Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats
2018年5月24日
This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.
这种电生理测定的总体目标是研究出生后发育过程中耳蜗毛细胞的形态和功能变化。这种方法可以帮助回答听觉助理部门领域中的关键问题，例如我们的毛细胞在听力开始时何时获得功能？该技术的主要优点是我们能够评估从出生后大鼠幼崽中分离的单个毛细胞的功能。
演示该程序的是我们实验室的学生 Wenlu Pan、Shasha Guo 和 Nana Xu。要开始此过程，请将麻醉的动物放入聚乙烯泡沫模具中以固定动物的身体。然后，将动物放在消音室的防振台上。
用加热垫将动物的体温保持在 37.5 摄氏度。接下来，用 70% 乙醇擦拭头部区域。在外耳廓腹侧做一个 1 到 2 毫米的切口，以放置参比电极或接地电极。
然后，将皮下记录电极放在颅骨顶点上。使用函数发生器，生成各种频率和强度的校准音调突发。通过距离动物头部 10 厘米的静电扬声器传递声音刺激。
为了获得听觉脑干反应，使用多功能处理器对声音引发的电位进行过滤、放大和平均。40 分钟的 ABR 记录在线监控并存储以供离线分析。在本节中，通过喷洒 70% 乙醇对动物的头部进行绝育。
接下来，用剪刀沿着矢状中线打开颅骨，取出大脑以露出内耳。然后，将内耳转移到一个 35 毫米的培养皿中，其中装满了 3 毫升冰镇的莱博维茨 L-15 培养基。在解剖显微镜下，用细镊子去除耳蜗的骨囊。
之后，解包从 modiolus 关联的 OC 和 SV。通过用镊子固定 SV 的基部，从基部到顶端缓慢解开，将 OC 与 SV 完全分离。随后，用细剪刀将 OC 均匀地切成三块。
所有步骤都应在冰冷的 L-15 中尽快进行，以尽量减少降解和组织恶化。在此步骤中，使用 200 微升移液器吸头，将 OC 的片段转移到载玻片上。用 100 微升 4% 多聚甲醛在 4 摄氏度下固定至少 4 小时。
之后，用 100 微升新鲜 PBS 置换多聚甲醛来清洗组织。然后，洗涤纸巾 3 次，每次 10 分钟。然后，将组织与 0.3% 渗透剂的 PBS 溶液在室温下孵育 30 分钟。
30 分钟后，丢弃渗透剂，用 PBS 洗涤组织 3 次。随后，用 10% 正常山羊血清和 PBS 在室温下封闭组织 1 小时。将组织与抗 prestin C 末端抗体和封闭溶液在室温下或 4 摄氏度下孵育 2 小时过夜。
然后，用 PBS 洗涤组织 3 次，每次 5 分钟。然后，将组织与 Alexa 488 偶联的二抗在封闭液中在室温下避光孵育 1 小时。用 PBS 洗涤组织 3 次，每次在黑暗中洗涤 5 分钟。
接下来，将组织与罗丹明鬼笔环肽在室温下避光孵育 10 分钟。用 PBS 在黑暗中洗涤组织 3 次，每次 5 分钟。然后，将样品安装在带有安装介质的载玻片上。
使用 405 纳米、488 纳米和 594 纳米激光的共聚焦显微镜对其进行成像。在此过程中，使用移液器拉拔器和 microforger。制作吸头直径为 2 至 3 微米的斑点移液器。
然后，用细胞内溶液回填移液器。使用 200 微升移液器吸头，将一块 OC 转移到 35 毫米培养皿中。在室温下用 100 μL 酶消化培养基消化组织 5 分钟。
接下来，用 100 微升 L-15 替换酶消化培养基。使用微手术刀将组织切成小块以分离毛细胞。轻轻移液后，将细胞转移到装有无酶浴溶液的自制小塑料室中。
然后，将腔室放在倒置显微镜的载物台上，找到看起来健康的孤立 OHC。随后，将补液管加载到 700B 放大器的头部载物台中。将贴片移液器放在外毛细胞的底部周围。
之后，通过密封细胞体的侧壁来全细胞膜片钳 OHC。轻轻抽吸直到细胞膜破裂。然后，将保持电位设置为 70 毫伏。
具有 10 至 17 兆欧的接触电阻和 100 至 500 兆欧姆的膜电阻的电池被认为是成功的全细胞配置。向电池施加超极化和去极化电压以引出全电池电流。使用由膜片钳软件控制的双正弦波电压刺激协议测量 OHC 的膜电容。
将激励电压范围设置为 140 至 110 毫伏，并存储数据以供离线分析。温和消化后，从 OC 中分离出 OHC。从大鼠耳蜗中急性分离的 OHC 进行全细胞电压钳记录。这里显示了从分离的 P9 OHC 记录的响应膜电位从 140 毫伏变为 107 毫伏的全电池电流的代表性示例。
该图显示了从两个不同年龄的 OHC 获得的非线性膜电容。电容电压响应拟合到玻尔兹曼函数。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。
