产后大鼠听觉脑干反应及外毛细胞全细胞贴片钳记录

这种电生理测定的总体目标是研究出生后发育过程中耳蜗毛细胞的形态和功能变化。这种方法可以帮助回答听觉助理部门领域中的关键问题，例如我们的毛细胞在听力开始时何时获得功能？该技术的主要优点是我们能够评估从出生后大鼠幼崽中分离的单个毛细胞的功能。

演示该程序的是我们实验室的学生 Wenlu Pan、Shasha Guo 和 Nana Xu。要开始此过程，请将麻醉的动物放入聚乙烯泡沫模具中以固定动物的身体。然后，将动物放在消音室的防振台上。

用加热垫将动物的体温保持在 37.5 摄氏度。接下来，用 70% 乙醇擦拭头部区域。在外耳廓腹侧做一个 1 到 2 毫米的切口，以放置参比电极或接地电极。

然后，将皮下记录电极放在颅骨顶点上。使用函数发生器，生成各种频率和强度的校准音调突发。通过距离动物头部 10 厘米的静电扬声器传递声音刺激。

为了获得听觉脑干反应，使用多功能处理器对声音引发的电位进行过滤、放大和平均。40 分钟的 ABR 记录在线监控并存储以供离线分析。在本节中，通过喷洒 70% 乙醇对动物的头部进行绝育。

接下来，用剪刀沿着矢状中线打开颅骨，取出大脑以露出内耳。然后，将内耳转移到一个 35 毫米的培养皿中，其中装满了 3 毫升冰镇的莱博维茨 L-15 培养基。在解剖显微镜下，用细镊子去除耳蜗的骨囊。

之后，解包从 modiolus 关联的 OC 和 SV。通过用镊子固定 SV 的基部，从基部到顶端缓慢解开，将 OC 与 SV 完全分离。随后，用细剪刀将 OC 均匀地切成三块。

所有步骤都应在冰冷的 L-15 中尽快进行，以尽量减少降解和组织恶化。在此步骤中，使用 200 微升移液器吸头，将 OC 的片段转移到载玻片上。用 100 微升 4% 多聚甲醛在 4 摄氏度下固定至少 4 小时。

之后，用 100 微升新鲜 PBS 置换多聚甲醛来清洗组织。然后，洗涤纸巾 3 次，每次 10 分钟。然后，将组织与 0.3% 渗透剂的 PBS 溶液在室温下孵育 30 分钟。

30 分钟后，丢弃渗透剂，用 PBS 洗涤组织 3 次。随后，用 10% 正常山羊血清和 PBS 在室温下封闭组织 1 小时。将组织与抗 prestin C 末端抗体和封闭溶液在室温下或 4 摄氏度下孵育 2 小时过夜。

然后，用 PBS 洗涤组织 3 次，每次 5 分钟。然后，将组织与 Alexa 488 偶联的二抗在封闭液中在室温下避光孵育 1 小时。用 PBS 洗涤组织 3 次，每次在黑暗中洗涤 5 分钟。

接下来，将组织与罗丹明鬼笔环肽在室温下避光孵育 10 分钟。用 PBS 在黑暗中洗涤组织 3 次，每次 5 分钟。然后，将样品安装在带有安装介质的载玻片上。

使用 405 纳米、488 纳米和 594 纳米激光的共聚焦显微镜对其进行成像。在此过程中，使用移液器拉拔器和 microforger。制作吸头直径为 2 至 3 微米的斑点移液器。

然后，用细胞内溶液回填移液器。使用 200 微升移液器吸头，将一块 OC 转移到 35 毫米培养皿中。在室温下用 100 μL 酶消化培养基消化组织 5 分钟。

接下来，用 100 微升 L-15 替换酶消化培养基。使用微手术刀将组织切成小块以分离毛细胞。轻轻移液后，将细胞转移到装有无酶浴溶液的自制小塑料室中。

然后，将腔室放在倒置显微镜的载物台上，找到看起来健康的孤立 OHC。随后，将补液管加载到 700B 放大器的头部载物台中。将贴片移液器放在外毛细胞的底部周围。

之后，通过密封细胞体的侧壁来全细胞膜片钳 OHC。轻轻抽吸直到细胞膜破裂。然后，将保持电位设置为 70 毫伏。

具有 10 至 17 兆欧的接触电阻和 100 至 500 兆欧姆的膜电阻的电池被认为是成功的全细胞配置。向电池施加超极化和去极化电压以引出全电池电流。使用由膜片钳软件控制的双正弦波电压刺激协议测量 OHC 的膜电容。

将激励电压范围设置为 140 至 110 毫伏，并存储数据以供离线分析。温和消化后，从 OC 中分离出 OHC。从大鼠耳蜗中急性分离的 OHC 进行全细胞电压钳记录。这里显示了从分离的 P9 OHC 记录的响应膜电位从 140 毫伏变为 107 毫伏的全电池电流的代表性示例。

该图显示了从两个不同年龄的 OHC 获得的非线性膜电容。电容电压响应拟合到玻尔兹曼函数。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。

在此程序之后，可以执行其他措施，如蛋白质印迹和 PCR，以回答其他问题，例如评估某些蛋白质的表达水平，例如毛细胞中的 prestin 表达水平。开发后，这项技术为毛细胞领域的研究人员探索耳蜗和前庭系统的电生理特性铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何研究出生后发育过程中耳蜗毛细胞的形态和功能变化有一个很好的了解。