寡 peptoids 的合成及质谱分析

该程序的总体目标是演示如何手动合成寡肽类化合物以及如何使用质谱技术分析其单体序列。该方法可以帮助初学者回答类肽领域的关键问题，例如如何制备类肽以及如何表征它们的单体序列。该技术的主要优点是可以在标准分析化学实验室中合成和分析具有特殊单体残基的类肽。

尽管这种方法侧重于寡肽类化合物，但它也可以应用于其他系统，例如肽和寡核苷酸。通常，刚接触该技术的人会遇到困难，因为如果没有视觉演示，很难实现最佳质谱条件。当我们想通过串联质谱法表征类肽的结构特征时，我们第一次想到了这种方法。

首先称取 84 毫克 Rink 酰胺树脂，并将其添加到 10 毫升聚丙烯固相反应容器中。然后将柱塞插入容器中。然后，向反应容器中加入 2 毫升 TMF，并用压力盖住容器。

在室温下，在摇床上以大约 12 度的运动角度和每分钟 385 次振荡搅拌容器，持续 30 分钟。取下盖子后，推动反应容器的柱塞，将溶液排空到废液容器中。向容器中加入 2 毫升 20% 哌啶的 DMF 溶液，并加盖容器。

搅拌容器 2 分钟后，将溶液排空到废液容器中。重复该过程，向容器中加入 2 毫升 20% Pep DMF 溶液并盖上容器。在摇床上搅拌 12 分钟，然后将溶液排空到废液容器中。

洗涤树脂后，通过在烧杯中混合 1 毫升 0.8 摩尔溴乙酸的 DMF 和 1 毫升 0.8 摩尔 DIC 的 DMF 溶液进行溴乙酰化反应。将混合物转移到含有树脂的反应容器中，并盖上容器。在室温下在摇床上搅拌容器 20 分钟。

搅拌后，将溶液排空到废液容器中。清洗树脂后，进行置换反应，但向容器中加入 1 毫升 1 摩尔 2 甲氧基乙胺的 DMF 溶液。加盖容器后，在室温下搅拌 60 分钟。

然后将溶液排空到废液容器中。单体添加循环完成后，在烧杯中混合 92 微升乙酸酐、43.5 微升 DIPEA 和 2 毫升 DMF，制成乙酰化混合物。将乙酰化混合物添加到含有树脂的容器中。

加盖容器后，在室温下搅拌 60 分钟。完成后，将溶液排空到废液容器中。用 DCM 洗涤树脂后，在烧杯中混合 3.8 ml TFA、100 μL 三异丙基硅烷和 100 μL HPLC 级水，制成裂解混合物。

立即将裂解混合物添加到含有树脂的容器中。在室温下搅拌容器 2 小时后，取下盖子，将滤液收集到 50 毫升聚丙烯离心管中。向容器中加入 1 毫升 TFA 并加盖。

搅拌 1 分钟后，将滤液收集到同一离心管中。接下来，用平缓的氮气流蒸发 TFA，直到剩余约 1 毫升的粘稠溶液。向粘稠溶液中加入 15 毫升乙醚，并盖上离心管。

将混合物在零下 20 摄氏度的冰箱中孵育至少两个小时，以获得白色固体沉淀。孵育后，在保持离心管冷却的同时，使用 4427 倍 G 的离心机沉淀固体 10 分钟。完成后，取下管盖，小心地将乙醚倒入烧杯中。

用乙醚洗涤固体后，用温和的氮气流将其干燥。接下来，加入 10 毫升 HPLC 级水以溶解干燥的固体。将溶液通过端口尺寸为 0.45 微米的尼龙针式过滤器，并将滤液收集到预先称重的 50 毫升聚丙烯离心管中。

通过在含有液氮的 12 盎司双层堆叠发泡聚苯乙烯杯中旋转离心管来搁置冷冻类肽溶液。然后将冷冻溶液冻干过夜，得到固体类肽。制备用于 MS 分析的类肽样品溶液后，以 4427 倍 G 离心 3 分钟，去除稀释溶液中任何可能的不溶性颗粒。

将约 700 微升溶液的顶部转移到另一个 1.5 毫升离心管中，制成浓度约为 10 至负 5 磨牙的类肽 MS 工作溶液。设置 MS 仪器参数后，将大约 300 μL 的类肽 MS 工作溶液加入 1 mL 注射器中。并使用毛细管聚醚醚酮管将注射器连接到 ESI 入口。

然后将注射器放在注射泵下方，将流速设置为 10 μL/min，将样品溶液注入 ESI 入口。打开 ESI 针电压以激活 ESI 过程，然后打开检测器。设置配置文件模式下的显示以及主装料比或 M/Z 的范围（从 100 到 1500）。

查看剖面图窗口中显示的质谱图。在方法窗口中，使用 2 分钟作为运行时间。然后打开录制窗口，填写 propr 文件名并开始录制频谱。

优化 M/Z 1265 处蛋白类肽峰的强度。将 M/Z 范围设置为 1150 到 1350 并调整毛细管电压，同时查看配置文件窗口中显示的以毫伏为单位的峰值强度。现在在方法窗口中将仪器切换到 MSMS 模式，使用 1265 作为 Q1 第一个质量数，并将 Q1 最后一个质量数留空。

使用 100 作为 Q3 第一个质量，使用 1400 作为 Q3 最后一个质量。然后打开 CID 气体。在此之后，将碰撞能量设置为 45 伏。

以及 1.5 毫托的碰撞气体压力。查看剖面图窗口中显示的质谱图，观察 M/Z 1265 处的肽离子峰以及 M/Z 值较低的峰，这些峰代表来自母离子类肽离子的碎片离子。现在调整碰撞能量和碰撞气体压力以优化碎裂光谱的显示。

在方法窗口中，使用 2 分钟作为运行时间。然后打开录制窗口，填写正确的文件名并开始录制频谱。具有 n 末端乙酰化的合成九美类肽的结构如图所示。

此处显示了类肽的预测碎裂方案，其中虚线圆圈中的质子表示在 CID 实验期间将诱导类肽碎裂的移动质子。如果所有可用的酰胺键都发生碎裂，则总共会形成 8 个 n 端片段和 8 个 C 端片段。例如，B4 离子和 Y5 离子的结构以及相应的主电荷值如下所示。

此处列出了从 V1 到 V8 和从 Y1 到 Y8 的所有碎片离子的计算主电荷值。蛋白化肽离子的全扫描质谱显示 M/Z 1265 处的峰对应于蛋白化物种，M/Z 1287 处的峰对应于类肽的钠离子适应。M/Z 633 和 644 的两个峰分别对应于双蛋白和混合蛋白钠化肽。

蛋白化肽 MSMS 谱图在 M/Z 1265 处显示对应于蛋白物质的峰，在较低质量电荷值处显示对应于肽离子的碎片离子的峰。一旦掌握，合成技术可以在一到两天内完成，质谱技术可以在一到两个小时内完成，如果作得当。在尝试质谱程序时，检查仪器的性能很重要。

如有必要，可以对乐器进行自动调音。按照此程序，可以执行其他方法，例如挤入建模，以回答其他问题，例如类肽可以适应哪些可能的确认。该技术开发后，为研究人员探索先进的质谱技术和结构表征铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何手动合成类肽以及如何使用质谱技术分析单体序列有很好的了解。不要忘记，使用化学品可能非常危险，因此在执行此程序时应始终使用个人防护设备。