Name: 组蛋白3赖氨酸 79 Dimethylation 标记沉淀后神经祖细胞的分离培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习从胚胎及出生后脑组织中分离培养神经祖细胞的方法，用于分析H3K79me2等组蛋白修饰在皮层和小脑发育过程中的表观遗传调控机制。该技术为研究神经发育提供可靠的ChIP实验方案。

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感谢Henriette Bertemes协助在实验室中建立CGN培养方案。本方法论文由德国研究基金会（DFG）资助的CRC992医学表观遗传学项目对TV的资助支持。作者感谢德国弗莱堡大学生物信息学系的弗莱堡Galaxy团队（Pavankumar Videm、Björn Grüning和Prof. Rolf Backofen）提供的支持，该支持由合作研究中心992医学表观遗传学（DFG资助号SFB 992/1 2012）和德国联邦教育与研究部（BMBF资助号031 A538A RBC（de.NBI））提供。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益

检测组蛋白修饰、转录因子、组蛋白密码阅读蛋白、书写蛋白或擦除蛋白在基因组上的占据情况，主要有两种染色质免疫沉淀方法。一种是使用核酸酶消化的天然染色质进行免疫沉淀的天然ChIP方法，另一种则是本研究所采用的方法，即使用PFA固定的、经超声破碎的染色质，其中核小体及其他DNA结合蛋白通过共价键与DNA交联39。由于染色质和组蛋白甲基化在ChIP过程中相对稳定，且天然ChIP具有较高的抗体检测效率，因此适用于组蛋白甲基化的检测。然而，该方法需要大量起始材料，故不适用于皮层或小脑发育的研究，因为在这些研究中从小鼠脑组织获得的细胞数量通常有限。尽管抗体通常是针对非固定材料制备的，但我们已证实该抗体可特异性识别H3K79me2，因为特异性抑制DOT1L会导致ChIP-qPCR分析和免疫印迹中H3K79me2信号的减弱（图2A 和 图3A）。使用交联材料进行ChIP可能效率较低，但本方案所提供的流程能够确保获得足量且特异性富集的材料，用于qPCR和测序分析。
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大脑的感觉、运动和认知功能高度复杂，且易受物理和环境变化的影响。脑由后脑、中脑和前脑三个主要部分组成，这些部分之间存在密切连接。在前脑中，端脑可分为背侧端脑（DT）和腹侧端脑（VT）。小鼠的背侧端脑由六个皮层层构成，这些层在胚胎期11.5天至18.5天（E11.5–E18.5）以“由内向外”的方式逐步形成1。腹侧端脑在发育过程中包含神经节隆起，之后将发育为基底神经节2,3。哺乳动物中枢神经系统中可区分多种细胞类型，例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞4，这些细胞以时空特异性的方式发育5。首先，神经前体细胞（NPCs）产生多种类型的神经元，包括腹侧端脑中的中间神经元和背侧端脑中的投射神经元，随后生成胶质细胞（例如，星形胶质细胞6）。在皮层发育过程中，最表层（I层），即包含 Cajal-Retzius 细胞的层，最先形成。随后，在E12.5至E14.5期间，神经前体细胞生成较深的神经元层（VI层和V层）；而在E14.5至E16.5期间，前体细胞则产生上层（IV–II层）神经元7,8。神经元身份的确定依赖于不同形态发生素诱导的时空特异性转录程序，以及表观遗传程序2。
小脑参与运动协调，位于后脑，在小鼠中其发育时间约为胚胎期第10天（E10）至出生后第20天（P20）9。小脑包含小脑皮层和小脑核团10。成年小脑皮层由三层结构组成：最外层的分子层、中间的浦肯野细胞层以及最内层含有颗粒神经元的颗粒层10。小脑颗粒细胞是最小的神经元，约占脊椎动物脑内所有神经元的80%11。它们由位于外颗粒生发区的前体细胞发育而来，并迁移穿过浦肯野细胞层到达最终位置12。与端脑类似，小脑的发育受到多种重要形态发生素的调控，这些形态发生素具有特定的时间和空间依赖性功能，并启动特定的转录程序10。
大脑皮层和小脑层的发育受到特定形态发生素的转录表达以及DNA染色质状态的调控。简而言之，染色质状态可分为两类：具有转录活性的常染色质和转录沉默的异染色质区域。作为染色质基本单位的核小体包含两份每种核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4，周围缠绕着147个碱基对的DNA。13组蛋白在翻译后会发生多种修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP-核糖基化、脱氨基以及脯氨酸异构化14,15组蛋白赖氨酸甲基化被认为是最稳定的组蛋白修饰，可调控转录、复制和重组16DNA损伤应答17，以及基因组印记18赖氨酸可发生单甲基化、二甲基化或三甲基化19 不仅出现在可及的组蛋白尾部，还出现在组蛋白的球状结构域内20H3K4 和 H3K36 的特异性甲基化主要与常染色质相关，而 H3K9、H3K27 或 H4K20 的特异性甲基化则主要存在于异染色质区域，尽管所有这些修饰位点均位于组蛋白尾部14,19,21H3K79 甲基化位于组蛋白球状结构域内，既与转录活性相关，也与转录失活的基因组区域相关22该修饰在进化上具有保守性，已在酵母、小牛胸腺、鸡和人类中被观察到23H3K79 单、二和三甲基化（H3K79me1、me2、me3）由组蛋白甲基转移酶 DOT1L 催化24,25 以及含核SET结构域蛋白2（Nsd2）26DOT1L 参与细胞增殖、DNA 修复和细胞重编程27. 缺失 Dot1l 在小鼠中会导致约发育阶段 E10.5 时的产前死亡28,29在心脏发育及心肌细胞分化过程中，DOT1L 对基因表达调控至关重要30在中枢神经系统中，DOT1L 的功能可能与神经管发育有关31，它参与抑制 Tbr1前脑发育过程中的表达32，并可能在内质网应激反应基因的调控中发挥作用33H3K79me 的作用具有情境依赖性，可表现为激活或抑制，尤其在 在体内 中枢神经系统发育等情形至今仅被部分阐明32由于H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，与位于柔性组蛋白尾部的修饰相比，其空间位阻更大，可及性较低23为了理解 H3K79 甲基化的功能，需要可靠且可重复的分析方法来确定其定位及基因组环境。在本方法学论文中，我们介绍了不同神经前体细胞（用于大脑皮层的皮层前体细胞 CPCs 和用于小脑的颗粒神经元前体细胞 CGNPs）的分离方法、有效的 DOT1L 抑制剂处理方案，以及一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，可用于在皮层和小脑发育的不同时间点通过定量 PCR（qPCR）或测序分析 H3K79 甲基化水平。有关该实验方案及其应用的概览，请参见 图1.

