Name: 大鼠视网膜仿生化学调节的神经递质谷氨酸的体外实验方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: 学习使用谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经刺激的体外实验方法。该技术通过神经递质调节视网膜神经元，为治疗光感受器退行性病变导致的失明提供新途径，具有更高视觉敏锐度和更自然视觉体验的潜力。

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本论文所述工作由美国国家科学基金会前沿研究与创新（NSF-EFRI）项目资助，项目编号0938072。本文内容仅由作者负责，不代表美国国家科学基金会的官方观点。作者还感谢Samsoon Inayat博士在设计和测试化学刺激初始实验装置方面所做的工作，以及Ashwin Raghunathan先生在设计、加工和评估本研究中所用多通道微流控装置方面所做的贡献。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种独特的神经刺激范式，其中视网膜神经元通过在体外将内源性神经递质化学物质注入视网膜亚表层进行化学刺激。in vitro。与传统的电刺激技术相比，这种化学刺激技术具有多项优势，包括对目标神经元的选择性和高度局灶特异性。上述方案详细描述了如何使用单通道玻璃微移液管或定制的多通道微流控装置，向目标视网膜神经元附近进行小体积的气动注射谷氨酸神经递质，从而引发具有生理意义的视网膜神经节细胞（RGC）反应。尽管本方案仅以谷氨酸为例进行演示，但该方法同样适用于研究其他类型神经递质对视网膜的化学刺激。此外，虽然本方案建议使用穿孔微电极阵列（pMEA）进行电生理记录32，但其他类型的微电极阵列（MEA）设计（包括非穿孔型）也可用于获得与pMEA相似的结果。在接下来的段落中，我们将讨论本方案中最关键的步骤、常见问题的解决方法，以及该刺激技术的局限性和未来应用前景。
为了获得安全可靠的化学刺激，本方案中必须完成几个关键步骤。其中一个关键步骤是通过仔细分离视网膜并尽量减少其置于含氧Ames培养基外的时间，以获得成功的视网膜制备。...

