Name: 电生理测量在中性转运体活性研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学习使用质子选择性微电极与膜片钳技术测量钠氢交换体NHE产生的质子通量。该方法结合巨膜片技术，可精确调控细胞内环境，为研究离子转运机制提供高灵敏度工具。

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作者谨此感谢美国爱荷华州得梅因市得梅因大学的 Eric Fishback 在视频拍摄与编辑过程中提供的帮助。PS120 成纤维细胞样细胞系（稳定表达 NHE3-wt 或 NHE3-YRK）由美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院的 Mark Donowitz 博士惠赠。

注意：使用自参照离子选择性电极（ISE）结合膜片钳技术记录电中性转运体活性时，需要两个放大器——一个膜片钳放大器用于维持细胞的全细胞状态，以及一个高阻抗放大器（电位计）用于通过ISE记录转运体活性（参见材料表）。膜片钳放大器直接连接至数据采集板端口。电位计则连接至差分放大器，用于对信号进行滤波和放大。差分放大器再连接至数据采集板端口。Capmeter 是一种监测细胞电容的膜片钳软件，已在先前的研究中使用20（参见材料表）。记录室和灌流溶液均维持在 37 °C。
1. 离子选择性电极用移液管的制备
<ol>
	<li>使用移液器拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制移液管，使其外径达到 1.2 mm（参见 材料表）2。</li>
	<li>使用微加工仪对移液管进行抛光，移液管尖端直径应为 2–3 µm。</li>
	<li>将移液管放入移液管架中，尖端朝上放置（参见 材料表）。 
	注意：步骤 1.4–1.6 需在通风良好的化学通风橱中进行。</li>
	<li>配制硅烷化混合液，包含 1 滴（约 150 µL）双(二甲氨基)二甲基硅烷和 10 滴四氯化碳（参见 材料表）。</li>
	<li>将硅烷化混合液倒入容器中，并紧密盖上盖子。</li>
	<li>将装有硅烷化混合液的容器置于室温下的化学通风橱中孵育 24–48 小时，直至混合液完全蒸发。</li>
	<li>用适当的离子选择性树脂反向填充移液管，形成约 2–4 mm 的树脂柱。 
	注：氢离子载体 I 混合液 B 可用于记录钠氢交换体（NHE）活性（参见 材料表）。</li>
	<li>轻敲移液管尖端，使离子选择性树脂分布至尖端，然后将移液管垂直放入移液管架中，尖端朝下。</li>
	<li>在解剖显微镜下检查，确认树脂混合液已到达尖端末端；必要时施加正压，推动树脂至尖端末端。</li>
	<li>用适当的溶液（约 100 μL）反向填充半支移液管。若使用离子载体 I 混合液 B，则此处使用 pH 7.0 的 100 mM KCl 和 10 mM HEPES 溶液。</li>
	<li>将离子选择性电极（ISE）连接至电位计，并将电极尖端插入记录所用的灌流液中，对电位计进行调零。</li>
	<li>通过改变灌流液的 pH 值，测试 H+-选择性 ISE 的响应。H+-选择性 ISE 的平均响应值约为每 pH 单位 58 mV。</li>
	<li>定期评估 ISE 对校准的响应情况。</li>
</ol>
2. 记录用膜片钳电极的制备
注意：建议采用 Donald Hilgemann 在其关于单通道记录的文章中所描述的方法21。
<ol>
	<li>使用拉管仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（2.0 mm外径 / 1.5 mm内径）上拉制用于巨膜片记录的微电极2,22,23。</li>
	<li>将显微成型仪安装在倒置显微镜的载物台上，用于制作宽口径微电极尖端（10 - 22 μm）23。将一滴软玻璃（约 0.5 mL）熔融至显微成型仪的粗铂丝上。 
	注意：制造巨膜片微电极需要相对较粗的铂丝（约 0.5 mm）。</li>
	<li>将膜片微电极靠近软玻璃珠，施加全功率加热，直至微电极尖端开始回缩。加热过程中，铂丝会略微向中心移动。</li>
