Name: 建立高通量筛选平台评估乳腺癌 HER2 基因扩增的异质性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学习利用高通量银染原位杂交技术定量分析乳腺癌HER2基因扩增异质性。该方法适用于病理档案中的大量异质性处理样本，为临床决策和精准治疗研究提供可靠工具。

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本研究已获得意大利米兰IRCCS卡格兰达基金会综合医院机构审查委员会的批准。
1. 患者与组织标本的选择
<ol>
	<li>获取所有待分析病例的存档切片，包括原始诊断时所有的苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色切片和免疫组化（IHC）切片，若存在，还需获取一份配对的非肿瘤性乳腺组织的H&amp;#38;E切片（例如，手术切缘）。</li>
	<li>进行病例复核。 
	注意：此项工作应由至少两名具有乳腺病理学经验的病理学家共同讨论诊断切片，并以协作方式解决分歧。可使用传统显微镜或远程病理学工具（多中心研究中推荐使用后者）。如有分歧无法达成一致，应排除所有存在争议的病例。
	<ol>
		<li>根据最新版《世界卫生组织（WHO）乳腺肿瘤分类》对所有病例进行组织学重新分类18。</li>
		<li>确保每个病例的正常组织（如存档临床样本中存在）至少包含一个非肿瘤性的终末导管小叶单位。</li>
		<li>使用明场显微镜识别所有显示细胞学、结构或免疫组化特征异质性的肿瘤区域（由病理学家与将构建组织微阵列（TMA）的技术人员共同完成）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标记笔在玻璃切片上，或使用数字切片软件中的相应工具，标出明确的解剖位置区域（图1A）。</li>
	<li>根据所选切片，从档案中调取相应的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块。 
	注意：为优化TMA构建过程、避免组织耗尽并保持TMA打孔结构的完整性，应排除残余组织厚度&#60;1 mm的病例。</li>
</ol>
2. 基于Kononen技术设计和构建组织芯片
<ol>
	<li>创建并打开一个新的电子表格文件，纳入每个病例各个区域的记录。按照表1所示示例，在不同列中分别包含以下数据：病例编号（Case ID）、组织块编号（Block ID）、区域编号（Area ID）、组织类型（例如，正常组织、浸润性成分组织学类型、原位成分组织学类型）、解剖位置（例如，肿瘤中心、浸润前沿）、形态学特征（例如，核分级、组织结构、有丝分裂、细胞学特征）、生物标志物状态（即，雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、Ki67 和 HER2），以及所有其他可用的免疫组化（IHC）特征。
	<ol>
		<li>保存文档。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>创建一个组织芯片（TMA）项目。
	<ol>
		<li>安装并打开TMA设计软件。</li>
		<li>定义TMA受体组织块：通过菜单“文件 &#62; 新建 &#62; 组织块”或使用快捷键 CTRL+ B 进入。</li>
		<li>点击第一个字段进行填写或按 Tab 键，输入石蜡块的尺寸：宽度 35 (mm)，高度 20 (mm)。将 &#34;2&#34; 输入为 &#34;边距&#34; 值（即，距石蜡边缘的距离，单位为 mm）（图1B）。点击相应按钮保存数据。新的受体组织块模板现已保存，可用于新建组织芯片模板。</li>
		<li>创建组织芯片项目：进入菜单“文件 &#62; 新建 &#62; 组织芯片”或使用快捷键 CTRL+ T。</li>
		<li>填写组织芯片名称、备注和作者信息，然后点击 &#34;下一步"。点击 &#34;导入&#34; 图标，选择之前创建的受体组织块模板文件，然后点击 &#34;下一步&#34;。</li>
		<li>通过点击圆形按钮选择 1 mm 作为点阵大小。选择 500 µm 作为点间距，即相邻两点中心之间的距离。点击计算器图标以计算生成的总点数，应为 231。点击 &#34;下一步&#34;。</li>
		<li>通过单击定义点阵编号模式。点击 &#34;定义&#34; 按钮以创建网格和子网格。删除中间行（第6行）以及第8列和第15列。保留第1行的3个点用于定位。最终图谱应包含总共183个点，如 图2 所示。</li>