<table><tbody><tr><td>抗-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 免疫印迹稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>抗-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 免疫印迹稀释比例 1:3000</td></tr><tr><td>抗-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀抗体</td></tr><tr><td>抗-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 免疫印迹稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>抗兔IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀对照抗体</td></tr><tr><td>抗微管蛋白α</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 免疫印迹稀释比例 1:3000</td></tr><tr><td>转铁蛋白（1 mg/ml）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质细胞培养基（CCM）</td></tr><tr><td>B27添加剂（50倍浓缩）</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质细胞培养基（CCM）</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent technologies</td><td>G2940CA</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于剪切染色质的分析</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 超声破碎仪</td></tr><tr><td>硼酸 pH 8.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质前体细胞（CPC）培养</td></tr><tr><td>CFX Connect RT PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀分析&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; qPCR检测系统</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 磁珠，用于染色质免疫沉淀</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; DOT1L抑制&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于细胞培养中DOT1L的抑制</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; EDTA</td></tr><tr><td>胎牛血清 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质前体细胞分离和小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离</td></tr><tr><td>谷胱甘肽（1.25 mg/ml）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质细胞培养基（CCM）</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于细胞固定</td></tr><tr><td>GoTaq预混液</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀分析&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; qPCR用DNA聚合酶预混液</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s平衡盐溶液</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; HBSS</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质细胞培养基（CCM）</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质前体细胞（CPC）培养</td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; LiCl</td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于DNA定量的荧光分光光度计</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra DNA文库制备试剂盒（适用于Illumina）</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀分析&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 文库制备试剂盒</td></tr><tr><td>NEBNext多重寡核苷酸（适用于Illumina）</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀分析&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 文库制备用寡核苷酸</td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质细胞培养基（CCM）</td></tr><tr><td>NP-40替代物</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于染色质免疫沉淀缓冲液</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; PFA，用于细胞固定</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-新霉素 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; PSN，用于皮质细胞培养基（CCM）和小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; PBS，用于皮质前体细胞（CPC）分离</td></tr><tr><td>PicoGreen试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀分析&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于DNA定量的荧光染料</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离</td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质前体细胞（CPC）培养</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; KCl，用于小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于染色质免疫沉淀</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于染色质免疫沉淀</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; DNA纯化试剂盒</td></tr><tr><td>RNA酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于染色质免疫沉淀</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; DOT1L抑制&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于细胞培养中DOT1L的抑制</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; NaCl，用于染色质免疫沉淀缓冲液</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于染色质免疫沉淀</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; SDS，用于染色质免疫沉淀</td></tr><tr><td>音猬因子（SHH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于小脑颗粒神经元前体细胞（CGNP）分离</td></tr><tr><td>超氧化物歧化酶（1mg/ml）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质细胞培养基（CCM）</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; TRIS，用于染色质免疫沉淀缓冲液</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于染色质免疫沉淀缓冲液</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.05% (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 细胞培养&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于皮质前体细胞（CPC）分离</td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>&lt;strong&gt;类别：&lt;/strong&gt; 染色质免疫沉淀&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写/备注：&lt;/strong&gt; 用于磁珠制备</td></tr><tr><td>其他实验室设备：血球计数板、培养箱、旋转仪、摇床、解剖工具组、水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM：皮质细胞培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CGM：小脑颗粒神经元前体细胞培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