视网膜感光细胞退行性疾病，例如视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）和年龄相关性黄斑变性，是导致视力丧失的主要遗传性病因，目前尚无治愈手段1,2。尽管这些疾病由多种特定的基因突变引发，但作为一类疾病，其共同特征是视网膜中感光细胞进行性丧失，最终导致失明。感光细胞的丢失会引发视网膜广泛的结构重塑，但在感光细胞退变的晚期阶段，仍有部分视网膜神经元（包括双极细胞和RGCs）保持存活且具备相对正常的功能3,4,5,6,7。
这些疾病的机制和病理特征已被充分阐明3,4,5,6,7 但有效的治疗方法仍然难以实现。在过去三十年中，全球研究人员已探索了多种治疗方案，旨在恢复因光感受器退行性疾病而受损的视力，包括基因治疗8干细胞治疗9视网膜移植10，以及人工刺激11,12 存活的视网膜神经元。其中，临床上最可行的是视网膜假体，这类人工神经刺激装置传统上利用电极阵列，以特定模式对双极细胞或视网膜神经节细胞（RGCs）进行电刺激，旨在为患者产生人工视觉感知11. 当前一代的电刺激假体，例如 Argus II13 和 Alpha-IMS14 设备已获得临床批准，初步研究表明，通过视网膜上（视网膜前）和视网膜下（视网膜后）植入设备恢复部分视力，可改善患者的生活质量15,16全球各地的研究团队正在致力于推进视网膜假体技术，以超越第一代设备所取得的成果17,18,19,20 但在设计能够使患者的视力恢复到法定盲症水平以下的高清晰度视觉的电假体方面，研究人员遇到了困难。近期研究表明，由于电荷注入量的限制，当前一代基于电刺激的假体难以实现更高的空间分辨率；这一限制要求必须使用较大的电极以安全地刺激视网膜神经元，但会以牺牲空间分辨率为代价。 即 视力11,21此外，电刺激还存在进一步的局限性，因为它通常会刺激所有邻近的细胞，从而在患者中引发不自然且令人困惑的感知，这在很大程度上是由于其本质上是一种非自然的刺激模式21然而，电刺激的早期成功表明，人工神经刺激可作为感光细胞变性疾病的有效治疗方法。这使人假设，若使用神经递质化学物质——化学突触间天然的信息传递介质——对视网膜进行刺激，或许能实现更为有效的治疗。本文所提出方法的目的在于探索化学刺激的治疗可行性，即通过模拟视网膜神经元之间天然的突触通信系统，为视网膜假体提供一种仿生替代电刺激的策略。
将治疗性化学刺激的概念转化为化学视网膜假体，依赖于通过微流控装置释放少量内源性神经递质（如谷氨酸），以化学方式激活目标视网膜神经元。该微流控装置包含大量微孔阵列，可响应视觉刺激释放神经递质。通过这种方式，化学视网膜假体本质上是一种仿生的人工感光细胞层，能够将自然到达视网膜的光子转化为化学信号。由于这些化学信号使用的是正常视网膜信号传导中所采用的相同神经递质，并通过与正常视觉通路相同的突触通路刺激退化视网膜中尚存的神经元，因此通过化学视网膜假体所获得的视觉感知可能比通过电刺激假体诱发的视觉更为自然且易于理解。此外，由于释放神经递质的微孔可制作得极小且能以高密度排列，与电极不同，潜在的化学假体可能实现更局灶性的刺激和更高的空间分辨率。因此，基于这些潜在优势，化学视网膜假体为电刺激假体提供了一种极具前景的替代方案。
然而，对视网膜的化学刺激直到最近才受到较少关注。尽管视网膜的电刺激已在数十年的研究中得到充分表征， 体外22,23, 体内23,24以及临床研究13,14，关于化学刺激的研究一直仅局限于少数几种 体外 作品25,26,27,28. Iezzi 和 Finlayson26 和 Inayat 等27 视网膜内表面化学刺激视网膜的演示 体外 分别使用单电极和多电极阵列（MEA）记录视网膜神经元对谷氨酸刺激的反应。最近，Rountree 等28 通过视网膜下侧的谷氨酸刺激，利用多电极阵列（MEA）记录视网膜多个位点的神经反应，证明了对视网膜OFF通路和ON通路的选择性激活。尽管这些研究初步确立了化学刺激的可行性，但仍需进一步研究以探索该方法在现有研究尚未涉及的诸多方面的特性与潜力。25,26,27,28，并精细调整两种情况下的治疗刺激参数 体外 和 体内 动物模型研究，然后再将此概念转化为化学视网膜假体，如上所述。然而，目前文献中尚无建立成熟的视网膜化学刺激方法学体系，以往研究中所采用的方法亦未被详细描述到足以支持重复性研究的程度。因此，本文方法学论文的立意在于提供一个明确定义的实验框架，以开展相关研究。 体外 视网膜的化学刺激，适用于有意重复我们先前研究的科研人员27,28 或进一步推进化学神经刺激这一新兴概念。
在此我们展示一种进行 体外 在野生型大鼠以及一种光感受器退化的大鼠模型的视网膜全层标本中，对视网膜神经元进行化学刺激，该模型 closely mimics 人类光感受器退行性疾病的进展。开发此种刺激方法的原理在于 体外 模型旨在评估不同刺激参数的治疗范围，并研究在常规条件下难以或无法观察到的神经反应特征 体内 模型，尤其是在初步研究中评估该方法可行性的阶段。在本实验中，我们分别通过市售单通道玻璃微电极和自行设计的多通道微流控装置，向目标视网膜神经元附近递送少量1 mM谷氨酸，实现单点及同步多点化学刺激。尽管单点和多点刺激均可实现化学神经调控治疗可行性研究的基本目标，但二者各有特定用途和独特优势。单点刺激可使用市售预拉制玻璃微电极完成，能够将化学物质直接注入视网膜单一位置的亚表层区域，用于检测在注射位点下方是否可诱发类似于视觉诱发光反应的可观察视网膜神经节细胞（RGC）放电率响应。而多点刺激则需使用专门制备的多通道微流控装置，可在视网膜表面多个空间位点同步递送化学物质，用于研究在模式化刺激实验中，谷氨酸诱发的RGC反应模式与谷氨酸注射模式之间的对应关系。