		<li>定义组织类型列表：通过菜单“文件 &#62; 新建 &#62; 组织类型列表”或使用快捷键 CTRL+ L 进入。</li>
		<li>插入先前定义的组织描述。按向下箭头键或点击 + 按钮以添加新行。</li>
		<li>定义项目：通过菜单“文件 &#62; 新建 &#62; Booster 项目”或使用快捷键 CTRL+ P 进入。</li>
		<li>填写组织芯片名称、备注和作者信息，然后点击 &#34;下一步"。通过点击相应图标导入电子表格文件、组织类型列表以及先前创建的组织芯片模型。</li>
		<li>点击 &#34;全选&#34;，并定义每种组织类型的点数；点击 &#34;匹配&#34; 按钮以应用设置。将出现一个表格，列出本项目中将被取样并转移至受体组织块的核心总数。保存项目并关闭程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备受体组织块（图1B）。
	<ol>
		<li>将65 °C的弹性石蜡注入清洁的金属模具中。</li>
		<li>让石蜡块在室温下于金属模具中静置过夜冷却。</li>
		<li>从金属模具中取出石蜡块。若出现裂纹，则丢弃该组织块，并重复步骤 2.3.1–2.3.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用全自动或半自动阵列仪构建组织芯片（TMA）19。
	<ol>
		<li>取出所有选定的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块及其对应的带注释的H&amp;#38;E切片。</li>
		<li>开启阵列仪，并将受体组织块插入阵列仪的转盘中。</li>
		<li>打开阵列仪控制站软件，点击 &#34;新建组织芯片&#34;，并加载先前创建的项目（图1C）。</li>
		<li>点击 &#34;继续&#34;，然后从菜单中选择供体组织块的位置。</li>
		<li>定义每个受体组织块上的起始位置：使用方向键移动激光光点，使其与受体（受体）组织块石蜡的左上角边缘对齐。</li>
		<li>点击 &#34;下一步&#34;，并重复进行垂直方向的对齐。</li>
		<li>点击 &#34;下一步&#34;，以在先前定义的受体（受体）组织块坐标处自动打孔。</li>
		<li>清空穿孔针。</li>
		<li>定位供体组织块以进行取样，并从先前标注的兴趣区域取出一个组织芯。</li>
		<li>将供体组织芯插入受体（受体）组织块的孔中。</li>
		<li>将供体组织块从阵列仪中移除。</li>
		<li>重复步骤 2.4.5–2.4.11，直至完成整个TMA构建。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将新制备的TMA组织块的组织面朝下放置于一张无菌空白载玻片上，放入实验室烘箱中，在45 °C下加热5分钟。</li>
	<li>轻轻按压组织块与载玻片接触5秒，以压平组织芯。重复一次（共2次）。</li>
	<li>将TMA组织块连同载玻片一起从烘箱中取出，翻转后轻轻将组织块从载玻片上剥离。</li>
	<li>在TMA组织表面覆盖一层65 °C的弹性石蜡。</li>
	<li>让TMA组织块在室温下静置2小时。</li>
	<li>将TMA组织块转移至4 °C环境中保存24小时。 
	注：TMA组织块可在4 °C条件下长期保存直至用尽。</li>
</ol>
3. 组织化学与免疫组织化学分析
<ol>
	<li>切片TMA组织。
	<ol>
		<li>将TMA受体组织块的石蜡面向下放置于-10 °C的表面上，冷却10分钟，使石蜡降温。</li>
		<li>将超纯水注入浮游浴槽，并将温度设置为 38 °C。</li>
		<li>将新刀片安装到旋转式切片机上，并将蜡块插入切片机的夹持器中，使蜡块朝向刀片并垂直对齐。</li>
		<li>小心地用刀片接近组织块，切下几片薄片以确认位置正确；如有必要，进行调整。</li>
		<li>切取3 µm厚的切片。</li>
		<li>用镊子夹起切片，使其漂浮于水浴表面。</li>
		<li>从水浴中取出常规及IHC/ISH玻璃载片上的组织切片。</li>
		<li>将载玻片置于染色架上，放入45 °C烘箱中过夜保存。 
		注意：组织芯片切片制备完成后，应在24小时内进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行组织化学染色（H&amp;#38;E) 使用自动染色机。
	<ol>
		<li>将切片插入自动染色机架中，并置于60 °C下10分钟。</li>