大脑发育是一个复杂的过程，由形态发生素梯度和不同的转录程序以时空方式调控。此外，表观遗传性染色质修饰（如组蛋白甲基化）在该过程中对建立和维持特定细胞命运具有重要作用。绝大多数组蛋白甲基化发生在具有灵活性的组蛋白尾部，该区域可被组蛋白修饰酶、去修饰酶以及组蛋白识别蛋白所接近。相比之下，H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，并参与多种发育功能。H3K79甲基化在进化上高度保守，可在从Homo sapiens到Saccharomyces cerevisiae的多种物种中发现。该修饰存在于生物体内的不同细胞群体中，包括神经前体细胞。由于H3K79甲基化位于组蛋白3的球状结构域，其检测较为困难。本文介绍了从胚胎期大脑皮层组织（E11.5–E14.5）中分离和培养皮层前体细胞（CPCs），或从出生后组织（P5–P7）中分离和培养小脑颗粒神经元前体细胞（CGNPs）的方法，并高效地对H3K79me2进行免疫沉淀，用于定量PCR（qPCR）和全基因组测序。

神经前体细胞分离、培养、H3K79me2 染色质免疫沉淀（ChIP）及 ChIP 分析方法的总体方案： 图1 展示了在胚胎脑发育不同时期的皮层前体细胞或出生后阶段的小脑颗粒神经元前体细胞中进行 H3K79me2 ChIP 的流程图。第一步是分离脑组织，并获取端脑（E11.5 至 E14.5）或小脑（P5-P7）。可通过将端脑分为背侧端脑（DT）和腹侧端脑（VT）来分别分析其不同区域。随后对组织进行匀浆处理，并分离神经前体细胞。此时可选择将前体细胞进行培养并用 DOT1L 抑制剂处理；另一种选择是直接固定前体细胞并进行 ChIP 操作。在 ChIP 过程中，染色质将被剪切为 200–500 bp 的片段，并与磁珠偶联的抗 H3K79me2 抗体孵育。洗涤磁珠并回收 DNA 后，可对沉淀的 DNA 进行测序或定量 PCR（qPCR）分析（图1A）。染色质剪切后应获得良好的片段大小分布，因此建议通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳或其...

