Name: 后半圆管法在新生小鼠内耳基因传递中的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: 了解后半圆管法用于新生小鼠内耳基因传递的技术。该方法可靠且易于掌握，可在十分钟内完成手术操作，为内耳基因治疗研究提供高效工具。

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本工作获得了美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）院内研究部/美国国立卫生研究院（NIH）基金的支持（项目编号 DC000082-02 赠予 W.W.C.，以及项目编号 DC000081 赠予先进成像核心实验室）。我们感谢 NIDCD 动物设施工作人员对我们实验动物的悉心照料。

所有动物实验程序均经国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD ASP1378-15）动物护理与使用委员会批准。
1. 实验步骤的设置与准备
<ol>
	<li>实验开始时，使用环氧乙烷对所有器械进行灭菌。在不同动物之间，采用玻璃珠灭菌器清洁器械。</li>
	<li>将含有病毒基因治疗药物的溶液装入显微注射仪上的微量移液器中。本研究使用的病毒载体为 AAV2/8-whirlin（每毫升含 1 × 1013 个基因组拷贝，参见材料表）。 
	注意：通常将总量为 1.1 µL 的溶液装入微量移液器中。</li>
</ol>
2. 麻醉
注意：本研究使用的小鼠品系为whirler小鼠。实验中同时使用了纯合突变体（Whrnwi/wi）和杂合子同窝小鼠（Whrn+/wi）。
<ol>
	<li>将母鼠放入单独的笼子中（与幼崽分开）。</li>
	<li>将装有幼崽（P0–P5仔鼠）的原笼置于循环加热垫上（设定为37.5 °C），以保持小鼠体温。</li>
	<li>剪下乳胶手套的拇指部分，并将一只仔鼠放入其中。</li>
	<li>将装有仔鼠的乳胶手套拇指部分放入盛有冰块的桶中，持续约2分钟。</li>
	<li>将麻醉后的仔鼠置于一个大型方形商用塑料冰袋上，仔鼠与冰袋表面之间垫有一块4&#34; x&#160;4&#34;的纱布。</li>
	<li>用碎冰填满一只耐用型乳胶手套，然后将该冰手套环绕放置在仔鼠周围。</li>
	<li>通过观察仔鼠对各种刺激（包括用力捏脚趾）是否完全无反应，来判断其麻醉是否充分。在手术期间（约5–10分钟）保持仔鼠处于冰袋上。 
	注意：我们建议在手术过程中让仔鼠停留在冰袋上的时间不超过15分钟。</li>
</ol>
3. 手术入路（图1）
<ol>
	<li>动物麻醉后，用碘伏擦拭液和酒精擦拭液清洁耳后皮肤。</li>
	<li>使用显微剪刀在耳后约 2 mm 处做耳后切口，并用显微剪刀分离胸锁乳突肌。</li>
	<li>辨认面神经和鼓泡。此年龄段的鼓泡为软骨性且半透明，位于面神经内侧。此时可通过鼓泡观察到镫骨动脉，可作为有用的解剖标志。</li>
	<li>沿面神经向头侧和尾侧追踪，以定位后半规管（PSCC）。使用显微剪刀去除覆盖在后半规管表面的肌纤维和软组织。 
	注意：此年龄段的后半规管为软骨性结构。</li>
	<li>使用连接在显微注射仪上的玻璃微移液管（直径约 10 μm）穿通后半规管。</li>
	<li>将病毒基因治疗药物注射至内耳。 
	注意：通常在约 40 秒内向后半规管注射 20 次，每次 49 nL，总注射量约为 1 µL。所用病毒滴度为 1 × 1013 基因组拷贝/mL。</li>
	<li>使用 5-0 聚乳酸羟乙酸缝线缝合皮肤切口。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>将幼鼠置于加热垫上，并在麻醉恢复期间通过戴手套的手指持续进行手动刺激或滚动，以恢复其正常体温。</li>
	<li>待幼鼠苏醒后，将其放回原居住的笼具中。</li>
	<li>用接触过原笼具垫料的棉签轻轻擦拭每只幼鼠。 
	注意：此步骤的目的是使幼鼠的气味与手术前一致，从而提高母鼠在术后重新接受幼鼠的可能性。如条件允许，可收集母鼠尿液，并用棉签将其涂抹于幼鼠身上，以进一步降低被遗弃的风险。</li>
	<li>在母鼠鼻部涂抹矿物油以降低其嗅觉敏感性8，然后将母鼠重新放回原笼具中。</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