	<li>关闭加热，将微电极尖端推入软化的玻璃珠中。冷却过程中，铂丝回缩并使微电极尖端断裂。</li>
	<li>重新加热以修整微电极尖端，形成所需直径的尖端。尖端直径取决于待记录细胞的大小（本研究中为 8 - 10 μm）。</li>
</ol>
3. 细胞的制备
<ol>
	<li>将不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA 溶液和培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>用 PBS 清洗细胞两次。每 35 mm 直径的细胞培养皿使用 1 mL 缓冲液。</li>
	<li>向 35 mm 直径的细胞培养皿中加入 0.5 mL 胰蛋白酶。 
	注意：当细胞开始变圆时，轻轻摇动培养皿以使细胞脱落。</li>
	<li>加入 5 mL（适用于 35 mm 直径细胞培养皿）含 10% 胎牛血清的完全培养基，以终止胰蛋白酶作用。 
	注意：胰蛋白酶消化时间因细胞类型而异。</li>
	<li>将细胞置于摇床上轻轻振荡，防止细胞聚集成团。</li>
	<li>消化后细胞应在 2 小时内使用。 
	注意：具体时间可能因细胞系不同而有所变化。</li>
</ol>
4. 细胞内灌流系统的制备
<ol>
	<li>裁剪适当长度的石英管（外径 150 µm / 内径 75 µm），用于制备管内灌流管线。</li>
	<li>将石英管的一端插入 200 µL 移液器吸头中。用胶水将石英管固定在吸头上，并用锋利的剃刀片切割吸头末端。</li>
	<li>将灌流管线（即固定在吸头上的石英管）连接至一段小型硅胶管，该硅胶管将作为管内灌流液的储液端。</li>
	<li>将硅胶管连接至注射器，以产生正压。</li>
	<li>将石英管的自由端穿过灌流口移液器夹持器的聚乙烯管（见材料表）。</li>
	<li>使用移液器溶液评估灌流管线的通畅性。</li>
</ol>
5. 溶液的配制
<ol>
	<li>准备一种高缓冲能力的记录钠氢交换体（NHE）的移液管溶液（115 mM 天冬氨酸钾（KAsp）、1 mM EGTA、0.5 mM MgCl2、10 mM Mg-ATP、12.5 mM HEPES、12.5 mM PIPES、12.5 mM MOPS 和 12.5 mM MES，用天冬氨酸调节 pH 至 6.0）。 
	注意：配制移液管溶液母液并进行过滤。记录前加入 Mg-ATP。</li>
	<li>每次实验均需配制新鲜的灌流液（140 mM NaCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2 和 0.1 mM Tris-HCl，pH 8.2）。</li>
</ol>
6. 转运体活性的记录
<ol>
	<li>保持记录室和所有溶液处于 37 °C因为转运蛋白活性具有温度依赖性。</li>
	<li>将细胞放入记录室中。等待细胞沉降至记录室底部，但不要让其附着于记录室表面。</li>
	<li>选择一个合适的细胞。使用目镜测微尺测量细胞的直径。选择直径相近的细胞。 
	注意：通常情况下，较大的细胞具有更大的细胞表面积，其质膜上可能表达更多的转运蛋白，因而也可能具有更高的转运活性。然而，这一推论并不一定正确，因为转运活性取决于所研究的特定转运蛋白和细胞类型。</li>
	<li>将离子选择性微电极移液管安装到显微操作器上，用细胞内液反向填充膜片钳移液管，确保溶液到达移液管尖端2. 
	注意：可能需要轻弾吸头数次以排除尖端的气泡。</li>
	<li>将膜片钳电极安装到电生理设备的前端装置上2,22,23. 
	注意：务必将头部固定装置保持在与水平轴约45度的角度，因为这可确保移液管的进入角度适合形成高阻封接。</li>
	<li>施加轻微的正压（约 5 cm H2将 O) 加入记录电极的移液管中，以降低尖端堵塞的风险，然后将其放入浴液中。</li>
	<li>当移液管尖端接近细胞时，停止移动膜片钳移液管。</li>
	<li>当移液管接触细胞时，释放正压并施加轻微负压（约 5 cm H₂O）2O）以获得一个 &gt;细胞膜与膜片钳电极之间形成1000 MΩ（即1 GΩ）的密封23.</li>