<table><tbody><tr><td>微电极阵列，穿孔布局</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>MEA放大器</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>pMEA用底部灌流接地板</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>三轴电动显微操作器</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MP-285</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html</td></tr><tr><td>显微操作器控制系统</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>龙门式带线性滑轨的显微操作器支架</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html</td></tr><tr><td>8通道可编程多通道压力注射仪</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ&lt;br/&gt; 供应商：Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 或 PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm&lt;br/&gt; 供应商: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1&lt;br /&gt;_HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A 集成式膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A 已被更新型号 Axopatch 200B 取代：&lt;br/&gt; https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>膜片钳前置放大头级</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>真空废液套件</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/</td></tr><tr><td>移液管支架</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>预拉制玻璃微移液管（尖端直径 10 &amp;mu;m）</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/</td></tr><tr><td>变倍体视显微镜</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745</td></tr><tr><td>带双线性滚珠轴承臂的显微镜臂架</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>带C-LEDS混合LED支架的变倍体视显微镜</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>倒置显微镜系统</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames培养基</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>L-谷氨酸（谷氨酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿（高10 mm）</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>60 mm 透明培养皿；https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>珠宝商#5镊子</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr><tr><td>标准手术刀片#24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr><tr><td>手术刀柄#4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr><tr><td>Vannas Tubingen解剖剪</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>503378</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td></tr><tr><td>尼龙网筛套件</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Harp切片固定网格</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>HSG-5AD</td><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/</td></tr><tr><td>Ag/AgCl参比电极颗粒</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>P1060</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td></tr><tr><td>4通道阀控重力灌流系统</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr><tr><td>Zyla 5.5 sCMOS显微相机</td><td>Andor Technology, Belfast, UK</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>银丝（直径 50 &amp;mu;m）</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5</td></tr><tr><td>Tygon微孔管（直径1.6 mm）</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills , IL</td><td>EW-06419-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901</td></tr><tr><td>带钢制套管的倾斜工具支架</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td><td>各使用一个用于顶部灌流和抽吸；http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr><tr><td>Roscolux #26 红色滤光片片材</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>制造商: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux&lt;br/&gt; 供应商: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith &amp;amp; Wesson Galaxy Red手电筒</td><td>Smith &amp;amp; Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>制造商: https://www.smith-wesson.com/&lt;br/&gt; 供应商: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack 软件</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack</td></tr><tr><td>Labview 软件</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr><tr><td>NIS-Elements：基础研究软件</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

利用神经递质谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经调节的方法学 体外

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

光感受器变性疾病通过视网膜中光感受器细胞的进行性丧失导致不可逆的失明。视网膜假体是一种新兴的治疗光感受器变性疾病的手段，旨在通过人工刺激视网膜中幸存的神经元，从而在患者中诱发可理解的视觉感知。目前的视网膜假体已证明可通过电极阵列对视网膜进行电刺激，成功恢复患者的有限视力，但在恢复高分辨力、自然视觉方面仍面临显著的物理障碍。利用内源性神经递质进行化学神经刺激是电刺激的一种仿生替代方案，有望克服基于电神经刺激的视网膜假体所固有的基本局限性。具体而言，化学神经刺激通过在比现有电假体精细得多的空间分辨率下，注射极微量的神经递质——即视网膜化学突触所使用的天然信号传递分子——有望为患者恢复更自然的视觉，达到与现有技术相当甚至更优的视觉敏锐度。然而，作为一种相对未被充分探索的刺激范式，目前尚无成熟的方案用于实现视网膜的化学刺激。 体外本研究旨在为希望探索视网膜或类似神经组织化学神经调控潜力的研究人员，提供一套完成视网膜化学刺激的详细操作框架。 体外在本研究中，我们描述了一种实验装置与方法，通过使用玻璃微移液管和定制的多通道微流控装置，将可控体积的神经递质谷氨酸注入视网膜下腔，从而在野生型及感光细胞退化的完整大鼠视网膜中诱发视网膜神经节细胞（RGC）的动作电位反应，模拟视觉光反应。该方法与实验方案具有通用性，可适用于其他神经递质的神经调节，甚至可推广至其他神经组织。

