Name: 胞外酸性 pH 培养体系的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习建立体外酸性肿瘤微环境培养体系，使用DMEM培养基和碳酸氢钠溶液调控pH值，以研究癌细胞在酸性条件下的恶性进展机制，为肿瘤生物学和酸中毒相关疾病治疗提供可靠实验方法。

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我们感谢东京大学综合学术研究院基因组科学部门及系统生物学与医学实验室的各位成员。特别感谢东京大学综合学术研究院系统生物学与医学实验室的阿布谷荣一博士、児玉龙彦博士、富塚浩司博士、吉田智幸博士以及安藤博士。 
Kunisato（江崎格力高株式会社）在讨论与支持方面提供的帮助。本研究部分得到了青年科学家研究资助（A）（26710005，T.O.）、创新领域科学研究资助（26116711 和 16H01567，T.O.）以及挑战性研究资助的支持 
日本文部科学省探索性研究（16K14605，T.O.）、武田科学振兴财团（T.O.）、小林癌症研究财团（T.O.）、癌症研究与治疗创新项目（P-CREATE）以及日本医疗研究开发机构（AMED）的创新癌症控制实用研究项目（T.O.）。

1. 酸性培养基的制备
<ol>
	<li>对照（pH 7.4）和低pH（pH 6.8）培养基的制备
	<ol>
		<li>将4.75 g不含L-谷氨酰胺的DMEM粉末溶解于500 mL水中。</li>
		<li>在耐压瓶中配制0.33 M NaHCO3溶液。 
		注意：必须使用耐压瓶，因为NaHCO3在加热并发生热分解时会释放CO2气体。</li>
		<li>对培养基和溶液进行高压灭菌，并使其冷却至25 °C。</li>
		<li>向500 mL不含碳酸氢盐的DMEM中加入5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、5 mL青霉素-链霉素溶液和50 mL胎牛血清。</li>
		<li>对于对照组（pH 7.4）培养基，每100 mL不含碳酸氢盐的DMEM中加入2.4 mL 0.33 M NaHCO3溶液；对于低pH（pH 6.8）培养基，每100 mL不含碳酸氢盐的DMEM中加入0.6 mL 0.33 M NaHCO3溶液。</li>
		<li>将培养基在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时后检测其pH值。 
		注：所需添加的NaHCO3溶液体积需根据培养基实际pH值进行调整，而该pH值可能因培养箱内CO2浓度和大气压的不同而有所变化。理想情况下，首次操作时应使用不同浓度的碳酸氢盐溶液测定培养基pH，以确定向DMEM中添加NaHCO3溶液的最佳用量。
		<ol>
			<li>从CO2培养箱中取出培养皿后立即收集培养基，并使用pH计测量其pH值。必要时，可通过水浴维持培养基温度为37 °C。独立重复测量培养基pH值三次。 
			注：NaHCO3溶液应储存于4 °C，且每次实验均应新鲜配制培养基。本研究中可使用的商品化产品列于材料表中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备乳酸诱导或HCl诱导的酸性培养基
	<ol>
		<li>向100 mL对照培养基（按步骤1.1.5制备）中加入74 µL乳酸溶液或125 µL 1 M HCl。</li>
		<li>将培养基在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时后检测其pH值。 
		注：乳酸或HCl溶液的添加量也需根据培养基pH值进行调整，而该pH值可能因培养箱内CO2浓度和大气压的不同而有所变化。理想情况下，应通过系列浓度的乳酸或HCl溶液进行测试，以确定将培养基调节至目标pH值所需的合适添加量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞的收获与处理
<ol>
	<li>在进行实验前至少1周，于37 °C、5% CO2条件下开始培养细胞。 
	注意：本研究中使用的细胞系列于材料表中。</li>
	<li>当细胞融合度达到70 - 90%时进行传代。切勿让细胞完全融合。日常培养期间每2 - 3天更换一次培养基。</li>
	<li>加入5 mL PBS洗涤细胞，吸除PBS后加入解离酶（如1 mL胰蛋白酶）。</li>
	<li>在37 °C孵育，直至细胞变圆并开始脱落。</li>
	<li>向脱落的细胞中加入5 mL培养基以终止酶反应。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，以300 × g离心3分钟。吸除上清液，并用培养基重悬细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数活细胞。</li>
	<li>在10 cm培养皿中每孔接种5.0 × 105个细胞，加入10 mL培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	<li>吸除培养基，用5 mL PBS洗涤细胞，加入10 mL第1节中配制的酸性培养基。于37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。</li>