	<li>将带有细胞的膜片钳电极置于与离子选择性电极（ISE）相同的焦平面上，并将带有细胞的膜片钳电极移至靠近 ISE 的位置（约 5 - 10 µm)2,5 但避免让细胞接触ISE（离子选择性电极）图1A).</li>
	<li>确保钳制电位为 0 mV。</li>
	<li>用短促的负压抽吸多次，直至破膜，获得全细胞记录模式。</li>
	<li>缓慢左右或上下移动ISE（或膜片钳移液管）以记录转运蛋白的活性图1B).</li>
	<li>记录至少5-8个峰（图1C，从 A 到 B).</li>
	<li>在记录过程中施加方波扰动，以监测封接质量和细胞膜电容（图1).</li>
	<li>估算 H+ 通量（<img alt="J&lt;sub&gt;H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&lt;/sub&gt; 符号，化学表示法中的静力平衡方程，化学记法中的方法" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">) 由游离 H 的差异得出+ 细胞表面与主体溶液之间的浓度ΔH+) 
	<img alt="化学平衡公式，JH+=(mol/s)，涉及ΔH+、扩散系数；用于分析的示意图。" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	<img alt="结合平衡方程；配体相互作用分析公式" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"> 
	注意： <img alt="用于化学中离子传输研究的扩散系数符号 D&lt;sub&gt;H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&lt;/sub&gt;" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 和 <img alt="色谱图，D\_B 公式，化学分离方法，科研实验" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5"> 是 H+ 以及缓冲液的扩散系数，分别地， BT 是缓冲液的总浓度， KD 是缓冲液的解离常数， r 是细胞半径，且 <img alt="静态平衡，方程 ΔBᵢ/ΔH；公式分析，教育研究，物理概念" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 6"> 确定结合态 H 浓度的稳态变化+ 游离H的微小变化+H+ 表示溶液中的游离质子。为与先前研究保持一致，H+ 通过计算流的电流当量，将流转换为电生理学流单位（<img alt="J&lt;sub&gt;H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&lt;/sub&gt; 符号，化学表示法中的静态平衡方程" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">/faraday) 以 pA 为单位3,5].</li>
	<li>将质子流归一化至细胞表面积（可根据细胞大小计算）或膜电容。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管转运蛋白具有关键功能，但目前可用于研究其活性的方法效率低下且不充分。其中一个局限性在于，现有方法在测量由转运蛋白活性介导的离子移动时，未考虑实验过程中细胞内离子组成的波动4。本文所述方法可精确控制细胞外和细胞内离子组成，并为调控细胞内离子、蛋白质及脂质组成提供了一种强有力的工具3,4,5。
本方案中最关键的步骤是制备一种可长期保持稳定的离子选择性电极（ISE）25根据我们的经验，不稳定的离子选择性电极（ISE）硅化处理不充分。例如， 离子选择性树脂在ISE移液管内壁重新分布，这会导致ISE信号出现持续且不可控的漂移，从而被检测到。此外，实验过程中应密切监测ISE内树脂的分布情况。灌流液可能将离子选择性树脂推入ISE移液管内部，导致在树脂前端形成一段灌流液柱<sup class="x...