		<li>打开自动染色机的载物抽屉，将载有TMA切片的架子插入一个装载位的标准化H位置&amp;#38;E 夹子朝外。</li>
		<li>抽屉关闭后，系统将自动识别切片架并启动以下程序：37 °C 烘箱（6 分钟）、二甲苯（2 分钟）、二甲苯（2 分钟）、100% 乙醇（2 分钟）、100% 乙醇（2 分钟）、95% 乙醇（2 分钟）、95% 乙醇（2 分钟）、蒸馏水（4 分钟）、Carazzi's 苏木精染液（9 分钟）、低压流水冲洗（2 分钟）、1% 伊红染液（1 分钟）、低压流水冲洗（2 分钟）、95% 乙醇（20 秒）、95% 乙醇（20 秒）、95% 乙醇（20 秒）、95% 乙醇（20 秒）、100% 乙醇（15 秒）、100% 乙醇（15 秒）、二甲苯（30 秒）、二甲苯（30 秒）。</li>
		<li>从抽屉中取出载物架，将带有盖玻片的载玻片安装好。
		<ol>
			<li>用移液器吸取一滴封片剂，滴加到盖玻片的外边缘处。</li>
			<li>将盖玻片的湿润面朝下置于载玻片上，静置干燥30分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用全自动免疫组化染色仪对ER、PR、Ki67和HER2进行免疫组化染色。 
	注意：在开始染色运行之前，启动系统并检查耗材试剂瓶（材料表）和废液容器。
	<ol>
		<li>将待分析的TMA切片置于60 °C下10分钟。</li>
		<li>启动免疫染色仪仪器及软件。</li>
		<li>在主页界面，点击“实验方案”按钮，然后点击“创建/编辑实验方案”。</li>
		<li>选择标准DAB（3,3'-二氨基联苯胺）免疫组化程序以修改基础模板。</li>
		<li>旗标 &#34;脱蜡&#34; 在框列表中将培养温度设置为 72 °C。</li>
		<li>标记cc1去遮蔽液，设置中等温度为95 °C，孵育时间为36 min。</li>
		<li>勾选一抗复选框，插入 ER 原位分配器的编号（仪器软件将识别试剂转盘上的分配器），并将孵育时间设置为 16 分钟。</li>
		<li>勾选复染选项，选择苏木精I，孵育时间设为12分钟。</li>
		<li>点击 &#34;另存为&#34; 按钮并命名该实验方案。</li>
		<li>重复步骤 3.3.3–3.3.9，针对其余抗体使用以下一抗孵育时间：PR 16 分钟，Ki67 16 分钟，HER2 12 分钟。使用预稀释的即用型（RTU）抗体。</li>
		<li>在主页界面，点击“创建标签”按钮。</li>
		<li>点击“方案”按钮，为每张待分析的组织芯片添加ER、PR、Ki67和HER2检测方案。</li>
		<li>单击关闭/打印按钮。</li>
		<li>当标签模板出现时，输入标签的TMA编号。</li>
		<li>单击“打印”按钮以打印标签，然后将标签贴在TMA切片上。</li>
		<li>点击仪器图标，并将仪器启动模式设置为 &#34;准备就绪&#34;.</li>
		<li>打开覆盖试剂转盘的罩子，放入检测系统和一抗，然后合上罩子。</li>
		<li>点击切片抽屉的前部按钮以打开抽屉，放入TMA切片，然后点击同一按钮关闭抽屉。</li>
		<li>将仪器启动模式设置为 &#34;运行&#34; 并按照说明操作。</li>
		<li>运行结束后，按下仪器载玻片控制面板上的“打开所有已完成载玻片的抽屉”按钮，取出TMA切片，并将其浸入温热的肥皂水中冲洗，以去除残留的试剂。</li>
		<li>在低压冷水下冲洗切片，对TMA切片进行脱水，并为每张切片加盖玻璃盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据美国临床肿瘤学会（ASCO）/病理学学会（CAP）指南对ER、PR和HER2进行免疫组化分析，并依据国际乳腺癌Ki67工作组的建议对Ki67进行分析（表2）。 
	注意：此分析应由具有乳腺病理学经验的病理学家对离散的组织点分别进行。
	<ol>
		<li>若≥1%的肿瘤细胞核呈免疫反应阳性，则判定为雌激素受体表达阳性20,21,22,23.</li>
		<li>若≥1%的肿瘤细胞核呈免疫反应阳性，则判定PR表达为阳性20,21,22,23.</li>
		<li>评估HER2表达：a) 若出现完整且强的全周膜染色，则评分为3+；b) 若全周膜染色不完整和/或呈弱至中等强度，则评分为2+ &#62; 10% 的浸润性肿瘤细胞呈现完整且呈环周分布的强膜染色，或强膜染色仅见于 ≤ 10% 的浸润性肿瘤细胞；c) 若膜染色不完整且染色强度微弱/几乎不可见，并存在于 ≤ 10% 的浸润性肿瘤细胞中，则评分为 1+ &#62; 10% 的浸润性肿瘤细胞；d) 阴性：无染色，或膜染色不完整且微弱/几乎不可见，并局限于 ≤ 10% 的浸润性肿瘤细胞3,24.</li>
