构建高通量筛选平台以评估乳腺癌中HER2基因扩增的异质性

本实验流程的总体目标是通过高通量银染原位杂交技术，对一系列经不同方式处理的乳腺癌样本进行大规模分析，同时界定、定量并比较其中的HER2肿瘤内遗传异质性。该方法有助于解决乳腺癌转化研究与科研中的关键问题，例如对来自病理档案的大样本量病例进行HER2基因扩增异质性的研究。该技术的主要优势在于，能够在多个经不同方式处理的乳腺癌样本的不同空间区域中，实现高通量的HER2分裂分析。

通常，初次接触原位杂交技术的研究人员会面临困难，因为回顾性研究通常需要分析经过不同固定、处理和储存流程的存档样本。我们最初产生这一方法的想法，是在决定重新分类自2003年以来本机构数据库中所有乳腺癌病例时。本次实验操作将由本实验室的技术员 Giulia Ercoli 进行演示。

按照文本方案中所述，首先选择患者和组织标本。创建并打开一个新的电子表格文件，录入每个病例不同区域的记录。表格中应包含独立的列，用于记录病例编号、组织块编号、区域编号、组织类型、解剖位置、形态学特征、生物标志物状态以及所有可获得的免疫组织化学特征。

创建一个TMA项目。通过导航至文件、新建、蜡块来定义PMA受体蜡块。点击第一个字段进行填写，并输入石蜡块的尺寸。

接下来，通过点击文件、新建、组织芯片，创建一个组织芯片项目。点击导入图标，然后选择之前创建的受体组织块模板文件。点击下一步。

然后通过点击圆形按钮选择一毫米作为光斑尺寸。选择500微米作为光斑间距，即相邻两个光斑中心之间的距离。然后点击计算器图标，计算生成的光斑总数，结果应为231。

然后单击“define”按钮以创建网格和子网格。删除第8列和第15列以及中心线。保留第一行的三个点用于定位。

最终的图谱应包含总共 183 个点位。通过依次点击文件、新建、组织类型列表，来定义组织类型列表。然后通过依次点击文件、新建、增强项目，来定义项目。

接下来制备受体块。将65摄氏度的弹性石蜡注入已清洁的金属模具中。将石蜡块连同金属模具在膜温条件下静置过夜，使其冷却。

第二天，从金属模具中取出石蜡包埋块。使用全自动或半自动组织芯片仪构建组织微阵列（TMA），首先打开芯片仪，然后将受体石蜡块放置在芯片仪的载样转盘上。通过方向键移动激光光点，将其与受体石蜡块左上边缘对齐，以此确定每个受体块的起始位置。

单击下一步，对垂直对齐重复相同操作。再次单击下一步，将在先前定义的受体块坐标处自动生成一个孔。清空打孔器。

将供体组织块定位至取样位置，从先前标注的兴趣区域取出一个组织芯。将供体组织芯插入受体组织块的孔中。然后从阵列仪上移除供体组织块。

重复上述步骤直至完成组织芯片。将新制备的组织芯片蜡块的组织面朝下置于无菌空白载玻片上，放入实验室烘箱中，在 45 摄氏度下孵育五分钟。轻轻按压蜡块与载玻片接触五秒钟，以展平组织芯。

重复一次，共计两次。随后在65摄氏度下，用一层薄的弹性石蜡覆盖TMA组织表面。将TMA组织块在室温下放置两小时。

最后，在进行组织化学和免疫组织化学分析前，将TMA包埋块置于4摄氏度环境中24小时，具体操作详见文本方案。将待分析的TMA切片置于60摄氏度下10分钟。随后启动免疫染色仪及其配套软件。

在主页界面，点击“实验方案”按钮，然后点击“创建/编辑实验方案”。选择双重原位杂交鸡尾酒法程序以修改基本模板。在列表中勾选烘烤步骤，并将温度设置为63摄氏度，持续20分钟。

然后勾选脱蜡步骤。接下来在选项框列表中勾选细胞预处理。然后勾选细胞预处理CC2，并将温度设置为86摄氏度，孵育时间为4分钟。

对轻度CC2进行8分钟标记，标准处理12分钟，延长处理8分钟。在方框列表中选择ISH-Protease 3，并将孵育时间设为16分钟。选择探针HER2二硝基苯基和染色体17地高辛。

孵育16分钟，然后在80°C条件下变性20分钟。探针孵育时间设为6小时。随后将SISH多聚体孵育时间设为32分钟。

将铬酸银的孵育时间设定为4分钟。接着将红色多聚体的孵育时间设定为24分钟。将红色铬酸盐的孵育时间设定为8分钟。

然后在方框列表中勾选复染标志，选择苏木精二染液，并将孵育时间设为8分钟。在方框列表中勾选染后复染标志，选择蓝化试剂，并将孵育时间设为4分钟。最后，进行HER2的裂解分析。

若HER2染色体着丝粒探针17（CEP17）比值大于或等于2.0，且每个细胞的平均HER2拷贝数大于或等于4.0个信号，则判定为HER2基因扩增阳性；若HER2/CEP17比值小于2.0，且每个细胞的平均HER2拷贝数小于4.0个信号，则判定为阴性。此处展示的是HER2异质性乳腺癌银原位杂交分析的代表性显微图像。

在此典型示例中，两种不同区域的高级别浸润性乳腺癌（非特殊类型）在HER2基因扩增方面表现出不同的结果，其中HER2基因扩增以黑点显示，而17号染色体着丝粒计数探针则以红点显示。具体而言，属于肿瘤核心区域且呈现细胞角蛋白7不规则染色模式的区域存在HER2扩增，而位于浸润前沿的一个单独病灶则显示为野生型HER2模式。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对包含多个且经异质性处理的乳腺癌组织标记阵列进行可读的组织分析。

一旦掌握，该技术可在病例筛选后的两个工作日内完成。尽管该方法针对乳腺癌进行了优化，但也可推广至其他HER2异质性具有重要临床意义的癌症类型，例如胃癌。该技术的应用前景在于对HER2状态进行简便评估，因其设计初衷即是对大样本系列乳腺癌中的多个空间区域进行全方位的图谱绘制。

进行此操作时，重要的是避免TMA切片块出现任何裂纹。即使石蜡中存在微小裂纹，也会影响原位杂交的质量、可重复性及整体清晰度。完成此操作后，可进一步进行基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI质谱成像），以探讨乳腺癌蛋白质组学中的其他问题，特别是在肿瘤内和肿瘤间异质性方面。

请注意，使用TMA打孔针和高温石蜡时可能存在危险，因此在进行该操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴一次性丁腈手套。