</ol>
3. RNA 提取
<ol>
	<li>吸去培养基，用 5 mL PBS 洗涤细胞。加入 RNA 提取试剂（见材料表）裂解细胞。</li>
	<li>短暂刮取培养皿中的细胞，然后用移液器吸出 RNA 提取试剂，将 RNA 提取试剂/细胞裂解液转移至 1.5 mL 离心管中。室温静置 5 分钟。</li>
	<li>加入 250 µL 氯仿，剧烈振荡离心管约 15 秒。室温静置 5 分钟后，在 ≥8,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器小心吸取上层水相，保留部分水相，避免吸入中间层或有机相。将水相转移至另一支 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>向水相中加入 550 µL 异丙醇，轻轻混匀。室温静置 5 分钟，在 4 °C 条件下以最大转速（≥20,000 × g）离心 20 分钟。</li>
	<li>小心倒去异丙醇，加入 1 mL 用 DEPC 处理过的水配制的 75% 乙醇。轻轻混匀后，在 8,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器吸去乙醇，让 RNA 沉淀在室温下自然晾干。</li>
	<li>根据 RNA 产量，向 RNA 沉淀中加入约 15–25 µL DEPC 处理过的水，充分混匀溶解 RNA。</li>
	<li>使用分光光度计在 260 nm 处测定吸光度（OD），以测定所提取 RNA 的浓度。</li>
</ol>
4. cDNA 合成
<ol>
	<li>在 PCR 反应管中加入以下组分：最多 5 µg 总 RNA、1 µL Oligo dT（50 µM）或随机引物混合物（60 µM）、1 µL 10 mM dNTP，并用无核酸酶水补至总体积为 14 µL。</li>
	<li>混匀后，使用小型台式离心机短暂离心（约 5 秒）。在 65 °C 下变性样品 RNA/引物 5 分钟。再次短暂离心（约 5 秒），立即将样品置于冰上至少 1 分钟。</li>
	<li>加入以下组分：4 µL 5x&#160;逆转录缓冲液、1 µL 逆转录酶（200 U/µL）、1 µL RNase 抑制剂（40 U/µL）。 
	注：商品化试剂盒的示例见材料表</li>
	<li>盖紧管盖，混匀后使用小型台式离心机短暂离心（约 5 秒）。将反应混合物在 50–55 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>在 80 °C 下孵育 10 分钟以终止反应。</li>
</ol>
5. 使用实时 PCR 检测酸响应基因表达
<ol>
	<li>在384孔反应板中加入以下组分：1 µL 模板cDNA、0.75 µL 10X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine、0.3 µL 50 µM 正向引物、0.3 µL 50 µM 反向引物、1 µL Taq聚合酶、2.5 µL 10x&#160;Taq聚合酶缓冲液、2.5 µL 20 mM dNTP、16.65 µL 水。 
	注： commercially available kits 的示例见材料表。引物列表见表1。此步骤也可使用96孔反应板。其他探针（例如，Taqman探针）也可使用。</li>
	<li>在实时PCR系统上设置实验及以下PCR程序：50 °C 反应2 min，1个循环；95 °C 预变性10 min，1个循环；95 °C 变性15 s 和 60 °C 退火延伸1 min，共40个循环；95 °C 15 s，1个循环；60 °C 15 s，1个循环；95 °C 15 s，1个循环。</li>
	<li>将反应板放入qPCR仪中，启动程序。 
	注：pH响应基因MSMO1、INSIG1和IDI1的上调可通过蛋白水平进行检测。</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue%3A+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li>
<li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Why do cancers have high aerobic glycolysis?</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li>
<li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li>
<li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752(2015).</li>
<li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li>
</ol>