		<li>在10个高倍视野（放大倍数，400×）内随机选取至少1,000个肿瘤细胞，评估核染色阳性细胞所占百分比作为Ki67指数25.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. HER2 的 SISH 分析
<ol>
	<li>切取TMA切片（重复步骤3.1）。</li>
	<li>使用全自动免疫染色仪进行HER2的SISH检测。
	<ol>
		<li>将待分析的TMA切片置于60 °C下10分钟。</li>
		<li>启动免疫染色仪仪器及软件。</li>
		<li>在主页界面，点击“实验方案”按钮，然后点击“创建/编辑实验方案”。</li>
		<li>选择 &#34;U型双色原位杂交CKT&#34; 修改基本模板的步骤。</li>
		<li>旗标 &#34;干燥&#34; 在方框列表中将温度设置为63 °C，持续20分钟。</li>
		<li>旗标 &#34;细胞预处理&#34; 在方框列表中，然后 &#34;细胞培养条件 CC2&#34;，将温度设置为86 °C，孵育时间为4分钟。</li>
		<li>分别对循环1（温和）、循环2（标准）和循环3（延长）进行Flag CC2处理，时间分别为8分钟、12分钟和8分钟。</li>
		<li>旗标 &#34;ISH-Protease 3&#34; 在方框列表中设置孵育时间为 16 min。</li>
		<li>选择探针 HER2DNP 和 CHR17DIG，并将孵育时间设为 6 h。</li>
		<li>在76 °C条件下洗涤8分钟。</li>
		<li>将SISH多聚体（SIL ISH DNP HRP）孵育时间设定为32分钟。</li>
		<li>将银显色剂（SIL ISH DNP CHRC）孵育时间设定为4分钟。</li>
		<li>将红色多聚体（RED ISH DIG AP）的孵育时间设置为24分钟。</li>
		<li>将红色显色剂（RED ISH DIG FR）的孵育时间设置为8分钟。</li>
		<li>旗标 &#34;复染&#34; 在方框列表中，选择 &#34;苏木精 II&#34;，孵育时间设置为8分钟。</li>
		<li>旗标 &#34;复染后&#34; 在方框列表中，选择 &#34;蓝染试剂&#34;，孵育时间设置为4分钟。</li>
		<li>重复步骤 3.3.11–3.3.15（选择改良的 U 型双色原位杂交 CKT 方案）。</li>
		<li>打开覆盖试剂转盘的罩子，放入洗涤液和原位杂交检测系统，然后关闭罩子。</li>
		<li>重复执行步骤 3.3.18 至 3.3.21。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行SISH分析 HER2评估 HER2 基因扩增呈阳性如果该 HER2/CEP17 比值 ≥2.0，平均值 HER2 拷贝数≥4.0 个信号/细胞为阳性，若低于该值则为阴性 HER2/CEP17 比值是 &#60;2.0，平均 HER2 拷贝数 &#60;4.0 信号/细胞3,24. 
	注意：与免疫组化（IHC）类似，此分析应由具有乳腺病理学经验的病理学家对离散的组织点分别进行。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

本文详细介绍了在异质性处理的乳腺癌高产出组织微阵列（TMA）中进行HER2基因及其相应着丝粒SISH分析的实验室策略。该方法成本效益高，可在大多数实验室中实施，适用于从病理档案中获取的大样本乳腺癌队列中HER2基因扩增异质性的研究。
由于HER2检测在乳腺癌临床诊疗中的重要性及其异质性表达带来的挑战，我们开发了一种高通量检测方案，用于评估肿瘤内和肿瘤间HER2基因异质性。所分析的区域包括基于特定细胞学、组织结构和免疫组化特征的癌前病变及浸润性病变成分。
在本方案中，有几个关键阶段需要谨慎管理。其中一个关键步骤是感兴趣区域的选择。我们发现，通过多学科方法对不同地形区域进行注释，对于确保最终分子分析的质量至关重要。特别是，由病理学家和技术人员共同复查诊断切片，可极大增加合格位点的数量即，这些点反映了载玻片上识别的区域），从而降低单个点分析的失败率。然而，在进行连续切片以完成多重免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）分析后，部分肿瘤组织点可能丢失。为克服这一问题...

