免疫荧光标记的微管和中心蛋白在体内肠道组织和 3D体外肠道 Organoids

我们提出了从体内组织和体外基底基质 organoids 分离肠道3D 结构的协议, 并详细介绍了针对微管免疫标记优化的不同固定和染色方案,中心, 和连接蛋白以及细胞标记包括干细胞蛋白 Lgr5。

该程序的总体目标是分离 3D 体外基底基质嵌入的肠道类器官，然后固定和免疫标记微管和中心体proteins. 3D体外类器官是研究细胞和发育生物学中关键生物学问题的理想模型。但是，在 3D 模型中定位内源性蛋白质和结构比在 2D 培养物中更复杂。

重要的是，固定剂需要保留精细的 3D 结构，同时还要保留抗体抗原性。所提出的方法包括分离、固定和免疫标记 3D 体外肠道类器官。但固定和免疫标记方案也可用于离体分离组织。

所提出的甲醛甲醇固定方案的主要优点是它保留了 3D 结构，同时还保留了抗原性。它能够很好地渗透和清除固定后的 tevel 抗体，从而有效标记微管、肌动蛋白丝和结合蛋白以及包括 ninein 在内的几种中心体蛋白。演示该程序的将是我实验室的正式博士后 Deborah Goldspink 博士和合著者 Zoe Matthews 博士。

分离肠隐窝和绒毛后，可以固定分离的上皮结构进行免疫染色。分离的隐窝可以交替地位于基质圆顶中，然后形成类器官。孵育大约 5 到 7 天后，类器官将形成。

使用 500 微升 RT-PBS 用类器官洗涤含有基底基质圆顶的孔。然后，向每个孔中加入 250 微升冷室回收溶液。接下来，使用 P1000 微量移液器刮擦基底基质圆顶，并在整个孔中小心地上下移液，以从塑料中分解并去除基底基质。

确保回收溶液是冷的，以帮助分解基质。刮擦时，仅使用 P1000 微量移液器，这样就不会分解类器官并保持它们完好无损。将上清液收集在 1.5 ml 低结合微量离心管中。

然后，将试管倒置数次，并在显微镜下以 50 倍放大倍数检查类器官是否已分离、自由移动且未成团。通过在 1， 000 g 和室温下离心 5 分钟来沉淀类器官。然后，取出恢复试剂并立即进行固定。

要用甲醛和甲醇固定先前分离的类器官，请将类器官重悬于负 20 摄氏度的甲醛甲醇固定液中。将类器官在零下 20 摄氏度的冰箱中孵育 15 分钟，每 5 分钟倒置一次试管。然后，以 1， 000 g 离心 5 分钟，使类器官沉淀。

去除固定剂，然后加入由含 1% 二抗血清的 PBS 或含 0.1% 去污剂和 1% 血清的 PBS 组成的洗涤液。像以前一样沉淀样品后，去除洗涤液并将样品重悬于新鲜的洗涤液中。使用试管旋转器洗涤细胞总共 1 小时，每 15 分钟离心一次，使类器官沉淀，然后更换洗涤液。

为了封闭肠道类器官样品，向 PBS 中加入 10% 二抗血清。以 1， 000 g 的浓度沉淀类器官 5 分钟，然后去除上清液。向每个样品中加入 1 mL 封闭溶液，以便在不同的抗体中孵育。

然后，将样品和封闭溶液在试管旋转器上在室温下孵育 1 小时。接下来，在含有 10% 血清和 0.1% 去污剂的 PBS 中稀释一抗。然后，在离心样品并去除封闭溶液后，使用一抗溶液重悬类器官沉淀。

以 20 RPM 和 4 摄氏度旋转试管过夜，以保持类器官悬浮。第二天，将样品放在试管旋转器上恢复至室温 1 小时。离心样品后，去除一抗溶液，向每管中加入 1 毫升洗涤液，然后重悬类器官沉淀。

然后，立即离心除去溶液。加入 1 毫升新鲜洗涤液，并在试管旋转器上以 20 RPM 的速度混合细胞 2 小时。接下来，用 1% 血清和 0.1% 去污剂在 PBS 中稀释二抗。

然后，在沉淀组织后，将沉淀重悬于 200 μL 二抗溶液中。在室温下将试管放在试管旋转器上孵育 1 小时。旋转并去除上清液后，将沉淀重悬于洗涤溶液中，并立即离心样品以沉淀类器官。

然后，去除上清液并将沉淀重悬于 1 毫升新鲜洗涤液中。在室温下将样品在试管旋转器上混合 1.5 至 2 小时，如前所述每 20 至 30 分钟更换一次洗涤液。为了安装类器官，在旋转并去除所有洗涤溶液后，向沉淀中加入两滴带有抗淬灭试剂的硬固封固剂。

切下 P200 微量移液器的末端，小心地将沉淀重悬于封固剂中。在封片剂中重悬固定和染色的类器官时，注意不要引入任何气泡。如果存在气泡，请让它们漂浮到表面，然后避免将它们转移到滑梯上。

使用微量移液器沿显微镜载玻片中心沿一条线分配带有封固剂的类器官。然后，小心地将盖玻片放在顶部，避免产生气泡。将载玻片放入载玻片簿中，并在冰箱中存放过夜，以便在共聚焦显微镜上分析之前使安装介质凝固。

这里显示的是来自分离的小肠组织第二部分的图像，该组织同时包含绒毛和隐窝，以及来自第三部分的样品，主要包含隐窝。从这些图像中可以看出，使用本视频中描述的甲醛甲醇固定和免疫标记方案，可以很好地保存和标记绒毛和隐窝中的微管和肌动蛋白。小肠类器官在基底基质中生成并生长 3 周或更长时间，然后如本视频所示进行分离。

类器官绒毛结构域内的分化细胞包含稳定的顶基底微管，在大多数情况下这些微管被很好地标记。EB1 也可以沿着微管晶格看到。这里显示的是处于囊肿阶段和隐窝发育早期阶段的类器官。

两个样品都固定在甲醛甲醇中，并对微管和 ninein 进行免疫标记，这表明在顶端非中心体微管组织中心具有良好的微管保存和标记。一旦掌握，这项技术可以在两天内对多个样品进行。在尝试此过程时，重要的是在收集类器官时小心刮擦孔，以避免破坏其 3D 结构。

此外，在添加或去除溶液时要小心，以防止在整个染色过程中类器官的损失。看完这个视频，你应该对如何固定、免疫标记和挂载分离的类器官和其他上皮结构（如肠隐窝）有很好的了解。不要忘记，在此过程中有效的固定剂可能非常危险。

应对此程序进行风险评估，并在执行此程序时始终采取适当的遏制措施和个人防护装备。