Name: 昆虫细胞 (sf9) 外源基因在蛋白质功能检测中的瞬态表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学习利用热休克诱导系统在Sf9昆虫细胞中进行外源基因瞬时表达，以评估候选蛋白的抗凋亡活性。该方法通过精确控制基因表达时机，为蛋白质功能研究和生物技术应用提供可靠实验手段。

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我们感谢中国台湾海洋大学海洋生物研究所的Jian-Horng Leu博士提供3种质粒构建体。本研究由台湾科技部（MOST）资助，项目编号为106-2311-B-197 -001 -。

1. 准备工作
<ol>
	<li>昆虫细胞培养
	<ol>
		<li>准备 50 mL 细胞培养基。向无血清细胞培养基（不含 FBS 或抗生素）中加入 500 µL 抗生素（两性霉素 B = 0.25 µg/mL，青霉素 = 100 单位/mL，链霉素 = 100 µg/mL）和 5 mL 热灭活胎牛血清。 
		注意：使用前将胎牛血清在 65 °C 水浴中加热 30 分钟。</li>
		<li>维持斜纹夜蛾（Spodoptera frugiperda，鳞翅目：夜蛾科）sf9 昆虫细胞。通过轻轻摇动 25 cm2 细胞培养瓶使约 80% 的细胞脱落，并在光学显微镜下观察。然后将 50% 的细胞悬液转移至新的 25 cm2 细胞培养瓶中，在室温下静置 15 分钟使细胞贴壁。更换为 5 mL 新鲜细胞培养基，并在 28 °C 培养箱中培养。根据细胞生长情况，每 2 至 3 天传代一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞转染用质粒的制备
	<ol>
		<li>采用基于 PCR 的克隆方法11，将目标 DNA 片段（例如，Lymantria xylina 多角体病毒（LyxyMNPV）iap3 基因及其缺失突变体）插入 pDHsp/V5-His 载体中。使用 PCR Master Mix（2X）和 pDhsp-F2/Op-IE2R 引物组通过菌落 PCR 检测转化菌落的生长情况。通过商业测序服务确认质粒序列。 
		注意：表 1 列出了用于 PCR 的引物及其对应的构建体。</li>
		<li>分别将含有上述质粒构建体（步骤 1.2）的单个测序正确的细菌菌落接种于 200 mL 含相应抗生素（50 µg/mL）的 LB 培养基中进行培养。</li>
		<li>按照制造商说明书12，使用 Midi 质粒提取试剂盒从培养的 E. coli 中提取质粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将 1.5 mL 细胞培养基与 8.5 mL 无血清细胞培养基混合，制备铺板培养基。</li>
	<li>向 10 mL 细胞培养基中加入 1.5 µL 放线菌素 D（ActD）储备液（1 mg/mL），配制放线菌素 D（ActD）细胞培养基（终浓度 = 150 ng/mL）。4 °C 保存。</li>
</ol>
2. 蛋白质瞬时表达
<ol>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>通过振摇培养瓶收获sf9细胞，将细胞悬液倒入50 mL离心管中，用P10移液器取10 µL转移至血细胞计数板。在光学显微镜下计数细胞数量。</li>
		<li>接种 3 × 105 将sf9细胞接种至24孔板的每孔中，室温孵育15分钟。弃去原培养基，更换为0.5 mL铺板培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒转染
	<ol>
		<li>稀释细胞转染试剂：将8 µL细胞转染试剂加入100 µL无血清细胞培养基中，涡旋混匀1分钟&#160;s.</li>
		<li>加入2 µg质粒DNA（pDHsp70-Ac-P35/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His）至100 µL无血清细胞培养基中，涡旋混匀1秒图2).</li>
		<li>将稀释的质粒DNA与稀释的细胞转染试剂（210 µL）混合，涡旋振荡1秒以充分混匀，室温孵育30分钟。</li>
		<li>用 P1000 移液器将 210 µL DNA 转染试剂混合物逐滴加入细胞中。在 28 °C 下孵育 5 小时。</li>
		<li>使用P1000移液器将铺板培养基更换为0.5 mL细胞培养基。用封口膜密封24孔板，于28 °C孵育细胞16 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>热激转染后的细胞：将培养板置于42 °C水浴中（漂浮于水面），热激30分钟，然后将24孔板放回28 °C培养箱中。</li>
