腹腔内葡萄糖耐量试验、肺功能测定及肺组织固定以研究肥胖与代谢障碍对肺部结局的影响

以下三种方法的总体目标是研究肥胖和代谢紊乱对肺结构和功能的影响。这些方法有助于回答呼吸系统研究领域中的关键问题，即代谢紊乱对肺结构和肺功能的影响。这些技术的优势在于可以联合使用，以评估代谢在慢性肺部疾病发病机制中的功能作用，并用于测试不同的治疗策略。

这些技术的意义不仅限于表型分析，更在于阐明代谢靶点在肺部疾病发病机制中的特定功能作用。这些方法还可用于研究经基因修饰的健康动物以及慢性阻塞性肺疾病（COPD）和哮喘动物模型的结构与功能。通常，初学者在应用这些方法时会遇到困难，因为气管插管、肺部充气以及深度麻醉的实施均需要经验与培训。

我们最初产生这些方法的想法，是在发现小鼠以及人类的早发性肥胖与代谢影响及婴幼儿期之后的慢性肺部疾病密切相关之时。为了测量腹腔内葡萄糖耐量，用手指轻轻抓住禁食12小时的成年小鼠尾部，并使用无菌剪刀剪去尾尖。立即将一滴自由流出的血液涂抹至血糖仪的测试试纸上，以测量禁食状态下的血糖水平。

四秒后，测试结果将显示在血糖仪屏幕上。每次测量每只动物的血糖后，使用彩色标记物对它们进行单独标记，并称量动物体重。然后，使用连接在1毫升注射器上的27号针头，按照每吨体重100微升的剂量，通过腹腔注射给予每只动物葡萄糖，并在注射后15、30、60和120分钟时，使用新的试纸条测量血糖水平，方法如前所述。

为评估肺功能，将成年小鼠仰卧置于垫子上，并在其眼睛上涂抹眼膏。确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，用70%乙醇润湿甲状腺区域的毛发，用镊子提起胸骨颈切迹与下颌骨突联合之间中线处的皮肤。使用钝头剪刀，在提起的皮肤上小心地做一厘米长的皮肤切口，以暴露皮下脂肪组织和甲状腺，并在峡部小心钝性分离两侧甲状腺叶，解剖胸骨甲状肌和胸骨舌骨肌，从而暴露气管。

使用锐利的镊子，将4-0编织外科缝线穿过气管与食管之间的间隙，用显微剪刀在靠近喉部的气管软骨环之间小心切开气管。插入气管插管，并用外科缝线固定插管，然后将动物转移至体腔内的加热垫上。将气管插管连接至面罩连接板，并开启呼吸机。

通过观察胸廓运动与呼吸频率是否同步，确认气管插管位置正确，并观察计算机屏幕上的压力信号。为控制通气过程中跨肺压力的变化，将食管管插入至肺部水平，同时观察屏幕，以便将导管放置在能够观察到最大压力偏转且心搏伪影最小的位置。根据仪器制造商的说明开始数据采集，并在雾化器上加入10 µL PBS。

在适应5分钟后开始雾化，随后进入3分钟的反应期，在此期间测量气道阻力和呼吸系统顺应性。每次雾化后让动物恢复3分钟，再开始下一次雾化，并按照软件说明在呼吸机上逐步递增应用10 µL浓度的乙酰甲胆碱。为进行肺组织的定量组织形态学分析，使用钝头剪刀在成年小鼠膈肌上做一个小切口，并使用弯头钝头剪刀沿整个肋笼长度做胸骨旁切口，轻柔地打开胸腔。

抬起肋骨以暴露胸膜腔，并移除胸腺。取出心脏后，使用锐利的镊子分离并暴露气管，将一根4-0编织缝合线从气管与食管之间穿过，随后在靠近喉部的气管软骨环之间小心切开气管。插入26号静脉套管进行插管，并利用固定剂以20厘米水柱的恒定压力进行加压灌注，使肺组织膨胀固定。

室温下放置30分钟后，结扎气管并同时移除套管。然后小心地切除肺组织，避免损伤，将肺组织置于新鲜固定剂中，在4°C下保存过夜。与标准饮食喂养的小鼠相比，肥胖小鼠在腹腔注射葡萄糖后15和30分钟表现出血清葡萄糖水平升高，表明其细胞对葡萄糖的摄取能力受损。

侵入性肺功能分析显示，与对照组动物相比，喂食高脂饮食的肥胖小鼠在乙酰甲胆碱刺激后气道阻力增加高达1.5倍。经气管灌注后对肺实质切片进行苏木精-伊红染色显示，灌注压力过低的肺组织中存在多个未膨胀区域、增厚的肺泡隔以及多边形肺泡。相反，灌注压力过高则导致肺泡隔破坏的过度膨胀区域。

然而，在肺组织固定过程中施加适当的压力，可使肺完全膨胀，肺泡呈圆形。一旦掌握操作技巧，腹腔葡萄糖耐量试验可在两个半小时内完成。肺功能检测可在一小时内完成，而肺膨胀灌注操作可在一小时之内完成。

在进行该操作时，需要注意的是，为获得最佳的数据采集效果，建议对小鼠进行适应性处理、对实验人员进行操作培训，并在安静且低应激的环境中开展工作。该技术建立后，为代谢和呼吸系统疾病领域的研究人员探索慢性肺部疾病的发病机制及利用小型动物模型研究潜在治疗策略开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何研究肥胖和代谢紊乱对肺结构与功能的影响。

请注意，接触动物或手术器械可能导致受伤或皮肤反应，因此在进行这些操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴适当 的个人防护装备。