离子和溶质跨质膜的运输对细胞的存活至关重要，因此也对生物体的存活至关重要1。离子和溶质的选择性运输由一系列特化的通道蛋白和转运蛋白实现。这些蛋白的突变常导致多种临床疾病，使得通道蛋白和转运蛋白成为潜在的药物治疗靶点1。然而，由于研究其活性可用的方法有限，对通道蛋白和转运蛋白功能及其调控机制的理解常常受到限制2,3,4。
具体而言，转运蛋白可根据其在溶质转运过程中是否改变细胞膜电位，大致分为两大类：改变膜电位的生电性离子转运蛋白[例如， 钠-磷酸盐共转运蛋白2a（NaPi2a），钠-钙交换体（NCX）， 等等.] 或不改变电荷的电中性离子转运蛋白 [例如， 钠-质子交换体（NHE），钠-氯共转运体，NaPi2c 等等]. 已通过放射性同位素摄取和荧光膜通透性染料的方法对这两类转运蛋白的活性进行了广泛研究2两种方法均通过测量特定胞质离子总体浓度的变化来估算转运蛋白的活性，但都存在一定的局限性，例如灵敏度和时间分辨率中等，以及对细胞内环境的控制不足。事实上，许多转运蛋白的活性依赖于其所转运离子的胞质浓度例如， NHE3、NCX）的活性，这些离子浓度的变化预计在调控转运蛋白活性中发挥重要作用2,3,5传统方法在精确测量这些调控机制方面存在局限性。
为了克服这些局限性，通常采用膜片钳技术来研究转运蛋白的活性2,6。特别是，近年来将自参照离子选择性电极（ISEs）7,8 与膜片钳系统相结合，已能够测量电中性转运蛋白的活性3,4,5。ISEs 的原理在于，转运蛋白的活性会在细胞膜附近形成离子梯度。通过使 ISE 以重复振荡的方式靠近和远离细胞膜，可记录到电压差（µV）。利用基于菲克扩散第一定律的校准方法，可将电压差转换为离子流值2,9。ISEs 用于检测离子从细胞内向外流动的情况，而膜片钳技术则可在全细胞或内面向外构型下用于控制膜电位和细胞内离子组成。此外，应用巨膜片钳技术还可改变细胞内不仅离子，还包括脂质和蛋白质的组成3,5。
总之，与研究转运体活性的其他方法相比，膜片钳技术的多功能性使其能够克服这些方法常见的局限性。自参照离子选择性电极（ISE）与膜片钳技术的结合，提供了在严格控制的实验环境中测量电中性转运体活性的独特可能性，并有助于发现细胞膜转运过程中的新生物物理与分子特性3,4,5。该方法已成功用于研究钠氢交换体（NHE）的活性。哺乳动物NHE蛋白家族催化细胞外钠离子（Na+）与细胞内质子（H+）之间的电中性净交换10,11，并利用向内的Na+浓度梯度驱动该过程。在哺乳动物中，NHE蛋白家族包括11种相关蛋白（NHE1-9和NHA1-2），以及一种精子特异性NHE10,12,13。
NHE（SLC9a家族）广泛存在于从简单原核生物到高等真核生物的大多数生物体中，参与多种重要的细胞功能10,11，包括调控原核生物的细胞盐度防御、维持酸碱平衡和细胞体积，以及调节多种特化上皮组织对盐和水的吸收10,12,14,15。尽管已有多个研究明确了NHE的关键生物学作用及其功能的重要性，但由于方法学上的限制，针对哺乳动物NHE的生物物理和分子特性的研究仍较少4。近年来，在全细胞膜片钳实验中应用自参照离子选择性电极（ISEs），揭示了由细胞内离子、蛋白质和磷脂浓度变化所调控的NHE亚型的新分子机制3,4。
本文提供的实验方案详细阐述了研究NHE3亚型（NHE3）活性及其调控机制的方法，NHE3在肾和肠上皮细胞刷状缘膜对Na+、Cl-、HCO3-及液体的吸收过程中发挥关键作用14,16。本研究报道了关于NHE3活性对细胞内磷脂酰肌醇类分子（包括磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2]和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸[PI(3,4,5)P3]）敏感性差异的新发现。细胞转运蛋白（如离子通道和转运体）受磷脂酰肌醇类分子的调控17，而NHE3可直接结合PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P318。根据现有文献，这两种磷脂酰肌醇分子均可能参与NHE3生理或病理生理条件下的调控过程5,18,19。我们的研究结果支持PI(4,5)P2与PI(3,4,5)P3在调控NHE3活性中具有不同的功能。这一区分得以实现，得益于离子选择性电极（ISE）技术与全细胞膜片钳记录技术的联合应用。该方法还可在测定NHE3活性的同时，通过细胞内灌注不同类型的磷脂酰肌醇，实现对细胞内磷脂酰肌醇含量的精确控制。