	<li>蛋白表达检测
	<ol>
		<li>热激1小时或5小时后，用0.5 mL 1x缓冲液洗涤细胞&#160;用 PBS 缓冲液短暂洗涤三次。 
		注意：将10倍浓缩液稀释&#160;将1 mL 10x PBS缓冲液加入适量水中，稀释至1x PBS缓冲液&#160;PBS 缓冲液至 9 mL 灭菌 ddH₂O2O</li>
		<li>用40 µL的1x裂解细胞&#160;通过上下吹打混匀SDS上样缓冲液。 
		注意：将4倍浓缩液稀释&#160;SDS上样缓冲液，通过混合30 µL的1x&#160;PBS缓冲液和10 µL的4x&#160;SDS上样缓冲液</li>
		<li>将蛋白质样品在98 °C的加热块中加热10分钟，离心1分钟，然后置于冰上，用于Western blot检测。</li>
		<li>Western blot 实验 
		按照 Eslami 和 Lujan 的 Western blot 实验步骤进行操作13运行SDS-PAGE凝胶14：一块凝胶进行考马斯亮蓝染色（作为上样对照，用于检测各泳道中蛋白样品上样量是否相等），另一块进行Western blot检测，依据Eslami和Lujan的方法13.</li>
		<li>使用兔抗V5抗体（5 mg/mL）（按1:5000比例稀释于TBST缓冲液中，工作浓度为1 µg/mL）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（0.8 mg/mL）（按1:10000比例稀释于TBST缓冲液中，工作浓度为0.08 µg/mL）检测V5标签融合蛋白。 
		注意： 将聚丙烯酰胺的百分比调整为17.5%，当目标蛋白分子量为 &#60;17 kDa</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 抗凋亡活性检测
<ol>
	<li>基因诱导细胞凋亡：重复步骤2.1至2.3的操作。共转染1 µg含凋亡诱导基因的pDHsp/D-rpr/FLAG-His质粒DNA与1 µg质粒DNA [分别为pDHsp70/V5-His载体（阴性对照）、pDHsp70-Ac-P35/V5-His（阳性对照）、pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His、pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His]。热激处理5小时后，进行细胞活力检测图2).</li>
	<li>化学诱导细胞凋亡：重复上述2.1至2.3步骤。在步骤2.1.2中，接种1 × 10⁵个细胞/孔6 将sf9细胞接种至6孔板的每个孔中。每孔转染4 µg质粒DNA [分别为pDHsp70/V5-His载体（阴性对照）、pDHsp70-Ac-P35/V5-His（阳性对照）、pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His、pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His或pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His]。热激后5 h，用2 mL放线菌素D细胞培养液处理sf9细胞，持续16 h，随后进行细胞活力检测。图2). 
	注意： 覆盖一个所需的最小体积&#160; 6孔板每孔的体积为1 mL。</li>
	<li>重复进行上述抗凋亡活性检测实验，包括3.1和3.2步骤，每组设三个重复。</li>
</ol>
4. 细胞活力检测
<ol>
	<li>用移液管加入 1 mL 1×&#160;PBS 缓冲液洗涤处理后的细胞，每次 1 分钟，共洗涤 3 次。用移液管吹打重悬细胞于 1 mL 含 0.04% 台盼蓝的 1×&#160;PBS 缓冲液中，室温染色 3 分钟。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。 
	注意：通过将 9 mL 1×&#160;PBS 缓冲液与 1 mL 0.4% 台盼蓝溶液混合，稀释得到 0.04% 台盼蓝工作液。</li>
	<li>用 P10 移液器将 10 µL 台盼蓝染色的细胞悬液转移至血细胞计数板，在光学显微镜下计数有活力的完整细胞。</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>对记录的数据进行计算，并以所有计数结果的平均值 ± 标准差（S.D.）表示。</li>
		<li>使用 Microsoft Excel 软件进行 Student 双尾 t 检验分析数据。将统计学显著性定义为 P 值 &#60;0.05。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

