昆虫细胞 (sf9) 外源基因在蛋白质功能检测中的瞬态表达
February 22nd, 2018
本协议描述了一种热休克诱导蛋白表达系统 (pDHsp/V5-His/sf9 细胞系统), 可用于表达外来蛋白或评价潜在外来蛋白的抗凋亡活性及其截断的氨基酸昆虫细胞中的酸。
这种热休克诱导的蛋白质表达系统的总体目标是评估昆虫细胞中两种潜在功能拮抗蛋白的蛋白质抗凋亡活性。该方法可以帮助回答有关生物技术和蛋白质组学中候选蛋白的功能和活性的关键问题，例如它们的抗凋亡活性和蛋白质相互作用。该技术的主要优点是基因表达的时间由热休克诱导控制。
因此，这种方法可以提供对蛋白质功能状态的见解。它也可以应用于其他系统，例如哺乳动物蛋白表达。本方案中使用的草地贪夜蛾或 Sf9 昆虫细胞在 25 平方厘米细胞培养瓶中的细胞培养基中于 28 摄氏度生长。
摇动细胞培养瓶，将细胞从培养瓶中分离出来。然后在光学显微镜下检查，确保大约 80% 的细胞分离。将 50% 的细胞悬液转移到新的 25 平方厘米细胞培养瓶中，让细胞在室温下贴壁 15 分钟。
15 分钟后，用 5 mL 新鲜培养基替换培养基，并在 28 摄氏度的培养箱中生长。根据细胞生长情况，每 2 到 3 天传代一次细胞。在收获 Sf9 细胞之前，重要的是在光学显微镜下检查细胞，以确保没有细菌或其他微生物的污染。
要收获 Sf9 细胞，请摇动培养瓶以分离细胞，然后将细胞悬液转移到 15 mL 试管中。使用 P10 移液器，将 10 微升细胞悬液转移到血细胞计数器中，并在光学显微镜下计数细胞数量。将 3 次乘以 10 至 5 个细胞的体积接种到 24 孔板的每个孔中，并在室温下放置 15 分钟。
15 分钟后，用 0.5 mL 铺板培养基更换培养基。准备细胞转染摄政王。对于每次转染，用 100 μL 无血清细胞培养基稀释 8 μL 细胞转染试剂，涡旋 1 秒以混合。
在本研究中，杆状病毒基因、凋亡抑制剂 3 或 IAP3 的三种不同截断将在果蝇热休克 70 启动子、全长 IAP3、缺乏 RING 结构域的截短和缺乏 BIR 结构域的截短的控制下表达。将每种质粒 DNA 加入 100 μL 无血清细胞培养基中，涡旋混合 1 秒钟。也准备一个阳性对照。
将稀释的质粒 DNA 和稀释的细胞转染试剂混合，涡旋混合。在室温下孵育 30 分钟。使用 P1000 移液器，将 210 μL 的每种 DNA 转染试剂混合物滴加到细胞上。
在 28 摄氏度下孵育 5 小时。5 小时后，用 0.5 mL 细胞培养基更换铺板培养基，然后用胶带密封 24 孔板。在 28 度下孵育。
第二天，通过将板漂浮在 42 摄氏度的水浴中 30 分钟，进行热休克以诱导蛋白质表达。30 分钟后，将 24 孔板放回 28 摄氏度培养箱中。随后通过文本方案中所述的 Western blot 确认蛋白质表达。
为了检查基因诱导的细胞凋亡，首先如前所述制备 Sf9 细胞。接下来，以与以前相同的方式转染细胞，但在每个转染反应中加入 1 微克含有凋亡诱导基因的质粒。在 28 摄氏度下孵育 5 小时，更换培养基，然后孵育 16 小时。
在 42 摄氏度下对转染的细胞进行热休克 30 分钟。在进行细胞活力测定之前，将细胞在 28 摄氏度下孵育 5 小时。对于化学诱导的细胞凋亡，将 6 个 Sf9 细胞接种 10 次，放入 6 孔板的每个孔中。
在室温下放置 15 分钟，然后用 1 毫升电镀介质更换培养基。用 4 μg 的每种质粒 DNA 转染细胞。5 小时后，用 1 毫升细胞培养基替换铺板培养基，并在 28 摄氏度下孵育细胞 16 小时。
然后在 42 摄氏度下热休克 30 分钟。热休克后，将细胞在 28 摄氏度下孵育 5 小时。然后用放线菌素 D 处理转染的细胞以诱导细胞凋亡。
在28 摄氏度下孵育 16 小时，然后进行细胞活力测定。通过洗涤处理过的细胞来开始此过程。从每个孔中取出培养基，加入 1 毫升 PBS，静置 1 分钟。
以这种方式用 PBS 洗涤细胞 3 次。用 1 毫升含 04% 台盼蓝的 PBS 重悬每个孔中的细胞，并在室温下染色 3 分钟。将细胞悬液转移到 1.5 mL 微量离心管中。
将 10 微升台盼蓝染色的细胞悬液转移到血细胞计数器中，并在光学显微镜下计数活的完整细胞。最后，按照文本协议中的说明进行统计分析。来自 Lymantria xylina MNPV 的 IAP3 的全长和两次截短在 Sf9 细胞中过表达，并对细胞裂解物进行 Western blot 以确认蛋白质表达。
抗凋亡蛋白 Ac-P35 作为阳性对照。在热休克后 1 小时或 5 小时，可以在转染细胞中检测到所有蛋白质，在 5 小时时表达更高。该系统可用于评估抗凋亡活性。
对于基因诱导的细胞凋亡，将凋亡诱导剂 Drosophila Reaper 与靶基因质粒构建体共转染到 Sf9 细胞中，随后对其进行热休克以激活基因表达。与载体 Drosophila Reaper 相比，阳性对照显示出高抗凋亡活性，存活率高达 80%。其他构建体对抗凋亡活性表现出各种影响。
对于化学诱导的细胞凋亡，仅将一种构建体转染到 Sf9 细胞中，并在热休克后 5 小时加入放线菌素 D。与阳性对照或阴性对照相比，其他构建体对抗凋亡活性表现出不同的影响。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两到三天内完成。
在尝试此过程时，请务必记住遵守层流中细胞培养的作规则，并认真检查细胞状态。按照此程序，可以执行其他方法（例如免疫共沉淀）来回答其他问题，例如昆虫细胞中共表达的两种蛋白质之间是否存在任何相互作用。开发后，这项技术为生物技术领域的研究人员探索动物或微生物中的蛋白质功能铺平了道路。
观看本视频后，您应该对如何使用该系统表达外源蛋白或评估昆虫细胞中可能具有功能拮抗作用的蛋白质有很好的了解。不要忘记，使用某些化学物质（如放线菌素 D）可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。
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概述
本协议描述了一个热休克诱导蛋白表达系统（pDHsp/V5-His/sf9细胞系统），用于评估昆虫细胞中外源蛋白的抗凋亡活性。该方法通过热休克诱导实现基因表达的受控时间。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 蛋白质组学
- 细胞生物学
背景
- 热休克诱导蛋白表达系统对于研究蛋白质功能很有价值。
- 昆虫细胞，如Sf9，常用于蛋白质表达。
- 这种方法也可以适用于哺乳动物蛋白质表达。
- 了解抗凋亡活性对于研究中的各种应用至关重要。
研究目的
- 评估候选蛋白的抗凋亡活性。
- 在受控环境中研究蛋白质相互作用。
- 提供蛋白质功能状态的见解。
使用的方法
- 热休克诱导用于基因表达控制。
- 使用在细胞培养基中生长的Sf9昆虫细胞。
- 评估外源蛋白及其截短氨基酸。
- 分析蛋白质相互作用和活性。
主要结果
- 在昆虫细胞中成功表达外源蛋白。
- 展示了候选蛋白的抗凋亡活性。
- 获得了蛋白质功能状态的见解。
- 突出了在生物技术和蛋白质组学中的潜在应用。
结论
- 热休克诱导的蛋白表达系统有效用于研究蛋白质功能。
- 该方法提供了一种受控的方法来评估蛋白质活性。
- 在其他表达系统中的进一步应用是可能的。
常见问题
Executive Industry Relevance