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。

大脑发育是一个复杂的过程，受到形态发生素梯度和不同转录程序在时空上的精确调控。此外，表观遗传性染色质修饰（如组蛋白甲基化）在这一过程中对特定细胞命运的建立与维持发挥着重要作用。绝大多数组蛋白甲基化发生在组蛋白尾部的柔性区域，该区域可被组蛋白修饰酶、去修饰酶以及组蛋白识别蛋白所接近。相比之下，H3K79甲基化位于组蛋白H3的球状结构域，参与多种发育相关功能。H3K79甲基化在进化上高度保守，广泛存在于从智人（Homo sapiens）到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的多种物种中。该修饰存在于生物体内的多种细胞群体中，包括神经前体细胞。由于H3K79甲基化位于组蛋白H3的球状结构域，其检测较为困难。本文介绍从胚胎期大脑皮层组织（E11.5–E14.5）分离和培养皮层前体细胞（CPCs），或从出生后组织（P5–P7）分离小脑颗粒神经元前体细胞（CGNPs）的方法，并高效地对H3K79me2进行免疫沉淀，用于定量PCR（qPCR）和全基因组测序分析。

本实验的总体目标是分析脑发育过程中的表观遗传修饰，特别是在大脑皮层和小脑中的修饰情况。该方法可用于回答神经生物学领域中的关键问题，例如组蛋白修饰（如 H3K79 甲基化）如何影响皮层和小脑分层结构的发育。该技术的主要优势在于，我们能够在特定发育时间点，针对不同脑区，在体内研究组蛋白修饰在特定基因座或全基因组范围内的变化。从出生后5至7天（P5-P7）的MRI小鼠开始，去除所有脑膜和血管。然后将每芯片三到五个小脑转移至15毫升离心管中。在离心前，用含葡萄糖的HBSS缓冲液洗涤小脑组织。将离心管离心以收集组织。最后一次洗涤后，使用1毫升移液器轻柔吹打2至3次，将小脑组织匀浆，直至组织碎片大小为0.5至1立方毫米。轻轻吸去液体，直至剩余 2.5 毫升。然后向含有小脑的 HBSS 葡萄糖溶液中加入 0.05% 胰蛋白酶。将组织置于 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。每隔一到三分钟将组织翻转一次。孵育结束后，加入五毫升小脑颗粒神经元前体细胞培养基（CGM）以终止消化，并像之前一样通过离心收集组织。离心后，弃去上清液，加入一毫升 CGM。使用1毫升移液器枪头吹打组织，避免产生气泡。然后加入5毫升CGM，将混合物置于冰上孵育2分钟，使组织残余物沉淀。待组织沉淀后，将上清液转移至新的15毫升离心管中。然后向残留组织中加入 2 毫升 CGM，重复吹打操作，收集上清液并弃去组织残渣。合并每支 15 毫升离心管中的上清液，离心以收集小脑细胞。将沉淀重悬于 10 毫升 CGM 中。由于星形胶质细胞在多聚-D-赖氨酸上的贴壁速度和强度均高于CGNPs，可将最多4毫升细胞悬液加入经多聚-D-赖氨酸包被的6孔板中，于37摄氏度孵育20分钟以去除星形胶质细胞。轻轻振荡培养板，收集上清液至15毫升离心管中，然后按前述方法离心上清液。将沉淀重悬于10毫升CGM培养基中，并使用Neubauer计数板进行细胞计数。培养四到六小时后，贴壁的颗粒神经元前体细胞（CGNP）呈圆形并具有增殖活性。将细胞接种于多聚-L-鸟氨酸包被的培养板中的CGM培养基中，于37摄氏度、5% CO2及100%相对湿度条件下孵育。体外培养一天（DIV1）后，大多数CGNP呈圆形并处于增殖状态。部分CGNPs将开始分化并长出神经元突起。为固定培养的细胞，直接向含有CGNPs的孔中加入最多1毫升的1% PFA。在22摄氏度孵育5分钟后，加入53微升甘氨酸，并用3毫升冰浴PBS洗涤两次。使用细胞刮刀在 1 毫升 PBS 中收集细胞。将细胞转移至 1.5 毫升离心管中，在 4 摄氏度、1,000 g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液后，加入含蛋白酶抑制剂的 700 微升裂解缓冲液，在 4 摄氏度下孵育样品 15 分钟。在此期间，每五分钟涡旋振荡样品一次。孵育结束后，将样品分装至多个离心管中，确保每管体积不超过 400 微升。随后在