HER2 是一种原癌基因，在所有浸润性乳腺癌中约有 15 - 30% 存在该基因的过表达和扩增1,2。HER2 过表达通过免疫组织化学（IHC）检测显示强膜阳性染色（3+）的细胞比例超过 &#62;10% 来推断；而基因扩增则需通过原位杂交（in situ hybridization, ISH）计数至少 20 个细胞进行评估，当 HER2/着丝粒比值 ≥2 或基因拷贝数 ≥6 时可判定为扩增3。
肿瘤内遗传异质性在乳腺癌中已有广泛描述，可能对生物标志物评估和治疗反应产生不利影响4。根据美国病理学家学院（CAP）的定义，当HER2在超过&#62;5%且少于&#60;50%的浸润性肿瘤细胞中发生扩增时，即存在HER2异质性5。遗憾的是，乳腺癌中HER2空间异质性的实际发生率在病理学家之间仍存在争议，一些研究者认为这是一种极为罕见的现象，而另一些研究则提示高达40%的病例存在HER2异质性1,5,6,7,8,9,10。尽管该现象背后的生物学机制尚未完全阐明，但肿瘤内HER2异质性对乳腺癌患者的预后和临床意义至关重要11。
近年来，明场分子技术（如显色原位杂交（CISH）和银增强原位杂交（SISH））已成为检测福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中HER2异质性的可靠方法，在某些方面相较于荧光原位杂交（FISH）具有优势12。遗憾的是，对单个病例进行整体分析在大样本队列研究中仍不切实际。多个研究团队提出，将组织化学、免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）与组织芯片（TMA）技术相结合，可能是在癌症生物学研究中一种有价值的策略13,14,15,16。通过这一广泛应用的方法，可同时分析来自不同患者的组织样本，最大限度地减少组织和试剂的使用，从而促进对大量病例进行一致性分析14。然而，目前尚无可用的方案用于对经过不同处理（如试剂种类、固定时间及保存方法，包括存档蜡块）的多个组织样本进行同步高通量分子表征。
鉴于HER2在乳腺癌中的空间异质性具有重要的预后和临床意义，我们开发了一种整合的分子检测平台，用于在大量经过不同处理的病例中评估这种异质性。本文展示了利用SISH技术在高通量乳腺癌组织微阵列（TMA）中生成并分析HER2基因扩增瘤内异质性的实验室策略。本方案适用于肿瘤大小&#62;5 mm（根据TNM 2017分期标准为&#62;pT1b）的病例17。对于较小的病灶，建议在完整切面的连续切片上进行分析。本方法可同时对多达30例乳腺癌样本进行免疫组化（IHC）和SISH分析，每例样本平均包含6个不同的取样区域（范围为4–8个）。每个TMA切块将总共生成180个直径为1 mm的组织芯，组织芯之间的间距为500 µm，阵列网格与切块边缘之间的距离为2 mm。

<table><tbody><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>德国韦茨拉尔，Leica Biosystems，欧盟</td><td>39601006</td><td>组织包埋介质，56 &amp;deg;C 熔点</td></tr><tr><td>伊红Y&amp;nbsp; 1% 水溶液</td><td>Bio Optica，意大利米兰，欧盟</td><td>510002</td><td>伊红黄，水溶性</td></tr><tr><td>Carazzi&amp;rsquo;苏木精染色</td><td>Bio Optica，意大利米兰，欧盟</td><td>506012</td><td>使用碘酸钾成熟的明矾苏木精</td></tr><tr><td>钻石品质</td><td>Laboindustria，意大利阿尔泽尔格兰德，欧盟</td><td>33533</td><td>26x76 mm 显微镜载玻片</td></tr><tr><td>Leica CV包埋机</td><td>德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟</td><td>14046430011</td><td>一种不含单体的封片介质，基于丁基甲基丙烯酸酯聚合物溶于二甲苯</td></tr><tr><td>FLEX IHC 显微镜载玻片</td><td>安捷伦科技（Dako），&amp;nbsp; 美国加利福尼亚州圣克拉拉</td><td>K8020</td><td>用于免疫组化中福尔马林固定石蜡包埋组织黏附的包被载玻片</td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>N750-BMKU-FS</td><td>染色片系统</td></tr><tr><td>CONFIRM 抗雌激素受体（ER）（SP1）兔单克隆一抗</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>790-4324</td><td>一抗，即用型</td></tr><tr><td>CONFIRM 抗孕激素受体（PR）（1E2）兔单克隆一抗</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>790-2223</td><td>一抗，即用型</td></tr><tr><td>CONFIRM 抗 Ki-67 (30-9) 