作者 Ayano Kondo 就职于协和发酵麒麟株式会社。

在此，我们描述了一种简单的酸性pH培养体系及其评估流程。该体系结合了三种培养基酸化方法， 即降低碳酸氢盐浓度、添加乳酸以及添加盐酸，使我们能够深入研究pH响应机制，并将细胞对其他肿瘤微环境条件（如缺氧或营养缺乏）的反应进行比较。
该方法的关键在于确定培养基中碳酸氢盐、乳酸和盐酸的适当浓度。首次使用该方法时，通过检测不同碳酸氢盐浓度下的培养基pH值，以确定培养基中NaHCO3的合适添加量，这一点非常重要。在此过程中，必须在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时后测定培养基的pH值，因为培养基温度和CO2的平衡状态会显著影响其pH值。通常建议对碳酸氢盐溶液进行高压灭菌，因为碳酸氢盐容易分解失效。细胞密度和细胞融合度是关键因素，因为大量增殖的癌细胞即使在对照样本中也容易使培养基酸化。此外，细胞对外界酸性pH的反应依赖于细胞状态，并可能随着传代次数增加而减弱，因此实验中使用的细胞传代次数均少于10代。
我们的方法已显著证明培养基 pH 值在 24 ...

肿瘤微环境在肿瘤进展和癌细胞代谢中发挥着关键作用1,2,3。癌细胞常常暴露于缺氧、营养缺乏以及酸性细胞外pH（pHe）等条件下。然而，与缺氧或营养剥夺相比，pHe在肿瘤进展中的作用尚未被充分阐明。肿瘤组织中的pHe可呈酸性，最低可达约pH 6.84,5。这种酸性pH主要源于增殖的癌细胞通过有氧和无氧糖酵解过程排出质子（H+）和乳酸所致5,6。
近期研究表明，细胞外酸化可诱导组蛋白去乙酰化、脂肪酸氧化以及酸性溶酶体的胞吐作用，以适应严苛的酸性环境7,8,9,10。然而，细胞外酸化如何影响肿瘤细胞行为的机制，以及酸性pH肿瘤微环境中关键调控因子的身份，尚未完全明确。此外，已有多个研究报告采用了不同浓度的碳酸氢盐、Tris、PIPES和HEPES缓冲液或乳酸、HCl来配制酸性培养基，但鲜有研究对调节后的培养基稳定性进行验证，也缺乏对多种不同酸性培养基的系统性比较7,8,9,10
为了阐明细胞外酸化背景下癌细胞中的关键调控因子和代谢变化，我们建立了一种简单的体外培养模型以维持酸性细胞外pH（pHe），并研究了pHe在癌细胞中的作用11。利用该方法，我们在37 °C、5% CO2条件下，通过降低培养基中的碳酸氢盐浓度，维持pHe为6.8的酸性培养环境；以pH 7.4作为正常对照培养基。在培养PANC-1和AsPC-1胰腺癌细胞期间，培养基pH可稳定维持至少24小时，并在72小时内逐渐下降。由于糖酵解增强不仅加速质子的排出，也促进乳酸的释放7,8,9，我们还建立了通过添加乳酸而非降低碳酸氢盐浓度来模拟乳酸诱导性酸中毒的培养方法。此外，通过盐酸（HCl）诱导培养基产生酸性pHe，可排除细胞对酸性pH的反应源于碳酸氢盐浓度降低的可能性。同时，使用pH范围为6.4至7.4、碳酸氢盐浓度不同的多种培养基，可评估细胞外pH对细胞反应影响的程度。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素混合溶液（稳定型）</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的0.5 g/L胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA溶液</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%台盼蓝染色液</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>乳酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>盐酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 第一链合成系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计（带Wi-Fi）</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 实时荧光定量PCR系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