基于热激的pDHsp/V5-His/sf9细胞系统概念最初由Clem提出 等 1994年8. 杆状病毒基因启动子的比较（IE1）和 果蝇 hsp70 表明 hsp70 在蚊虫细胞中具有更高的效率10此外，由于采用热激诱导，可在热激处理后精确控制蛋白的表达时间。该系统随后被应用于虾和核型多角体病毒（NPV）IAP蛋白的功能分析。9,11在本实验方案中，共使用了6种质粒构建体：其中三种（pDHsp/V5-His、pDHsp/Ac-p35/V5-His 和 pDHsp/D-rpr/FLAG-His）由 Jian-Horng Leu 提供9，另外三个构建体（pDHsp-iap3/V5-His、pDHsp-iap3-BIR/V5-His 和 pDHsp-iap3-RING/V5-His）由 Nai 构建 等</...

目前常用于蛋白质表达的两种系统分别为原核蛋白表达系统（Escherichia coli 基因表达系统）和真核蛋白表达系统。其中一种广泛应用的真核蛋白表达系统是杆状病毒表达载体系统（BEVS）1。杆状病毒最初被用作全球农业和林业害虫的生物防治制剂。在过去的几十年中，杆状病毒也被开发为用于蛋白质表达的生物技术工具。杆状病毒的基因组由双链环状DNA和包膜核衣壳组成2。迄今为止，已有超过七十八种杆状病毒分离株完成测序3。根据杆状病毒在宿主昆虫细胞中基因表达的时间级联特征，其基因转录可分为四个时序阶段，即即时早期、延迟早期、晚期和极晚期基因4。
BEVS被设计为利用极晚期基因启动子（即，多面体或p10启动子）驱动目标基因的表达，而重组杆状病毒则通过同源重组方法构建。利用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达外源蛋白，在翻译后修饰方面与哺乳动物细胞类似（适用于糖蛋白的生产）。因此，杆状病毒系统已被广泛应用5,6,7然而，一个局限在于昆虫细胞中存在不同的N-糖基化途径7.
因此，开发了一种新的杆状病毒表达系统——瞬时基因表达系统。该系统利用杆状病毒早期立即启动子（ie-1 启动子）在昆虫细胞中驱动外源基因的表达。通过该系统，目标蛋白可在 ie-1 启动子的调控下迅速表达，同时对昆虫细胞中的 N-糖基化途径进行改造，从而获得更优的 N-连接寡糖7。此外，杆状病毒早期立即基因由宿主细胞的 RNA 聚合酶 II 转录，无需任何病毒因子即可激活4，因此外源蛋白可在短时间内于昆虫细胞中实现表达。迄今为止，瞬时基因表达系统已成为在杆状病毒 体外 细胞培养体系中进行蛋白功能分析的最重要技术之一。该系统可用于分析杆状病毒蛋白或外源蛋白的功能。目前市面上一种可获得的瞬时基因表达系统，基于舞毒蛾多角体核型多角体病毒（Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus, OpMNPV）的早期立即基因（IE）启动子（OpIE2 和 OpIE1 启动子）构建而成。
然而，当使用基于OpIE启动子的瞬时基因表达系统时，外源基因在昆虫细胞中的表达水平较低仍然是一个问题8,9,10因此，基于该启动子构建了另一种瞬时基因表达系统 果蝇 热休克蛋白70（hsp70）基因8,9热休克诱导下，hsp70 启动子在昆虫细胞中的工作效率高于杆状病毒 IE 启动子10在此系统中，目标基因在驱动作用下表达 果蝇 热休克70（Dhsp70）启动子。通过基于PCR的克隆方法，可将外源基因轻松克隆至该瞬时表达质粒中。此外，可通过热休克诱导实现对基因表达时间的控制。
在本报告中，我们采用热激介导的瞬时蛋白表达系统，表达杆状病毒基因（Lymantria xylina 核多角体病毒的凋亡抑制因子3（iap3））的三种不同截短形式，并将所表达的蛋白进一步用于抗凋亡活性分析。该系统不仅能够快速表达外源蛋白，还可用于sf9细胞中蛋白抗凋亡活性的评估，同时具备应用于其他蛋白活性检测的潜力。

<table><tbody><tr><td>抗生素-抗真菌素，100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>用于昆虫细胞培养</td></tr><tr><td>认证胎牛血清</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>无血清细胞培养基</td></tr><tr><td>Sf9 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>25 cm² 细胞培养瓶</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT 感受态细胞</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; (DH5&amp;alpha;)</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller 配方）</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>细菌级琼脂</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td>筛选抗生素</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid 中量质粒提取试剂盒（无内毒素）</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>放线菌素 D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL 离心管</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>50 mL 管</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24 孔多孔板</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>24 孔板</td></tr><tr><td>Cellfectin II 试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td>细胞转染试剂</td></tr><tr><td>PBS-磷酸盐缓冲液 (10X) pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;times;SDS 上样缓冲液</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P（PVDF 印迹膜）</td><td>Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF 膜</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot 转印系统</td><td>BIO-RED</td><td>1703930</td><td>印迹装置</td></tr><tr><td>丽春红 S 溶液</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>兔抗 V5 抗体</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6 孔多孔板</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 移液器</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24 孔板封口膜 (19 mm&amp;times;36 M)</td></tr></tbody></table>