作者没有相关披露事项。

已有多种手术方法被用于进入啮齿类动物的内耳。耳蜗开窗术和圆窗途径是最常用于进入耳蜗的方法，而后半规管和内淋巴囊途径通常用于进入前庭器官1。在最近的一项研究中，我们发现通过后半规管注射病毒基因治疗剂，可在前庭器官和耳蜗中均实现高效的毛细胞转导5。事实上，在同一遗传性耳聋和前庭功能障碍小鼠模型中，与圆窗注射相比，后半规管注射所实现的耳蜗毛细胞转导效率更高5,9。鉴于圆窗与耳蜗在解剖结构上邻近，圆窗注射导致的耳蜗毛细胞转导效率反而低于后半规管注射，这一现象看似矛盾。这一发现可能的解释是，圆窗邻近耳蜗导水管；因此，当病毒基因治疗剂经圆窗注射时，其浓度可能因来自耳蜗导水管的脑脊液而被稀释10。
其他研究也报道了后半规管注射可导致耳蜗和前庭毛细胞转导的现象11,<su...

内耳基因治疗是一个快速发展的研究领域。该技术已在多种动物模型中用于对抗耳毒性、噪声性损伤以及遗传性听力损失1。最近多项研究表明，在通过内耳基因治疗递送治疗基因后，突变小鼠的听力和平衡功能实现了功能性恢复2,3,4,5,6,7。决定内耳基因治疗成功与否的关键因素之一是用于进入内耳的手术入路。理想的手术入路应易于操作，解剖标志应清晰且易于识别，并能实现对靶向细胞类型的高效转导。
在最近的一项研究中，我们发现，当通过whirler突变小鼠（一种听力损失和前庭功能障碍的模型）的后半规管注射病毒基因治疗剂时，前庭器官以及耳蜗中的感觉毛细胞均实现了高效的转导5。感觉毛细胞高效转导的结果是，这些突变小鼠的听觉和前庭功能得到了改善。
本文详细描述了通过后半规管入路进入新生小鼠内耳的方法。

<table><tbody><tr><td>手术显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico ENT 显微镜。其他解剖显微镜也可使用。</td></tr><tr><td>微型镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10, 11295-51</td><td>#5 和 #55 Dumont 镊子</td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter2000 微量注射仪</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Mastex</td><td>Model 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl 缝合线</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-whirlin</td><td>Vector Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>硼硅酸盐玻璃</td></tr></tbody></table>

新生小鼠内耳基因递送的后半规管入路

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

内耳基因治疗作为治疗听力损失和眩晕的潜在方法，具有广阔的应用前景。内耳基因治疗成功的关键因素之一是找到一种递送方法，能够在最大限度减少听力损失的同时，实现对靶向细胞类型的稳定转导效率。在本研究中，我们描述了经后半规管途径作为新生小鼠内耳基因递送的一种可行方法。我们证明，通过后半规管进行基因递送能够灌注整个内耳。由于后半规管解剖位置易于识别，且所需对颞骨的操作极少，因此该手术途径成为内耳基因递送的一种理想选择。

通过后半规管将AAV8-whirlin基因治疗药物注射到新生whirler小鼠体内，导致椭圆囊毛细胞中表达whirlin蛋白（绿色）（图2），总体感染效率为53.1%（标准差38.1，n = 28）5。与对侧未注射耳的毛细胞相比，转导后的毛细胞具有更长的静纤毛（红色）（分别为5.35 ± 2.11 µm vs. 3.20 ± 0.34 µm）5。
在whirler小鼠中，向后半规管注射AAV8-whirlin也导致耳蜗毛细胞的转导（图3）。内毛细胞的平均感染效率为77.1%（标准差12.7，n = 8）5。与对侧未注射耳的毛细胞相比，转导的毛细胞在静纤毛尖端表达whirlin（绿色），且静纤毛...