建立细胞外酸性ph培养系统

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

肿瘤微环境的条件（如缺氧或营养缺乏）在癌症进展和恶性转化中起着关键作用。然而，与缺氧或营养缺乏条件相比，细胞外酸性pH在肿瘤侵袭性中的作用及其潜在机制尚未得到充分研究。此外，目前尚未有明确定义的培养方法用于模拟细胞外酸性肿瘤微环境。
这里我们介绍一种简单的方法 体外 采用减少碳酸氢盐并增加乳酸或盐酸浓度的培养基来维持酸性细胞外pH的培养方法。该培养基的pH值在PANC-1和AsPC-1胰腺癌细胞培养中至少可维持24小时，并在72小时后逐渐下降。本研究中的三种不同酸性培养条件显著上调了pH响应基因，例如 MSMO1, INSIG1，以及 IDI1 与缺氧或营养缺乏相比. 这些基因的上调可作为酸性pH的标志物。这些简单技术有助于阐明肿瘤在酸性肿瘤微环境下的恶性机制。因此，我们的细胞外酸性pH培养系统不仅可用于发现癌细胞对酸性pH的细胞反应，还可用于研究与糖尿病酮症酸中毒、乳酸酸中毒、肾小管酸中毒和呼吸性酸中毒等其他酸性紊乱相关的原代细胞（如肾小管上皮细胞）的酸性pH响应。

为了确定合适的碳酸氢盐浓度，我们配制了含 0 - 8 mM NaHCO3（培养基中的终浓度）的 DMEM，并成功制备出 pH 范围为 6.4 - 7.4 的培养基（图 1）。根据先前报道中指出实体瘤的细胞外 pH 可达 6.8，我们以含 8 mM NaHCO3 的 DMEM（pH 7.4）作为对照培养基，以含 2 mM NaHCO3 的 DMEM（pH 6.8）作为酸性 pH 培养基4,5。在 PANC-1 和 AsPC-1 细胞培养过程中，酸性培养基的 pH 在 24 小时内保持稳定，并在 72 小时内逐渐下降至约 pH 6.6（图 2）。接下来，为了确定将对照培养基（pH 7.4）调节至 pH 6.8 所需的乳酸或 HCl 用量，我们在对照培养基中加入不同量的乳酸或 H...

酸性肿瘤微环境在肿瘤进展中发挥关键作用。为评估酸性细胞外pH值对癌细胞的影响 体外 我们建立了简单的酸性培养体系。

建立细胞外酸性pH培养系统

肿瘤微环境的条件（如缺氧或营养缺乏）在癌症进展和恶性转化中发挥关键作用。然而，……

本简单体外培养方法的总体目标是阐明在酸性肿瘤微环境中肿瘤恶性行为的潜在机制。该方法有助于解答肿瘤生物学领域的一些关键问题，例如肿瘤微环境刺激下癌症进展和恶性转化的潜在机制。该技术的主要优势在于培养基 pH 值的稳定性，以及能够同时比较多种不同酸性 pH 值的培养基。该技术的应用不仅延伸至癌症治疗，还可用于酸相关疾病的治疗，因为酸中毒可能与多种疾病类型相关。首先，将4.75克含L-谷氨酰胺的DMEM粉末溶解于500毫升水中。同时，在耐压瓶中配制0.33摩尔的碳酸氢钠溶液。将培养基和溶液进行高压灭菌。待这些缓冲液冷却至25摄氏度后，向500毫升不含碳酸氢盐的DMEM中加入5毫升200毫摩尔/升L-谷氨酰胺、5毫升青霉素-链霉素溶液以及50毫升胎牛血清。作为对照培养基，每100毫升不含碳酸氢盐的DMEM中加入2.4毫升0.33摩尔/升碳酸氢钠溶液。对于低pH培养基，每100毫升无碳酸氢盐的DMEM中加入0.6毫升0.33摩尔的碳酸氢钠溶液。接着，向100毫升对照培养基中加入74微升乳酸溶液，以制备乳酸诱导的酸性培养基。制备盐酸诱导的酸性培养基时，向100毫升对照培养基中加入125微升1摩尔的HCl。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时后，检测培养基的pH值。从培养箱中取出培养皿后，立即收集培养基。如有需要，使用水浴将培养基温度保持在37摄氏度。使用 pH 计独立测量 pH 值三次。在进行实验前至少一周，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下开始培养细胞。加入 5 mL PBS 清洗细胞。吸去 PBS，加入解离酶（如胰蛋白酶）。然后在 37 摄氏度下孵育细胞，直至细胞变圆并开始脱落。接着，向脱落的细胞中加入 5 mL 培养基，以中和酶的活性。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在300 × g条件下离心3分钟。吸除上清液，并用培养基重新悬浮细胞。使用血细胞计数板和台盼蓝染色计数活细胞。每10厘米培养皿中加入10毫升培养基，接种50万个细胞。然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。培养结束后，吸除培养基，用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。然后，加入10毫升酸性培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将细胞培养24小时。吸除培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。通过加入RNA提取试剂并短暂刮取培养皿来裂解细胞。然后用移液器吸除RNA提取试剂，将含有细胞裂解物的RNA提取试剂转移至1.5毫升离心管中。将离心管在室温下静置5分钟。加入 250 微升氯仿，剧烈振荡试管约 15 秒。室温静置 5 分钟后，在至少 8,000 ×g 条件下离心 5 分钟。用移液器小心移取水相。将移除的水相放入另一个1.5毫升离心管中，保留部分水相。随后，向水相中加入550 µL异丙醇，轻轻混匀，室温静置5分钟。然后，在4 °C条件下以最大速度离心样品20分钟。接着，倒出异丙醇，

