在昆虫细胞（sf9）中瞬时表达外源基因用于蛋白质功能检测

该热激诱导蛋白表达系统的主要目标是在昆虫细胞中评估两种可能具有功能拮抗作用的蛋白的抗凋亡活性。该方法有助于解答生物技术和蛋白质组学领域中关于候选蛋白功能与活性的关键问题，例如其抗凋亡活性及蛋白相互作用。该技术的主要优势在于基因表达的时间可通过热激诱导进行精确控制。

因此，该方法可提供有关蛋白质功能状态的信息，也可应用于其他系统，例如哺乳动物蛋白表达。本方案中使用的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9 昆虫细胞，在 28 摄氏度条件下，于 25 平方厘米细胞培养瓶中的细胞培养基中进行培养。

轻轻摇动细胞培养瓶，使细胞从瓶壁脱落。然后在光学显微镜下观察，确认约80%的细胞已脱落。将50%的细胞悬液转移至一个新的25平方厘米细胞培养瓶中，并在室温下静置15分钟，使细胞贴壁。

孵育15分钟后，更换为5毫升新鲜培养基，并在28摄氏度的培养箱中继续培养。根据细胞生长情况，每两到三天传代一次。在收获Sf9细胞之前，务必在光学显微镜下检查细胞，以确保无细菌或其他微生物污染。

为收获Sf9细胞，轻轻振荡培养瓶使细胞脱落，然后将细胞悬液转移至15毫升离心管中。使用P10移液器取10微升细胞悬液加入血细胞计数板，在光学显微镜下计数细胞数量。将5×10⁴个细胞接种至24孔板的每个孔中，共接种三孔，并于室温放置15分钟。

孵育15分钟后，将培养基更换为0.5毫升铺板培养基。准备细胞转染试剂。每次转染时，将8微升细胞转染试剂加入100微升无血清细胞培养基中稀释，并涡旋混匀1秒。

本研究中，杆状病毒基因凋亡抑制因子3（inhibitor of apoptosis 3，IAP3）的三种不同截短形式将在果蝇热休克70启动子的调控下表达，分别为全长IAP3、缺失RING结构域的截短体以及缺失BIR结构域的截短体。将每种质粒DNA各2微克加入100微升无血清细胞培养基中，涡旋混匀1秒。同时制备阳性对照。

将稀释的质粒DNA与稀释的细胞转染试剂混合，通过涡旋振荡混匀。室温孵育30分钟。使用P1000移液器，将每种DNA转染试剂混合物各210微升逐滴加入细胞中。

在28摄氏度下孵育五小时。五小时后，用0.5毫升细胞培养基替换铺板培养基，然后用封口膜密封24孔板。在28摄氏度下继续孵育。

次日，将培养板置于42摄氏度水浴中30分钟以进行热激诱导蛋白表达。30分钟后，将24孔板放回28摄氏度培养箱中。随后通过Western blot检测蛋白表达，具体步骤如文本方案所述。

为了检测基因诱导的细胞凋亡，首先按照之前所述方法准备Sf9细胞。接着以相同方式转染细胞，但在每次转染反应中加入一微克含有凋亡诱导基因的质粒。在28摄氏度下孵育5小时，更换培养基后继续孵育16小时。

将转染的细胞在42摄氏度下进行30分钟的热激处理。在进行细胞活力检测前，将细胞在28摄氏度下孵育5小时。对于化学诱导的细胞凋亡，将1 × 10⁶个Sf9细胞接种至6孔板的每个孔中。

室温放置15分钟，然后将培养基更换为1毫升铺板培养基。用每种质粒DNA各4微克转染细胞。5小时后，将铺板培养基更换为1毫升细胞培养基，并在28°C下培养细胞16小时。

然后在42摄氏度下热激30分钟。热激后将细胞在28摄氏度下培养5小时。随后用放线菌素D处理转染的细胞以诱导凋亡。

在进行细胞活力检测之前，于 28 摄氏度下孵育 16 小时。开始此操作时，先洗涤经处理的细胞。吸去每孔中的培养基，加入一毫升 PBS，静置一分钟。

以这种方式用 PBS 清洗细胞三次。每个孔中的细胞用含有 0.4% 台盼蓝的 1 毫升 PBS 重悬，并在室温下染色 3 分钟。将细胞悬液转移至 1.5 毫升微量离心管中。

将10微升台盼蓝染色的细胞悬液转移至血细胞计数板，在光学显微镜下计数有活力的完整细胞。最后，按照文本方案中所述进行统计分析。斜纹夜蛾核多角体病毒（Lymantria xylina MNPV）IAP3的全长序列及其两种截短形式在Sf9细胞中过表达，并对细胞裂解液进行Western blot检测以确认蛋白表达。

抗凋亡蛋白 Ac-P35 被用作阳性对照。所有蛋白在热激后一小时或五小时的转染细胞中均可检测到，其中五小时的表达水平更高。该系统可适用于评估抗凋亡活性。

在基因诱导的细胞凋亡实验中，将凋亡诱导因子 Drosophila Reaper 与目标基因质粒构建体共同转染至 Sf9 细胞，并通过热激处理激活基因表达。与空载体对照相比，阳性对照显示出较强的抗凋亡活性，细胞存活率最高可达 80%。其他构建体对抗凋亡活性表现出不同程度的影响。

对于化学诱导的细胞凋亡，仅将一种载体转染至Sf9细胞中，并在热激后五小时加入放线菌素D。与其他载体相比，该载体在抗凋亡活性方面表现出不同的效果。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到三天内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记遵守超净工作台中细胞培养的操作规范，并仔细检查细胞状态。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如共免疫沉淀）来回答更多问题，例如共表达于昆虫细胞中的两种蛋白质之间是否存在相互作用。该技术建立后，为生物技术领域的研究人员探索蛋白质在动物或微生物中的功能开辟了道路。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用该系统在昆虫细胞中表达外源蛋白或评估潜在功能拮抗蛋白。请务必注意，某些化学试剂（如放线菌素 D）具有极高危险性，在操作过程中应始终采取预防措施，例如佩戴手套。