兔单克隆一抗</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>790-4286</td><td>一抗，即用型</td></tr><tr><td>PATHWAY HER2 (4B5) 兔单克隆一抗</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>790-4493</td><td>一抗，即用型</td></tr><tr><td>ultraView Universal DAB 检测试剂盒</td><td>Ventana医疗系统公司，图森，亚利桑那州，美国</td><td>760-500</td><td>用于检测小鼠 IgG、小鼠 IgM 和兔一抗的间接、无生物素系统</td></tr><tr><td>INFORM HER2 双重 ISH DNA 探针混合液</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>780-4422</td><td>INFORM HER2 双重 ISH 检测——一种双色原位杂交的 FDA 批准自动化检测方法，用于确定乳腺癌患者的 HER2 基因状态&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ultraView Silver ISH DNP 检测试剂盒</td><td>Ventana医疗系统公司，图森，亚利桑那州，美国</td><td>800-098</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Red ISH DIG 检测试剂盒</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>800-505</td><td></td></tr><tr><td>ISH蛋白酶3</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>780-4149</td><td>在原位杂交（ISH）过程中用于去除目标DNA序列周围蛋白质的试剂</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>760-2021</td><td>改良吉尔苏木精复染试剂</td></tr><tr><td>苏木精 II 复染</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>790-2208</td><td>改良梅耶苏木精复染试剂</td></tr><tr><td>显色试剂</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>760-2037</td><td>用于玻璃载片上苏木精染色切片返蓝的缓冲碳酸锂水溶液</td></tr><tr><td>HybReady</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>780-4409</td><td>原位杂交实验用甲酰胺缓冲液</td></tr><tr><td>EZ Prep (10x)</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>950-102</td><td>用于免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）反应中去除组织样本石蜡的浓缩溶液，并按1:10比例稀释使用。</td></tr><tr><td>SSC缓冲液（10X）</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>950-110</td><td>氯化钠-柠檬酸钠缓冲液用于杂交后的严格性洗涤、染色步骤间的玻片冲洗，并为原位杂交反应提供稳定的水相环境。使用时按1:5稀释。</td></tr><tr><td>ULTRA LCS</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>650-210</td><td>预稀释（即用型）盖玻片溶液，用于免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）反应中水相试剂与空气之间形成屏障，防止蒸发</td></tr><tr><td>10倍反应缓冲液</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>950-300</td><td>Tris 缓冲液（pH 7.6） &amp;plusmn; 0.2）用于免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）染色步骤之间冲洗载玻片。按1:10稀释。</td></tr><tr><td>ULTRA 细胞培养条件优化（ULTRA CC2）</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>950-223</td><td>免疫组织化学和原位杂交中组织样本处理的预处理步骤。即用型。