尽管光感受器丢失导致了显著的细胞重构，本方案仍可用于化学刺激正常的野生型视网膜以及光感受器退变的视网膜。在开始使用光感受器退变或野生型视网膜进行实验之前，需要准备好记录和刺激设备（图1 和 图2），并清洁平面多电极阵列（pMEA）（图5），以尽量减少每个电极通道的噪声（图6）。尽管光感受器退变的视网膜比野生型视网膜更薄，因而更为脆弱，但两者均采用相同的解剖步骤（图4）。解剖完成后，将视网膜小心地放置在pMEA上，使节细胞层朝向电极，并将pMEA固定在MEA放大器内（图3A），随后可从上方（图3B）和下方（图3C</st...

本方案描述了一种利用神经递质谷氨酸在体外对大鼠全层视网膜进行化学神经刺激研究的新方法。in vitro（体外）化学神经刺激是一种有前景的新型手段，可作为传统电刺激视网膜神经元的替代方案，用于治疗由光感受器变性疾病引起的不可逆性失明。

光感受器变性疾病通过视网膜中光感受器细胞的进行性丧失导致不可逆的失明。视网膜假体是……

本方法的总体目标是利用神经递质实现对视网膜神经元的新型化学性神经调控，有望替代神经退行性致盲患者中功能受损的视网膜细胞，从而恢复视力。该方法有助于回答人工视觉领域的一些关键科学问题，例如：谷氨酸——一种主要的视网膜神经递质——是否可用于治疗性地刺激光感受器退化的视网膜？本技术的主要优势在于其具有仿生特性，以这种方式刺激视网膜有望实现比电刺激更高的视觉敏锐度和更接近自然的视觉体验。该技术的应用前景涵盖因光感受器退行性疾病导致的失明治疗，因为在视网膜退化早期进行治疗干预，有可能恢复视网膜神经元对谷氨酸的敏感性。开始该操作时，将两只摘除的眼球置于直径为60毫米的培养皿中，并加入新鲜的充氧Ames'培养基溶液。使用解剖体视显微镜，用手术刀或一把尖头剪刀在角膜表面做一个小切口。接着，从该小切口向角膜边缘剪开，并沿角膜全周延伸，形成环形切口。然后，将脱离的角膜连同晶状体、透明的房水和玻璃体液一并移除。用一对镊子轻轻夹住眼杯，同时在眼杯两侧相对的位置小心地做两个小切口。接着，使用两对镊子分别在每个切口处轻轻将眼杯拉开。然后将视网膜从巩膜上分离。缓慢地将整个视网膜从巩膜和眼杯上抬起，如果视神经仍附着，则将其剪断。随后，在视网膜上做纵向切口，以获得半片或四分之一片的视网膜组织。然后将一片视网膜切片轻轻展开于尼龙网上，使节细胞层背离网面。将网和视网膜放置于带孔的多电极阵列上，使节细胞与PMEA表面接触。随后在网的上方放置一个重物，以固定视网膜位置。在此操作过程中，在微弱红光照明下，将 PMEA 放置在 MEA 放大器中并关闭放大器卡扣。将顶部灌流出口置于 PMEA 腔室内，并打开顶部灌流阀，使灌流速率约为每分钟三毫升。接着，将顶部吸液入口置于所需的八级灌流水平位置。确保其正常工作。随后，打开数据采集软件并点击播放按钮以开始接收数据。确保所有PMEA通道无噪声，并正在记录神经信号。如果接触不良，请重新调整PMEA在放大器中的位置，以改善放大器引脚与PMEA电极之间的接触。然后确保底部灌流管路中无任何气泡。打开底部灌流阀，以确保视网膜获得充足的氧气和营养供应。随后，打开倒置光学显微镜上连接的高速相机，并启动成像软件。确认底部灌注液流稳定后，在倒置显微镜下观察视网膜，同时手动调节真空废液装置上的真空压力旋钮，逐步增加底部负压。一旦观察到负压作用于视网膜，即停止增加负压。在确保视网膜已被底部负压固定后，使用镊子将重量从视网膜上移开，并小心地从视网膜边缘轻轻剥离尼龙网。保持灌流持续约30分钟，以使视网膜从手术创伤中稳定下来。在此步骤中，小心地将预先拉制的直径为10 µm的微电极插入标准移液器支架中，支架内含一根直径为50 µm的银-氯化银电极。