isolation-cultivation-neural-progenitors-followed-chromatin

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

组蛋白3赖氨酸 79 Dimethylation 标记沉淀后神经祖细胞的分离培养

脑组织的细胞异质性对染色质中表观遗传标记的研究构成了显著限制，因为大多数检测方法缺乏单细胞分辨率。神经元通常与胶质细胞及其他非神经元细胞混杂在一起。本文提供了一种从人脑中提取和收集神经元细胞核的实验方案。...

从人死后脑组织中分离神经元细胞核

本文介绍了如何在三维（3D）培养条件下生成、扩增并进行免疫标记出生后海马神经前体细胞（NPCs）。接着，通过结合使用混合可视化技术，我们展示了如何利用免疫标记的冷冻切片数字图像，对整个三维神经球中免疫阳性细胞的空间位置进行重建与定位...

在三维神经干细胞培养中定位蛋白质：一种混合可视化方法学

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC...

电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

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从小鼠胚胎神经管中分离和培养神经嵴细胞

来源：Tagliafierro, L.，等．用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台．J. Vis. Exp.

慢病毒转导神经前体细胞以调控α-突触核蛋白表达的表观遗传机制

本视频演示了一种分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞（iNPCs）的技术。该方法概述了分离iNPC克隆并将其培养于经层粘连蛋白包被的多孔板孔中的步骤，同时使用适宜的培养基，以促进iNPC群体的持续增殖与扩增。...

分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞克隆

本视频演示了从小鼠幼崽的小脑中分离和培养小脑神经前体细胞的过程。通过差速贴壁法分离并纯化小脑颗粒神经元前体细胞，有效去除星形胶质细胞。这些培养的前体细胞随后可分化为小脑颗粒神经元。...

分离与培养小鼠小脑颗粒神经元前体细胞

来源：Mendez, F. M. et al.，利用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀。J. Vis. Exp.

神经球细胞的天然染色质免疫沉淀

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

成年哺乳动物脊髓中含有可分离并在体外扩增培养的神经干细胞/祖细胞（NSPCs）。本实验方案描述了从大鼠及人类器官移植供体的成年脊髓室管膜下区获取、分离、培养以及传代NSPCs的方法。...

从成年大鼠和人类脊髓室管膜下区分离神经干细胞/前体细胞

表观遗传机制在胶质瘤中经常发生改变。染色质免疫沉淀可用于研究胶质瘤中由组蛋白修饰变化引起的遗传改变后果，这些修饰调控染色质结构和基因转录。本方案描述了对小鼠脑肿瘤神经球进行的天然染色质免疫沉淀实验。...

使用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀

学习从胚胎及出生后脑组织中分离培养神经祖细胞的方法，用于分析H3K79me2等组蛋白修饰在皮层和小脑发育过程中的表观遗传调控机制。该技术为研究神经发育提供可靠的ChIP实验方案。

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

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