<table><tbody><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双通道差分静电计（HiZ-223）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>差分放大器（DP-301）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>基于MatLab的膜片钳软件</td><td>带有采集工具箱的MatLab</td><td></td><td>建议使用 capmeter 软件</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 温度控制系统</td><td>&amp;nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>在线加热器</td></tr><tr><td>单通道温度控制器（TC-324C）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>单通道标准硼硅酸盐玻璃管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>1B120F-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于离子选择性电极</td></tr><tr><td>微量移液器储存罐</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>双(二甲氨基)二甲基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>四氯化碳</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>氢离子载体 I - 混合液 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>薄壁硼硅酸盐玻璃管</td><td>&amp;nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>用于膜片钳电极&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>软质玻璃（Corning 8161 Patch Glass）</td><td>华纳仪器</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅毛细管（150 μm外径/75 μm内径）</td><td>Molex（Polymicro Technologies）</td><td>106815-0018</td><td>用于细胞内灌流系统</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>天冬氨酸钾&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>腺苷三磷酸双磷酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>二油酰磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸（diC8）</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

离子通过细胞膜的转运确保了细胞内外离子含量的精细调控，这是细胞存活所不可或缺的。这些转运机制由特化的转运蛋白介导。具体而言，细胞质膜上的质子（H+）外排系统（如Na+/H+交换体（NHE）蛋白家族）对pH动态进行精确调控。尽管已有大量研究致力于探索NHE调控的机制，但由于缺乏有效测量NHE活性的方法，目前对NHE家族的生物物理和分子特性的理解仍不充分。在本研究中，我们结合全细胞膜片钳记录技术，使用H+选择性电极来测量NHE介导的H+流。我们提出该方法以克服传统测量NHE活性方法（如放射性摄取和荧光膜通透性探针）的一些局限性。采用所述方法测量NHE活性具有高灵敏度和高时间分辨率，并能更有效地控制细胞内H+浓度。H+选择性电极的原理在于，转运蛋白的活性会在细胞膜附近形成离子梯度。通过使H+选择性电极以重复振荡的方式靠近或远离细胞膜，可记录到依赖于H+流的电压差。H+选择性电极用于检测从细胞内向外的H+流，而全细胞构型的膜片钳技术则用于控制细胞内离子组成。此外，应用巨膜片钳技术不仅可改变细胞内离子组成，还可调控脂质组成。我们利用该技术手段测量了NHE3亚型（NHE3）的转运活性，以研究磷脂酰肌醇对NHE3调控作用的分子基础。

在全细胞膜片钳记录过程中应用自参照离子选择性电极（ISE）研究磷脂酰肌醇对NHE3活性的调控作用。实验采用不表达内源性质膜NHE的PS120成纤维细胞样细胞24。在PS120成纤维细胞样细胞中稳定表达NHE3野生型（NHE3-wt）或不能结合磷脂酰肌醇的NHE3突变体[酪氨酸501、精氨酸503和赖氨酸505突变为丙氨酸，Y501A/R503A/K505A（NHE3-YRK）]18。
结果如图2所示。采用膜片钳技术，通过移液管将细胞保持在全细胞记录模式下，同时将离子选择性电极（ISE）置于细胞前方。在此位置，ISE记录靠近细胞膜处游离H+的浓度（图1A）；随后，手动将ISE（或膜片钳移液管）横向移动50 µm，记录溶液...

本文描述了使用质子选择性电极和膜片钳技术来测量质子转运系统活性的方法。这些方法克服了常用于研究质子转运活性的技术中存在的一些局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率不足以及对细胞内环境控制不充分。