在昆虫细胞（sf9）中瞬时表达外源基因用于蛋白质功能检测

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

瞬时基因表达系统是利用杆状病毒进行蛋白质功能分析的最重要技术之一 体外 细胞培养系统。该系统被开发用于在杆状病毒启动子控制下，在瞬时表达质粒中表达外源基因。此外，该系统还可应用于杆状病毒本身或外源蛋白的功能分析。目前最广泛使用且商业化程度最高的瞬时基因表达系统是基于杆状病毒早期立即基因（IE）启动子构建的。 Orgyia pseudotsugata 多角体病毒（OpMNPV）。然而，外源基因在昆虫细胞中的表达水平较低。因此，构建了一种瞬时基因表达系统以提高蛋白表达水平。在该系统中，重组质粒被构建为包含由特定启动子调控的目标序列 果蝇 热激70（Dhsp70）启动子。本方案介绍了基于热激的pDHsp/V5-His（V5表位含6个组氨酸）的应用。草地贪夜蛾 细胞（sf9细胞）系统；该系统不仅可用于基因表达，还可用于评估候选蛋白在昆虫细胞中的抗凋亡活性。此外，该系统既可在昆虫细胞中转染单个重组质粒，也可共转染两个可能具有功能拮抗作用的重组质粒。本方案展示了该系统的高效性，并提供了该技术的实际应用案例。

基于热激启动的pDHsp/V5-His载体，在sf9细胞中过表达了来自LyxyMNPV的Ly-IAP3全长蛋白及其另外两个截短形式（BIR和RING结构域）。草地贪夜蛾 细胞（sf9 细胞）系统。pDHsp/V5-His 含有一个 果蝇 热休克蛋白启动子，可在特定温度下驱动下游基因表达 42 &#176;C 利用细胞转录因子和翻译系统进行条件调控（图1)8,9,11整个技术流程图如图所示。 图2热激处理1 h或5 h后，用蛋白样品缓冲液裂解细胞，并进行Western blot检测以确认蛋白表达。结果表明，在转染细胞中，无论热激后1 h或5 h，均可检测到全长蛋白AC-P35、Ly-IAP3、Ly-IAP3-BIR和Ly-IAP3-RI...

本方案描述了一种热激诱导的蛋白表达系统（pDHsp/V5-His/sf9细胞系统），可用于在昆虫细胞中表达外源蛋白，或评估外源蛋白及其截短氨基酸序列的抗凋亡活性。