如果使用多通道微流控装置，则将连接至该装置的不锈钢杆插入标准移液器架中，但不连接导线电极。如果使用玻璃微移液管，则将移液器架与膜片钳头级装置连接，并将移液器架的压力端口下部连接至压力注射系统的通道一。或者，若使用多通道装置，则将八个注射端口各自的压力端口鲁尔接头分别连接至压力注射系统的通道一至通道八。接下来，手动打开压力注射系统并开启通道一。确保系统与大气相通，并将注射压力设定为 0.1 磅每平方英寸。随后，打开显微操作器，并通过按下操作器控制器上的校准按钮进行校准。将显微操作器放置在微电极阵列（MEA）放大器上方约30毫米处。然后，将少量谷氨酸溶液加入培养皿中，并将其置于显微操作器下方。将微移液管尖端浸入溶液中，并用溶液填充玻璃微移液管或多通道装置的管路，填充高度约为20毫米。随后，将微量移液器吸头或装置从溶液中提起。取下培养皿，并将显微操作器移至 PMEA 腔室上方。使用安装在支架上的体视显微镜，将微量移液器吸头或装置的角与刻蚀在 PMEA 腔室环上的参考标记对齐。然后，使用“存储参考A”和“存储参考B”按钮将操纵器位置存储到控制面中，以建立PMEA电极操纵器的坐标系映射。随后，启动操纵器控制软件，选择一个具有稳定自发放电活性的目标PMEA电极，点击“移动至通道”按钮，使玻璃微移液管与目标电极对齐。若使用多通道装置，请采用相同方法将装置的微孔与具有稳定自发放电活性的目标 PMEA 电极对齐。如果可进行阻抗测量，打开膜片钳放大器，并通过点击启动按钮来启动阻抗可视化软件，以观察位于移液管支架内的银-氯化银电极的阻抗。在实时监测阻抗信号的同时，缓慢降低微移液管或装置，直至其接触视网膜表面，此时阻抗信号会迅速升高，表明已接触。 进行深层刺激时，S334 tera 3 视网膜的移液管需再下移 40 微米，野生型视网膜则下移 70 微米。使用压力注射系统进行数次短时注射。通过观察神经信号，判断微移液管尖端或装置微孔附近的细胞是否对谷氨酸刺激有反应。现在，将绿色LED对准视网膜的上表面。在数据采集软件中输入文件名，然后点击“记录”按钮，开始记录。记录开始后，打开刺激控制程序，点击“读取刺激文件”按钮，加载默认的刺激文件。接下来，单击运行刺激文件按钮以启动默认的刺激文件。刺激文件运行完成后，停止记录以保存文件，供后续进行峰电位分选和数据分析。以下是来自九个PMEA电极的代表性记录，显示了在绿色LED视觉光刺激期间经过高通滤波的电极数据，其中每个矩形框代表来自一个独立电极的神经信号数据。每个电极记录均显示了在打开绿色LED后第一秒内采集的数据。通过设定-18微伏的阈值电压来识别动作电位。除顶部中央电极表现出对光的抑制性反应外，其余所有电极均在视觉刺激下出现了脉冲放电的爆发。相同电极的类似图谱，显示了在无视觉或注射刺激情况下的自发神经活动。尽管存在较小的簇状放电，但其峰电位模式与视觉刺激诱发的记录结果显著不同。以下是中央电极注射谷氨酸后立即记录的同一电极子集的代表性记录结果。注射的谷氨酸在中央电极处引发了一连串的放电脉冲，其特征与视觉诱发的脉冲爆发非常相似。其他所有电极均未受到谷氨酸注射的影响，这证明了该化学刺激技术具有很高的空间分辨率。一旦掌握，该技术若操作得当，可在四到六小时内完成。在进行该操作时，重要的是要持续监测灌注情况，以确保在整个实验过程中视网膜持续获得氧气和营养供应。该技术可能为人工视觉和视觉假体开发领域的研究人员探索基于化学的神经调节方法以治疗光感受器变性疾病导致的失明铺平道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用神经递质实现视网膜神经元的神经调节。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