</td></tr><tr><td>ULTRA 细胞培养条件优化（ULTRA CC1）</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>950-224</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Silver Wash II</td><td>Ventana医疗系统公司，美国亚利桑那州图森市</td><td>780-003</td><td>即用型溶液，用于免疫组化与原位杂交染色步骤之间的玻片冲洗</td></tr><tr><td>切片机</td><td>德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟</td><td>RM 2255</td><td>自动旋转切片机</td></tr><tr><td>多染色仪</td><td>德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟</td><td>ST 5020</td><td>自动染色与封片工作站</td></tr><tr><td>微核心 1</td><td>Alphelys，法国普莱西，欧盟</td><td>00-MICO-1</td><td>带有嵌入式 TMA Designer 2 软件的半自动组织芯片阵列仪</td></tr><tr><td>Aperio ScanScope CS2</td><td>德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司，欧盟</td><td>K080254</td><td>图像采集设备 - 数字病理扫描仪</td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-Cassette</td><td>Sakura Finetek Europe B.V</td><td>4135</td><td>盒式结构</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Paraform 标准包埋模具</td><td>Sakura Finetek Europe B.V</td><td>7055</td><td>不锈钢基底金属模具</td></tr></tbody></table>

构建高通量筛选平台以评估乳腺癌中her2基因扩增的异质性

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

针对人表皮生长因子受体2（HER2）的靶向治疗已显著改善HER2阳性乳腺癌患者的预后。然而，少数病例中HER2阳性细胞呈异质性分布，这给临床诊疗带来重大挑战。迄今为止，尚无可靠且标准化的方案用于此类情况的表征与定量分析。 HER2 大规模队列中异质性基因扩增的研究已被提出。本文中，我们介绍一种高通量方法，可同时评估多个乳腺癌不同空间区域的HER2状态。具体而言，我们阐述了构建增强型组织微阵列（TMAs）的实验室操作流程，该流程整合了对肿瘤的靶向定位 mapping。所有TMA参数均针对银染 原位 福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）乳腺组织的杂交（SISH）。预后和预测性生物标志物的免疫组织化学分析（即，ER、PR、Ki67 和 HER2）应采用自动化程序进行检测。本研究已建立一种定制化的SISH方案，可在经历不同固定、处理和储存流程的多种组织上实现高质量的分子分析。本研究提供了原理性证据，表明可通过一种高效且经济的方法，在经不同方式处理的多种乳腺癌样本的不同解剖区域中，同时定位特定的DNA序列。

总体而言，共有444例浸润性乳腺癌被纳入15个专门优化用于原位杂交（ISH）分析的组织微阵列（TMA）中。在采集的2,664个点中，2,651个（99.5%）代表了先前选定的区域，因此被认为适用于后续分析。通过免疫组织化学（IHC）和原位杂交（SIH）评估肿瘤内异质性，特别关注HER2阳性克隆在肿瘤不同拓扑区域中的异质性分布。 表3 展示了所分析病例的生物学特征，重点关注不同组织学类型中ER、PR、Ki67和HER2的表达状态。特别是，18%的病例被发现存在HER2阳性细胞 &gt;10%的肿瘤细胞，因此符合HER2阳性评估的特征。有趣的是，该数值接近于文献报道的HER2阳性乳腺癌发病率范围的下限。另一方面，HER2状态在HER2阳性和HER2阴性乳腺癌的不同区域中均表现出异质性。图3, 表4)，进一步支持了乳腺癌在基因组水平上是一种高度异质性疾病的观念。SISH分析的失败率为0.8%，共有2,629/2,651个位点显示二硝基苯酚标记的探针与靶...

在部分乳腺癌中可观察到HER2阳性细胞的异质性分布，这会带来临床诊疗上的难题。本文介绍了一种可靠且经济高效的方案，用于在大量经过异质性处理的乳腺癌样本中定义、量化并比较HER2肿瘤内的遗传异质性。

构建高通量筛选平台以评估乳腺癌中HER2基因扩增的异质性

针对人表皮生长因子受体2（HER2）的靶向治疗已彻底改变了HER2阳性乳腺癌患者的治疗预后……

