荧光互补成像检测在烟草烟叶中瞬时测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学

这篇手稿描述了一个简单和快速的实验程序, 以确定蛋白质-蛋白质相互作用的基础上荧光活动的测量。

该程序的总体目标是定量检测瞬时表达系统中的蛋白质-蛋白质相互作用。这项措施可以帮助回答量子信号交易领域的关键问题，例如如何在化学或环境处理后定量监测我们的蛋白质蛋白质方向。该技术的主要优点是它使用光度计或 CCD 相机来检测荧光体活性，它代表蛋白质方向的强度，因此结果更准确。

要开始此过程，将 1 毫升含有 5% 次氯酸钠和零点 1% Triton x 100 的溶液加入到含有种子的 1 点 5 毫升微量离心管中。让溶液静置 5 分钟以对种子进行消毒。然后，用无菌水清洗种子五次。

洗净的种子悬浮在 200 微升消毒水中。使用细头，小心地将单个种子放在铺板的 MS 琼脂培养基的表面上。将板在 4 摄氏度下储存三天以同步发芽。

在此之后，将培养基板在正常生长条件下放置 10 天。将发芽的幼苗转移到土壤中，确保不会损坏根部。用透明塑料盖住托盘过夜以保持湿度。

在受控生长室中种植植物七周，此时它们将准备好接受根癌农杆菌的渗透。首先，将 150 ng 质粒递送到 a-tumefaciens 感受态细胞菌株 GV3101 中。将含有 a-tumefaciens 培养物的试管放入摇床中，孵育 4 小时。

使用玻璃棒将培养物从试管转移到 LB 培养基中。在 28 摄氏度下培养根癌菌和 LB 琼脂培养基 4 天。接下来，准备将每个板中的单个 a-tumefaciens 菌落接种到其自己的装有 3 毫升 LB 液体培养基的试管中。

在 28 摄氏度下以 280 RBM 摇动 24 小时以繁殖培养物。然后，将 75 微升细菌培养物转移到 15 毫升新鲜的 LB 液体培养基中，其中每毫升含有 15 微克的卡那霉素和 50 微克/毫升的利福平。在 30 摄氏度下以 220 RPM 的速度培养细菌约 8 小时，直到 OD600 在 0.5 到 1 之间。

之后，将培养物转移到 15 毫升离心管中。在 4000 倍重力和 4 摄氏度下离心 15 分钟。弃去上清液，将托盘重悬于 15 毫升转化溶液中。

在 4000 倍重力和 4 摄氏度下离心 15 分钟。然后，再次重复悬浮液和离心步骤。弃去上清液，将托盘重悬于 5 ml 转化溶液中。

让重悬的托盘在室温下避光放置 2 小时。然后，将转化溶液添加到 OD 600 中为 0.5 或合并两个体积相等的样品以测试配对蛋白质相互作用。使用 1 毫升注射器针头，将悬浮细胞浸润到第四至第七片叶子中。

在此之后，立即用黑色塑料盖住植物 12 小时。首先，植物应该非常健康以确保成功。其次，确保在渗透过程中不要损坏任何树叶。

将托盘避光放置 12 小时。然后在正常条件下将植物生长 2 至 4 天，然后检测荧光素酶活性。要开始成像方法，请分离浸润的叶子。

将整个小叶放在一板 MS 琼脂培养基上。使用 50 毫升喷雾瓶，将荧光素工作缓冲液喷洒到叶子的近轴侧。然后，在黑暗中放置 5 分钟以淬灭叶绿素自发荧光。

使用冷却至负 30 摄氏度的低光冷却 CCD 成像设备以 50 毫秒的充满光曝光时间为 50 毫秒，发光检测时间为 1 分钟来捕捉图像。在此之后，从 N-benthamiana 叶的渗透区域切下叶子碎片。将碎片浸入 96 孔白板孔中的 100 微升去离子水中。

加入 10 微升荧光素工作缓冲液。让盘子静置 5 分钟。然后，进行任何所需的特异性处理以研究蛋白质相互作用动力学，并直接使用商用发光计测量发光。

此处显示的是表示 COP 1 SPA 1 相互作用的荧光活性的演示。通过发光检测到的荧光体活动由 CCD 相机成像。COP 1 SPA 1 相互作用导致功能性荧光素酶的铜突变。

然后测定 Jasmine 8 处理下随时间变化的荧光素酶活性。以荧光素酶活性为代表的 COP 1 SPA 1 相互作用在黑暗中逐渐下降。Jasmine 8 治疗可进一步减少这些相互作用。

一旦掌握了这项技术，如果执行得当，在植物准备好后 1 周内就可以完成。在尝试此程序时，重要的是要记住保持健康的植物。小心渗入叶子并适当包含对照。

经过开发，该技术为信号交易领域的研究人员快速探索蛋白质相互作用动力学铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何种植烟草植物、将农杆菌渗透到烟叶中以及检测荧光活性有一个很好的了解。