大鼠视网膜仿生化学调节的神经递质谷氨酸的体外实验方法

免疫组织化学实验方案用于研究特定蛋白质在视网膜中的定位。钙成像技术用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。...

大鼠视网膜全层标本的免疫组织化学与钙成像方法

本研究建立了一种用于未来临床前治疗测试的离体灌流牛视网膜标准化应激模型。评估了缺氧（纯N2）或谷氨酸应激（250...

谷氨酸与缺氧作为离体灌注脊椎动物视网膜的应激模型

后包埋免疫胶体金法是进行特定分子亚细胞定位高分辨率分析的最有效方法之一。本文介绍了一种定量分析视网膜带状突触处谷氨酸受体的实验方案。...

视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析

本文阐述了如何通过光遗传学工具的病毒转导与冰冻断裂复型免疫标记技术相结合，对具有已鉴定的突触前和突触后成分的突触处神经递质受体的表达进行定量，并分析其分布模式。...

结合光遗传学与冰冻断裂复制免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布

在此，我们介绍一种用于精确测量张力性和时相性细胞外谷氨酸变化的空间和时间分辨方法的实验装置搭建、软件操作及数据分析流程 体内 使用酶联微电极阵列（MEA）。...

利用基于酶的生物传感器测量阿尔茨海默病小鼠模型中的紧张性和时相性谷氨酸

本文介绍了一种利用原代小鼠中脑神经元培养物，在体外检测中脑神经元内Ca2+流及其对caspase-3下游效应的方法。该模型可用于研究与中脑神经元Ca2+活动异常相关的病理生理变化，并用于筛选具有抗凋亡特性的新型治疗药物。...

量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca2+ 流及其下游效应

我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。...

轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

对现有的多电极阵列或膜片钳设备进行改造可实现 离体 使视网膜电图更广泛可及。改进的记录与维持方法 离体...

优化实验装置与条件 离体 用于研究大小眼视网膜功能的视网膜电图

该方案表明，通过将突触膜微量移植到Xenopus...

突触膜微移植以重激活人突触受体用于功能研究

视网膜假体能够产生视觉感知。为了推动新型假体的开发，需要在植入前使用离体（ex...

电刺激下平铺视网膜的钙成像

学习使用谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经刺激的体外实验方法。该技术通过神经递质调节视网膜神经元，为治疗光感受器退行性病变导致的失明提供新途径，具有更高视觉敏锐度和更自然视觉体验的潜力。

利用神经递质谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经调节的方法学体外

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