在此程序之后，可以执行其他措施，如蛋白质印迹和 PCR，以回答其他问题，例如评估某些蛋白质的表达水平，例如毛细胞中的 prestin 表达水平。开发后，这项技术为毛细胞领域的研究人员探索耳蜗和前庭系统的电生理特性铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何研究出生后发育过程中耳蜗毛细胞的形态和功能变化有一个很好的了解。
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概述
本研究提供了一种详细的小鼠出生后幼鼠听觉脑干反应记录方案，用于探究外毛细胞功能发育过程。该方法包括对外毛细胞进行全细胞膜片钳记录，旨在解决听觉起始过程中耳蜗毛细胞功能相关的关键科学问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 发育生物学
背景
- 听觉脑干反应（ABR）可提供关于耳蜗功能的信息。
- 外毛细胞对耳蜗内声音的放大至关重要。
- 了解其功能发育对听觉研究具有重要意义。
研究目的
- 研究耳蜗毛细胞在出生后发育过程中的形态和功能变化。
- 了解毛细胞获得与听觉相关功能的时间节点。
- 在受控的实验条件下评估单个外毛细胞的功能特性。
使用的方法
- 在分离的耳蜗外毛细胞中进行全细胞膜片钳记录技术。
- 使用出生后的大鼠幼崽作为研究外毛细胞的生物学模型。
- 关键实验步骤包括仔细分离外毛细胞，以限制组织退化。
- 使用校准的短声脉冲和声音刺激进行听性脑干反应（ABR）记录。
- 记录数据被实时监测，并收集用于离线分析。
主要结果
- 该方法成功分离出耳蜗外毛细胞，从而实现了电生理学测量。
- 全细胞构型记录揭示了细胞膜电容的变化特征。
- 结果表明，耳蜗外毛细胞在不同出生后发育阶段具有显著的功能特性差异。
结论
- 本研究展示了一种评估耳蜗外毛细胞功能的可靠方法。
- 研究结果有助于深入理解听觉功能的发育时间进程。
- 所获得的见解可为未来关于听力障碍和耳蜗生物学的研究提供参考。
常见问题
行业重要性概述
该方案可实现对出生后发育过程中耳蜗外毛细胞的直接功能评估，为听觉系统的成熟机制提供深入见解。通过分离单个毛细胞并测量其电生理特性，该方法有助于听觉研究中的靶点验证，并降低耳蜗功能转化研究的风险。该技术对于理解与治疗发现相关的感官功能发育时间进程具有预测价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在关键发育窗口期探究毛细胞功能的获得过程。
- 操作价值：提供定量的电生理读数，以明确靶点激活的时间点。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：建立了一种可重复的系统，用于在分离制备样本中评估毛细胞的电生理特性。
- 操作价值：生成标准化的膜电容和电流测量数据，用于实验检测的基准比对。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过发育过程的特征分析，支持与疾病相关的听觉功能障碍建模。
- 操作价值：通过将prestin等分子标志物与功能输出关联，有助于揭示作用机制并降低研究风险。
流程与工作流整合
该方法通过在化合物筛选前对听觉靶点进行功能验证，整合到发现工作流程中，从而实现对毛细胞成熟通路的假设检验。
- 发现生物学：支持在出生后发育过程中验证毛细胞何时获得功能特性的假设。
- 筛选：提供定量的电生理输出，用于评估化合物对分离毛细胞的作用效果。
- 分析：实现跨发育阶段的膜电容和电压门控电流的比较。
- 转化研究：将发育电生理学与听力障碍的临床前模型相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于在多个项目中进行听觉靶点的验证。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接的功能性测量，降低听觉靶点验证中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化毛细胞分离与记录流程，实现可重复的毛细胞功能评估。
- 战略价值：通过明确听觉靶点的功能成熟时间线，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：支持对靶向听觉发育通路的化合物进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备电生理学和显微外科解剖技术方面的专业知识。
- 依赖于包括膜片钳放大器和隔音系统的专用仪器设备。
- 需要标准化的组织处理流程，以尽量减少分离过程中组织的降解。
- 需考虑不同出生后年龄阶段以及物种特异性耳蜗解剖结构的适应性调整。
- 受限于分离毛细胞在电生理记录中的急性存活性时间窗口。