本实验流程的总体目标是通过高通量银染原位杂交技术，对一系列经不同方式处理的乳腺癌样本进行大规模分析，同时界定、定量并比较其中的HER2肿瘤内遗传异质性。该方法有助于解决乳腺癌转化研究与科研中的关键问题，例如对来自病理档案的大样本量病例进行HER2基因扩增异质性的研究。该技术的主要优势在于，能够在多个经不同方式处理的乳腺癌样本的不同空间区域中，实现高通量的HER2分裂分析。通常，初次接触原位杂交技术的研究人员会面临困难，因为回顾性研究通常需要分析经过不同固定、处理和储存流程的存档样本。我们最初产生这一方法的想法，是在决定重新分类自2003年以来本机构数据库中所有乳腺癌病例时。本次实验操作将由本实验室的技术员 Giulia Ercoli 进行演示。按照文本方案中所述，首先选择患者和组织标本。创建并打开一个新的电子表格文件，录入每个病例不同区域的记录。表格中应包含独立的列，用于记录病例编号、组织块编号、区域编号、组织类型、解剖位置、形态学特征、生物标志物状态以及所有可获得的免疫组织化学特征。创建一个TMA项目。通过导航至文件、新建、蜡块来定义PMA受体蜡块。点击第一个字段进行填写，并输入石蜡块的尺寸。接下来，通过点击文件、新建、组织芯片，创建一个组织芯片项目。点击导入图标，然后选择之前创建的受体组织块模板文件。点击下一步。然后通过点击圆形按钮选择一毫米作为光斑尺寸。选择500微米作为光斑间距，即相邻两个光斑中心之间的距离。然后点击计算器图标，计算生成的光斑总数，结果应为231。然后单击“define”按钮以创建网格和子网格。删除第8列和第15列以及中心线。保留第一行的三个点用于定位。最终的图谱应包含总共 183 个点位。通过依次点击文件、新建、组织类型列表，来定义组织类型列表。然后通过依次点击文件、新建、增强项目，来定义项目。接下来制备受体块。将65摄氏度的弹性石蜡注入已清洁的金属模具中。将石蜡块连同金属模具在膜温条件下静置过夜，使其冷却。第二天，从金属模具中取出石蜡包埋块。使用全自动或半自动组织芯片仪构建组织微阵列（TMA），首先打开芯片仪，然后将受体石蜡块放置在芯片仪的载样转盘上。通过方向键移动激光光点，将其与受体石蜡块左上边缘对齐，以此确定每个受体块的起始位置。单击下一步，对垂直对齐重复相同操作。再次单击下一步，将在先前定义的受体块坐标处自动生成一个孔。清空打孔器。将供体组织块定位至取样位置，从先前标注的兴趣区域取出一个组织芯。将供体组织芯插入受体组织块的孔中。然后从阵列仪上移除供体组织块。重复上述步骤直至完成组织芯片。将新制备的组织芯片蜡块的组织面朝下置于无菌空白载玻片上，放入实验室烘箱中，在 45 摄氏度下孵育五分钟。轻轻按压蜡块与载玻片接触五秒钟，以展平组织芯。重复一次，共计两次。随后在65摄氏度下，用一层薄的弹性石蜡覆盖TMA组织表面。将TMA组织块在室温下放置两小时。最后，在进行组织化学和免疫组织化学分析前，将TMA包埋块置于4摄氏度环境中24小时，具体操作详见文本方案。将待分析的TMA切片置于60摄氏度下10分钟。随后启动免疫染色仪及其配套软件。在主页界面，点击“实验方案”按钮，然后点击“创建/编辑实验方案”。选择双重原位杂交鸡尾酒法程序以修改基本模板。在列表中勾选烘烤步骤，并将温度设置为63摄氏度，持续20分钟。然后勾选脱蜡步骤。接下来在选项框列表中勾选细胞预处理。然后勾选细胞预处理CC2，并将温度设置为86摄氏度，孵育时间为4分钟。对轻度CC2进行8分钟标记，标准处理12分钟，延长处理8分钟。在方框列表中选择ISH-Protease 3，并将孵育时间设为16分钟。选择探针HER2二硝基苯基和染色体17地高辛。孵育16分钟，然后在80°C条件下变性20分钟。探针孵育时间设为6小时。随后将SISH多聚体孵育时间设为32分钟。将铬酸银的孵育时间设定为4分钟。接着将红色多聚体的孵育时间设定为24分钟。将红色铬酸盐的孵育时间设定为8分钟。然后在方框列表中勾选复染标志，选择苏木精二染液，并将孵育时间设为8分钟。在方框列表中勾选染后复染标志，选择蓝化试剂，并将孵育时间设为4分钟。最后，进行HER2的裂解分析。若HER2染色体着丝粒探针17（CEP17）比值大于或等于2.0，且每个细胞的平均HER2拷贝数大于或等于4.0个信号，则判定为HER2基因扩增阳性；若HER2/CEP17比值小于2.0，且每个细胞的平均HER2拷贝数小于4.0个信号，则判定为阴性。此处展示的是HER2异质性乳腺癌银原位杂交分析的代表性显微图像。在此典型示例中，两种不同区域的高级别浸润性乳腺癌（非特殊类型）在HER2基因扩增方面表现出不同的结果，其中HER2基因扩增以黑点显示，而17号染色体着丝粒计数探针则以红点显示。具体而言，属于肿瘤核心区域且呈现细胞角蛋白7不规则染色模式的区域存在HER2扩增，而位于浸润前沿的一个单独病灶则显示为野生型HER2模式。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对包含多个且经异质性处理的乳腺癌组织标记阵列进行可读的组织分析。一旦掌握，该技术可在病例筛选后的两个工作日内完成。尽管该方法针对乳腺癌进行了优化，但也可推广至其他HER2异质性具有重要临床意义的癌症类型，例如胃癌。该技术的应用前景在于对HER2状态进行简便评估，因其设计初衷即是对大样本系列乳腺癌中的多个空间区域进行全方位的图谱绘制。进行此操作时，重要的是避免TMA切片块出现任何裂纹。即使石蜡中存在微小裂纹，也会影响原位杂交的质量、可重复性及整体清晰度。完成此操作后，可进一步进行基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI质谱成像），以探讨乳腺癌蛋白质组学中的其他问题，特别是在肿瘤内和肿瘤间异质性方面。请注意，使用TMA打孔针和高温石蜡时可能存在危险，因此在进行该操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴一次性丁腈手套。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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