离子通过细胞膜的运输确保了细胞内外离子含量的精细调控，这是细胞存活所不可或缺的。

结合离子选择性微电极的巨斑片技术是一种用于检测和定量离子流的多功能方法。具体而言，该方法可用于测量细胞膜上表达的电中性离子转运体——钠-氢交换体（NHE）活性所产生的质子流。钠-氢交换体在质膜附近产生质子梯度，此处以橙色环状区域表示。通过全细胞膜片钳记录技术结合质子选择性微电极方法，可测量细胞膜两侧的质子梯度。将质子选择性微电极移至靠近细胞表面的位置（如位置A所示），记录质子从细胞向外流动的情况；再移至远离细胞表面的位置，记录溶液中游离质子的浓度（如位置B所示）；随后再次返回靠近细胞膜的位置A，进行重复性、振荡式的移动。A与B之间的电压差被记录下来，该电压差反映了NHE活性的水平。转运离子（如质子）穿过细胞膜的过程影响着生命活动的基本环节。因此，pH 值的变化受到多种分子的严格调控，其中包括钠-质子交换体，即一种位于质膜上的质子排出系统。结合全细胞膜片钳技术的振荡式 pH 微电极是一种研究钠-质子交换体活性介导的质子流的新方法。该方法的应用克服了通常用于测量钠-质子交换体活性的技术存在的一些主要局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率较低以及对细胞内环境的控制不够理想。我将与我的合作者 Victor Babich 博士共同演示该方法，Matthew Henry 博士将担任解说。我们将通过测量钠-质子交换体同工型3的活性来演示该方法的应用，该交换体是跨肠和肾上皮水盐吸收的主要调节因子。用于测量质子浓度的质子选择性微电极由标准硼硅酸盐玻璃管制成。使用常规双拉程序，通过垂直拉制仪将外径为1.2毫米、无细丝的硼硅酸盐玻璃电极拉制成型。获得直径为两到三微米的移液器吸头。将移液器放入支架容器中，移液器吸头朝上放置。接着，配制混合液以对移液器进行硅化处理。将其倒入一个广口瓶中，并紧紧盖上盖子。将移液器在硅化混合液中孵育24至48小时。操作时需小心，务必在通风良好的化学通风橱中，于室温条件下配制混合液并对移液器进行硅化处理。用适当的离子选择性树脂填充移液管，并将其尖端朝下垂直小心地放入烧杯架中。为准备膜片钳实验，首先使用垂直拉制仪，按照常规双步拉制程序，从外径为2毫米、内径为1.4毫米的薄壁硼硅酸盐玻璃管中拉制膜片钳移液管。将微细拉制仪安装在倒置显微镜的载物台上，以制备宽口径的移液管尖端。将移液管置于显微拉针仪粗铂丝附近。使用脚踏开关接通电流以开启加热功能。加热显微拉针仪粗铂丝中部覆盖的低熔点玻璃，随后将移液管尖端移近熔化的软玻璃处。加热使铂丝略微向中心移动。铂丝回到初始位置，移液管尖端断裂。重复该操作直至获得所需的尖端直径，最后加热以使尖端光滑。使用显微拉针仪抛光后，移液器尖端的直径为10微米。使用较粗的铂丝具有优势，因为通电后其膨胀程度较小，且因电流过大导致铂丝和移液管过热的可能性较低。在使用胰蛋白酶解离细胞并终止胰酶消化后，需将细胞置于摇床中轻轻振荡培养，以防止细胞聚集成团。胰蛋白酶消化后最多进行两小时。电生理实验装置包含一个温度控制器，用于调节灌流系统中溶液的温度。所有实验均在约37摄氏度下进行。以及一个光学滤光片切换器，用于控制荧光成像的滤光轮；一个灌流系统阀门控制器，用于调节灌流系统阀门的开启与关闭；以及一个温度控制器，用于调节记录室的温度。用于观察波形的示波器和膜片钳放大器。运行此Capmeter软件的计算机，以及用于记录离子选择性微电极信号的静电计。并使用差分放大器来放大静电计的信号。电生理装置还配备有带载物台控制器的倒置显微镜、左右两侧各有一个带控制器的显微操作器，以及带有在线溶液加热器的灌流系统。将离子选择性微电极移液管安装到显微操作器后，用细胞内液反向填充膜片钳移液管。确保溶液到达移液管的尖端。可能需要轻轻敲击数次，以消除移液管尖端的气泡。然后将膜片钳移液管安装到电生理装置的探头支架上。将形态健康的细胞轻柔转移至装有确定体积灌流液的记录室中。保持显微操作器头部与水平轴成45度角至关重要，这可确保移液管以适合形成高阻封接的角度进入。当将膜片钳移液管浸入浴液时，对移液管施加少量正压，以降低尖端堵塞的风险。选择一个细胞，并在保持少量正压的情况下接近该细胞。当移液管尖端接近细胞时，停止移动膜片钳移液管。将离子选择性微电极放入浴液中，直至其与膜片钳玻璃电极尖端处于相同的焦平面。当玻璃电极位于细胞中央位置时，通过施加少量负压开始形成封接。几秒钟内即可获得兆欧级封接。确保放大器将保持电位维持在0毫伏。最后，通过一系列短暂的吸力脉冲破裂细胞膜，并开始记录。利用巨大斑块记录法，可通过玻璃微电极内的灌流系统快速灌注溶液，从而改变细胞内离子、脂质和蛋白质的含量。将离子选择性微电极移液管置于由膜片钳移液管固定住的细胞附近，并通过前后移动离子选择性微电极移液管使其产生振荡。应用该技术可研究钠-氢交换体的分子调控机制。利用巨大膜片法，通过移液管内灌流系统改变细胞内 ATP 和脂质的组成。细胞内灌注apyrase（可水解细胞内ATP并降低磷脂酰肌醇含量）导致NHE3异构体活性下降50%。细胞内灌注磷脂酰肌醇PIP2不能逆转apyrase对NHE3活性的影响，但细胞内灌注磷脂酰肌醇PIP3可使其恢复。通过结合质子选择性微电极与膜片钳技术，可实现对钠氢交换体（NHE）活性的测量。该方法有助于研究磷脂酰肌醇及其下游信号级联通路对NHE差异性调控的分子基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用振荡式pH微电极结合全细胞膜片钳技术来测定钠-质子交换体的活性。以及这些方法可能应用的一个示例。

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电生理测量在中性转运体活性研究中的应用

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电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

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