本研究中，我们描述了通过后半规管途径作为向新生小鼠内耳递送基因的可靠方法。我们证明，通过后半规管进行基因递送能够灌注整个内耳。

内耳基因治疗作为治疗听力损失和眩晕的潜在手段，展现出巨大前景。其中，决定其成功的关键因素之一是……

本实验的总体目标是进入小鼠内耳以实现基因递送。该方法可高效地将基因治疗递送至小鼠内耳。该技术的主要优势在于其可靠性高且易于掌握。初学者通常会因小鼠内耳体积较小而遇到困难。然而，经过练习后，大多数人可在十分钟内完成手术解剖。开始操作时应使用无菌器械，并开启珠式灭菌器，以便在处理不同动物之间对器械进行消毒。将治疗性病毒载入连接至显微注射仪的直径为十微米的显微注射针中。我们在实验中使用的病毒载体为AAV28-whirlin，滴度为每毫升1×10¹³个基因组拷贝。本视频中为便于观察，使用了亚甲蓝染料。用聚维酮碘擦拭耳后皮肤三次，随后用酒精棉擦净。然后使用显微剪刀在耳后约两毫米处做一个耳后切口，并分离其下方的软组织。辨认面神经和鼓泡。胸锁乳突肌与面神经呈垂直走向。通过鼓室可见镫骨动脉，这是一个有用的解剖标志。沿面神经向后上方追踪，可找到后半规管。使用显微剪刀去除覆盖在后半规管上的肌肉纤维和软组织。然后，将装有染料的玻璃微量移液管通过显微注射仪刺入后半规管，并将染料注入内耳。通常在40秒内完成20次注射，每次49纳升，总注射量约为1微升。注射完最后一剂量后立即移开移液器。随后使用5-0聚乳酸羟基乙酸缝线闭合皮肤切口。如本视频所示，向新生 whirller 小鼠注射 AAV8-whirlin 后，可在椭圆囊毛细胞中观察到 whirlin 的表达（绿色信号）。与对侧未注射耳的毛细胞相比，转导后的毛细胞具有伸长的静纤毛，以红色显示。在whirler小鼠中，向后半规管注射AAV8-whirlin也导致耳蜗毛细胞的转导。转导的毛细胞在静纤毛尖端表达whirlin，且其静纤毛较对侧未注射耳的毛细胞更长。采用此方法后，还可进行ABI和立体测试等其他方法，以回答更多问题，例如内耳基因递送是否会影响听觉和前庭功能。该技术建立后，为内耳基因递送领域的研究人员探索小鼠内耳基因递送缺陷开辟了道路。

posterior-semicircular-canal-approach-for-inner-ear-gene-delivery

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

后半圆管法在新生小鼠内耳基因传递中的研究

小鼠内耳是一种由外胚层生发层（placode）衍生而来的感觉器官，其发育程序在胚胎发育期间逐步展开。我们定义了一种 在子宫内 基因转移技术，包括三个步骤：小鼠腹部剖腹术、经子宫显微注射和 体内...

将基因转移至发育中的小鼠内耳 在体 内 电穿孔

来源：Kozin, E. D., 等．用于听觉通路光遗传学刺激的小鼠背侧耳蜗核直接可视化．J. Vis. Exp.

利用病毒介导的基因转移技术向小鼠背侧耳蜗核导入基因以实现光诱导听觉刺激

本视频展示了经半规管造瘘术（canalostomy），该方法可通过半规管将药物局部递送至小鼠内耳，同时最大程度减少对听力和前庭功能的损伤。该技术可实现将病毒载体、药物及小分子化合物接种到小鼠内耳中。...

用于成年小鼠内耳局部给药的耳蜗造口术

来源：Akil, O., et al., 通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法。J. Vis. Exp.

基于病毒载体的基因疗法在小鼠模型中恢复听力的研究

所述的耳后手术入路可实现快速、直接地将药物递送至小鼠耳蜗的鼓阶，同时最大限度减少出血量和动物死亡率。该方法可通过圆窗膜向新生后小鼠递送分子、药物及病毒，用于耳蜗治疗。...

通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法

我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。...

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

本实验方案的目的是概述一种手术方法，以在小鼠模型中直接进入背侧耳蜗核。...

直接可视化小鼠背侧耳蜗核以实现听觉通路的光遗传学刺激

本文描述了两种用于向内耳局部给药的显微外科手术方法，并在听力参数、耳蜗细胞结构以及炎症标志物表达方面对二者进行了比较。...

靶向小鼠内耳给药方法的比较研究：鼓泡术 与 经鼓室注射

本实验方案旨在演示新生小鼠耳蜗组织块的制备、培养、处理及免疫染色。该技术可作为 体外...

新生小鼠耳蜗外植体技术作为一种 体外 听力研究中的筛查工具

我们报道了一种通过圆窗膜向非人灵长类动物——普通狨猴（Callithrix...

一种在非人灵长类动物普通狨猴（Callithrix jacchus）中向内耳给药的外科手术方法

本文介绍了一种经半规管进行局部给药的耳蜗造口术（canalostomy），该方法可将药物递送至成年及新生小鼠的内耳，同时对听力和前庭功能造成的损伤最小。该技术可用于向小鼠内耳接种病毒载体、药物以及小分子化合物。...

耳道造口术作为向成年及新生小鼠内耳局部给药的一种外科手术方法

了解后半圆管法用于新生小鼠内耳基因传递的技术。该方法可靠且易于掌握，可在十分钟内完成手术操作，为内耳基因治疗研究提供高效工具。

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