This heat shock-inducible expression system enables controlled temporal expression of foreign proteins in insect cells, supporting functional assays for anti-apoptotic activity. It provides a reproducible platform for evaluating protein function in a disease-relevant system, aiding target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The system’s adaptability to co-transfection of antagonistic proteins allows interrogation of protein interactions, enhancing predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of candidate proteins through controlled expression of full-length and truncated variants.
- Operational Value: Supports assessment of anti-apoptotic activity using apoptosis inducers like Drosophila Reaper or chemical agents such as actinomycin D.
- Strategic Value: Facilitates comparison of protein variants to clarify structure-function relationships and prioritize targets with desired functional profiles.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative protein expression data confirmed by Western blot at defined time points post-induction.
- Operational Value: Standardizes transfection and heat shock protocols across 24-well and six-well plate formats for consistent assay performance.
- Strategic Value: Enables scalable evaluation of protein variants under identical conditions, supporting hit-to-lead progression in proteomics workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses Sf9 cells as a disease-relevant system to model apoptotic pathways and assess protein-mediated cell survival.
- Operational Value: Produces viable cell counts via trypan blue exclusion, providing a functional readout for anti-apoptotic efficacy.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by linking molecular activity to cellular phenotype in a reproducible insect cell model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where functional validation of protein activity informs target selection and assay readiness for downstream screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing protein variants to evaluate anti-apoptotic function and interaction potential.
- Screening: Delivers reproducible transfection and induction workflows compatible with multi-well plate formats for medium-throughput functional screening.
- Analytics: Provides Western blot confirmation of expression and viability assays to quantify protein activity and cellular outcomes.
- Translational Research: Connects molecular function to phenotypic output in insect cells, supporting mechanistic understanding of apoptotic regulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse protein candidates across projects in biotechnology and proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by linking protein domains (e.g., RING, BIR) to anti-apoptotic activity through truncation analysis.
- Operational Value: Offers standardized protocols for cell culture, transfection, heat shock induction, and viability assessment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional data on protein variants before resource-intensive validation.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of candidates with demonstrated activity in a controlled, inducible expression system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect cell culture, transfection techniques, and heat shock induction protocols.
- Dependent on access to 28°C and 42°C incubators or water baths for temperature-controlled expression.
- Necessitates standardized reagent preparation and mixing to ensure consistent transfection efficiency across wells.
- Requires adaptation of plasmid design and promoter selection based on target protein and expression goals.
- Limited by the need for biosafety precautions when working with hazardous agents like actinomycin D.
