移液管。

确保溶液到达移液管的尖端。可能需要轻轻敲击数次，以消除移液管尖端的气泡。然后将膜片钳移液管安装到电生理装置的探头支架上。

将形态健康的细胞轻柔转移至装有确定体积灌流液的记录室中。保持显微操作器头部与水平轴成45度角至关重要，这可确保移液管以适合形成高阻封接的角度进入。

当将膜片钳移液管浸入浴液时，对移液管施加少量正压，以降低尖端堵塞的风险。选择一个细胞，并在保持少量正压的情况下接近该细胞。当移液管尖端接近细胞时，停止移动膜片钳移液管。

将离子选择性微电极放入浴液中，直至其与膜片钳玻璃电极尖端处于相同的焦平面。当玻璃电极位于细胞中央位置时，通过施加少量负压开始形成封接。几秒钟内即可获得兆欧级封接。

确保放大器将保持电位维持在0毫伏。最后，通过一系列短暂的吸力脉冲破裂细胞膜，并开始记录。利用巨大斑块记录法，可通过玻璃微电极内的灌流系统快速灌注溶液，从而改变细胞内离子、脂质和蛋白质的含量。

将离子选择性微电极移液管置于由膜片钳移液管固定住的细胞附近，并通过前后移动离子选择性微电极移液管使其产生振荡。应用该技术可研究钠-氢交换体的分子调控机制。利用巨大膜片法，通过移液管内灌流系统改变细胞内 ATP 和脂质的组成。

细胞内灌注apyrase（可水解细胞内ATP并降低磷脂酰肌醇含量）导致NHE3异构体活性下降50%。细胞内灌注磷脂酰肌醇PIP2不能逆转apyrase对NHE3活性的影响，但细胞内灌注磷脂酰肌醇PIP3可使其恢复。

通过结合质子选择性微电极与膜片钳技术，可实现对钠氢交换体（NHE）活性的测量。该方法有助于研究磷脂酰肌醇及其下游信号级联通路对NHE差异性调控的分子基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用振荡式pH微电极结合全细胞膜片钳技术来测定钠-质子交换体的活性。

以及这些方法可能应用的一个示例。