瞬时基因表达系统是进行杆状病毒体外细胞中蛋白质功能分析的最重要技术之一。

该热激诱导蛋白表达系统的主要目标是在昆虫细胞中评估两种可能具有功能拮抗作用的蛋白的抗凋亡活性。该方法有助于解答生物技术和蛋白质组学领域中关于候选蛋白功能与活性的关键问题，例如其抗凋亡活性及蛋白相互作用。该技术的主要优势在于基因表达的时间可通过热激诱导进行精确控制。因此，该方法可提供有关蛋白质功能状态的信息，也可应用于其他系统，例如哺乳动物蛋白表达。本方案中使用的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9 昆虫细胞，在 28 摄氏度条件下，于 25 平方厘米细胞培养瓶中的细胞培养基中进行培养。轻轻摇动细胞培养瓶，使细胞从瓶壁脱落。然后在光学显微镜下观察，确认约80%的细胞已脱落。将50%的细胞悬液转移至一个新的25平方厘米细胞培养瓶中，并在室温下静置15分钟，使细胞贴壁。孵育15分钟后，更换为5毫升新鲜培养基，并在28摄氏度的培养箱中继续培养。根据细胞生长情况，每两到三天传代一次。在收获Sf9细胞之前，务必在光学显微镜下检查细胞，以确保无细菌或其他微生物污染。为收获Sf9细胞，轻轻振荡培养瓶使细胞脱落，然后将细胞悬液转移至15毫升离心管中。使用P10移液器取10微升细胞悬液加入血细胞计数板，在光学显微镜下计数细胞数量。将5×10⁴个细胞接种至24孔板的每个孔中，共接种三孔，并于室温放置15分钟。孵育15分钟后，将培养基更换为0.5毫升铺板培养基。准备细胞转染试剂。每次转染时，将8微升细胞转染试剂加入100微升无血清细胞培养基中稀释，并涡旋混匀1秒。本研究中，杆状病毒基因凋亡抑制因子3（inhibitor of apoptosis 3，IAP3）的三种不同截短形式将在果蝇热休克70启动子的调控下表达，分别为全长IAP3、缺失RING结构域的截短体以及缺失BIR结构域的截短体。将每种质粒DNA各2微克加入100微升无血清细胞培养基中，涡旋混匀1秒。同时制备阳性对照。将稀释的质粒DNA与稀释的细胞转染试剂混合，通过涡旋振荡混匀。室温孵育30分钟。使用P1000移液器，将每种DNA转染试剂混合物各210微升逐滴加入细胞中。在28摄氏度下孵育五小时。五小时后，用0.5毫升细胞培养基替换铺板培养基，然后用封口膜密封24孔板。在28摄氏度下继续孵育。次日，将培养板置于42摄氏度水浴中30分钟以进行热激诱导蛋白表达。30分钟后，将24孔板放回28摄氏度培养箱中。随后通过Western blot检测蛋白表达，具体步骤如文本方案所述。为了检测基因诱导的细胞凋亡，首先按照之前所述方法准备Sf9细胞。接着以相同方式转染细胞，但在每次转染反应中加入一微克含有凋亡诱导基因的质粒。在28摄氏度下孵育5小时，更换培养基后继续孵育16小时。将转染的细胞在42摄氏度下进行30分钟的热激处理。在进行细胞活力检测前，将细胞在28摄氏度下孵育5小时。对于化学诱导的细胞凋亡，将1 × 10⁶个Sf9细胞接种至6孔板的每个孔中。室温放置15分钟，然后将培养基更换为1毫升铺板培养基。用每种质粒DNA各4微克转染细胞。5小时后，将铺板培养基更换为1毫升细胞培养基，并在28°C下培养细胞16小时。然后在42摄氏度下热激30分钟。热激后将细胞在28摄氏度下培养5小时。随后用放线菌素D处理转染的细胞以诱导凋亡。在进行细胞活力检测之前，于 28 摄氏度下孵育 16 小时。开始此操作时，先洗涤经处理的细胞。吸去每孔中的培养基，加入一毫升 PBS，静置一分钟。以这种方式用 PBS 清洗细胞三次。每个孔中的细胞用含有 0.4% 台盼蓝的 1 毫升 PBS 重悬，并在室温下染色 3 分钟。将细胞悬液转移至 1.5 毫升微量离心管中。将10微升台盼蓝染色的细胞悬液转移至血细胞计数板，在光学显微镜下计数有活力的完整细胞。最后，按照文本方案中所述进行统计分析。斜纹夜蛾核多角体病毒（Lymantria xylina MNPV）IAP3的全长序列及其两种截短形式在Sf9细胞中过表达，并对细胞裂解液进行Western blot检测以确认蛋白表达。抗凋亡蛋白 Ac-P35 被用作阳性对照。所有蛋白在热激后一小时或五小时的转染细胞中均可检测到，其中五小时的表达水平更高。该系统可适用于评估抗凋亡活性。在基因诱导的细胞凋亡实验中，将凋亡诱导因子 Drosophila Reaper 与目标基因质粒构建体共同转染至 Sf9 细胞，并通过热激处理激活基因表达。与空载体对照相比，阳性对照显示出较强的抗凋亡活性，细胞存活率最高可达 80%。其他构建体对抗凋亡活性表现出不同程度的影响。对于化学诱导的细胞凋亡，仅将一种载体转染至Sf9细胞中，并在热激后五小时加入放线菌素D。与其他载体相比，该载体在抗凋亡活性方面表现出不同的效果。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到三天内完成。在进行该实验操作时，重要的是要牢记遵守超净工作台中细胞培养的操作规范，并仔细检查细胞状态。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如共免疫沉淀）来回答更多问题，例如共表达于昆虫细胞中的两种蛋白质之间是否存在相互作用。该技术建立后，为生物技术领域的研究人员探索蛋白质在动物或微生物中的功能开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用该系统在昆虫细胞中表达外源蛋白或评估潜在功能拮抗蛋白。请务必注意，某些化学试剂（如放线菌素 D）具有极高危险性，在操作过程中应始终采取预防措施，例如佩戴手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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利用高活性piggyBac转座酶的mRNA，成功实现了对草地贪夜蛾Spodoptera...

高活性 piggyBac 转座酶介导的秋黏虫Spodoptera frugiperda种系转化

学习利用热休克诱导系统在Sf9昆虫细胞中进行外源基因瞬时表达，以评估候选蛋白的抗凋亡活性。该方法通过精确控制基因表达时机，为蛋白质功能研究和生物技术应用提供可靠实验手段。

在昆虫细胞（sf9）中瞬时表达外源基因用于蛋白质功能检测

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