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

胞外酸性 pH 培养体系的建立

微生物真核生物既是南极常年冰封湖泊中光合作用来源碳的重要生产者，也是顶级捕食性物种。本报告描述了一种富集培养方法，用于从南极博尼湖（Lake...

从化学分层的南极湖泊中建立真核微生物富集培养物并评估其碳固定潜力

本文概述了一种建立 体外 用于研究兼性胞内人类真菌病原体相互作用的细胞培养模型系统 Candida glabrata...

建立一个 体外 用于研究细胞内行为的系统 白色念珠菌 在人THP-1巨噬细胞中

细菌在其生命周期中可能积累有害或有益的突变。在细胞群体中，携带有益突变的个体可能迅速战胜其他个体。本文介绍一种简单的方法，通过使用荧光标记的个体，随时间推移可视化细菌群体内的种内竞争。...

通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

本文的第一部分介绍了如何筛选在细胞质膜上表达囊泡型 Na+/H+ 交换体的突变细胞系。第二部分提供了基于细胞内 pH...

利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 Na+/H+ 交换体并进行功能表征

糖酵解是多种生物系统中一个关键的代谢标志。通过测量细胞外H+通量来监测糖酵解是常见的方法，但需要进行校正才能实现定量和明确的结果。本文演示如何采集并校正细胞外通量数据，以区分细胞外酸化的呼吸源性和糖酵解源性贡献。...

测量与分析细胞外酸产生以确定糖酵解速率

采用一种新颖的方法评估肠道宿主-微生物相互作用，该方法结合了合成口腔菌群、体外胃肠道消化以及小肠上皮模型。本文介绍了一种可灵活应用于评估病原体细胞侵袭、多物种生物膜形成，甚至益生菌制剂存活能力的方法。...

评估合成细菌群落在其上的存活能力 体外 肠道宿主-微生物界面

本文介绍了一种从青鳉（Oryzias...

鱼类垂体原代细胞培养的高质量制备

我们展示了一种通过过滤牙菌斑并与宿主细菌共培养来分离难以培养的新型细菌门——糖杆菌门（Saccharibacteria）成员的方法。...

建立来自口腔的共生糖杆菌稳定二元培养物

本文介绍了一种利用低成本、节能型台式恒温混匀仪作为培养设备，针对嗜热微生物进行实验进化的适应性演化实验方案。该技术通过表征一种最适生长温度为75 °C的古菌——Sulfolobus...

生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌Sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化

本文介绍了一种利用三电极双室生物电化学系统表征乳酸菌介导的胞外电子传递（EET）的实验方案。我们以植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus...

利用三电极双室生物电化学系统表征乳酸菌的介导型胞外电子传递

学习建立体外酸性肿瘤微环境培养体系，使用DMEM培养基和碳酸氢钠溶液调控pH值，以研究癌细胞在酸性条件下的恶性进展机制，为肿瘤生物学和酸中毒相关疾病治疗提供可靠实验方法。

建立细胞外酸性pH培养系统

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