Name: 经皮超声心动图引导心肌注射液与大鼠前体细胞的临床研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 24 s
Description: 学习经皮超声心动图引导下向兔左心室心肌注射药物的技术，用于心脏再生医学的临床前研究。该方法利用造影剂增强超声可视化，确保精准递送并降低并发症风险。

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作者感谢Sheila Monfort、Brenda Martínez、Carlos Micó、Alberto Muñoz和Manuel Molina在数据收集过程中提供的出色支持，感谢Carlos Bueno提供EGFP(+) HEK-293细胞。本工作部分得到以下资助：西班牙穆尔西亚地区科学与技术局Séneca基金会（JT）（项目编号：11935/PI/09）；ISCIII-子项目网络，2008–2011年第六个国家研发创新计划细胞治疗网络（项目编号：RD12/0019/0001）（JMM），由欧洲联盟结构基金（FEDER）共同资助（JMM）；以及英国雷丁大学（AG、GB）（中央基金）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

本研究所述实验已获西班牙穆尔西亚大学伦理研究委员会批准，并遵循欧盟委员会第2010/63/EU号指令执行。所述步骤均依据标准操作规程进行，属于工作计划的一部分，并非仅为拍摄本文所附视频而单独实施。
1. 细胞和哺乳动物表达载体的制备
注意：此处我们简要描述一种细胞系（人胚肾293细胞（HEK-293））的制备与转染方案；然而，针对所研究的特定细胞类型，应优化相应的细胞特异性操作步骤例如，干细胞）
<ol>
	<li>在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养 HEK-293 细胞，培养基中添加 10% 胎牛血清（FCS）、1% 丙酮酸钠、2 mM 谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素，并在含 5% CO2 的湿润环境中 37 °C 培养。当细胞达到亚融合状态时，按 1:3 的比例传代。</li>
	<li>开始传代时，吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，去除多余的 PBS，然后加入 2.5 mL 0.5x 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 下孵育 5 分钟。
	<ol>
		<li>加入等体积的 DMEM 培养基（按上述方式添加补充物）以终止反应，然后使用电子移液器缓慢轻柔地反复吹打，使细胞脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液转移至适当的容器（例如，15–50 mL 锥形离心管）中，在摆动转子离心机中离心（100 × g），弃去上清液，并用无菌 PBS 洗涤沉淀两次。</li>
	<li>将沉淀重悬于新鲜 DMEM 培养基中，根据本地实验室操作规范，以适当的细胞密度（例如，75 cm2 培养瓶中接种 1 × 106 个细胞）接种至新鲜培养瓶或大培养皿中。
	<ol>
		<li>每 2 天更换一次新鲜培养基。 
		注：表达载体源自 pIRES1hyg，其使用方法按照制造商说明进行，如先前所述21。p(EGFP) IRES1hyg 是通过将 pEGFP-N1 中的 EGFP cDNA 以 BamHI + NotI 片段亚克隆至经 BamHI + NotI 消化的 pIRES1hyg 中而构建的21。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染前一天，以 0.5 × 105 个细胞/cm2 的密度将 HEK-293 细胞接种于 12 孔或 24 孔组织培养板中。</li>
	<li>在转染当天，于不同的 1.5 mL 微量离心管中（每孔 1 管）分别制备 DNA-脂质体转染试剂复合物。
	<ol>
		<li>首先向每根管中加入 250 µL 低血清培养基，然后加入 4 µg DNA（轻轻混匀）。</li>
		<li>随后，向每根管中加入 250 µL 预先配制的混合液（含 10 µL 脂质体转染试剂和 250 µL 低血清培养基）（再次轻轻混匀）。</li>
		<li>最后，将 HEK-293 细胞与 DNA-脂质体转染试剂复合物共孵育 4 小时进行转染，然后更换为上述补充成分的 DMEM 培养基（步骤 1.1），继续孵育 48 小时。使用 100 µg/mL 潮霉素 B 对稳定转染细胞进行药物筛选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按上述方法（步骤 1.2）用胰蛋白酶消化脱离 HEK-293 细胞。用无菌 PBS 洗涤细胞后，重悬于适当的悬浮介质中（例如，含 10% v/v InI 的 PBS），使最终细胞浓度达到 5 × 106/mL。</li>
</ol>
2. 兔子的准备
注意：在进行心肌内注射（IMI）时，兔子和换能器的定位并不适合评估动物心脏的形态和功能。因此，建议在IMI之前（见下文）以及根据实验设计规定的后续时间点，进行全面的超声心动图检查20。该检查旨在评估接受注射的动物心脏在基线状态下的解剖结构和功能特征，同时评估IMI对心脏功能的影响。
<ol>
	<li>以盲法进行此项检查，并遵循美国兽医内科学会超声心动图委员会以及美国超声心动图学会/欧洲心血管影像学会的指南22,23,24。</li>
	<li>在整个超声心动图检查过程中同步获取单导联心电图（ECG）记录。</li>
	<li>通过肌内注射（I.M.）给予兔氯胺酮 10 mg/kg 与美托咪啶 200 µg/kg 进行麻醉。</li>
	<li>麻醉给药后 10–20 分钟，确认麻醉深度。</li>
	<li>使用毛发修剪器广泛去除胸部毛发（例如，从颈部下方至剑突下区域）（图 1A）。</li>
	<li>在右前肢内侧（肘正中区）及双后肢（胫正中区）额外剃除 1–2 cm2 的毛发区域（图 1B）。</li>
	<li>将粘性心电图电极置于四肢已剃毛区域，以在操作过程中同步监测心律（图 1C）。</li>
	<li>将动物仰卧位放置于保温毯上，使用手术胶带将四肢固定并拉直于操作台（图 1C）。
	<ol>
		<li>确保兔耳向后弯曲并位于头部/背部后方，且位置低于其前肢，这有助于在整个操作过程中维持动物胸廓的正确体位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在整个操作过程中通过面罩持续给予氧气（100%，2–3 L/min），同时允许动物自主呼吸。</li>
</ol>
<img alt="动物超声准备，戴手套的手，剃毛的皮肤，超声探头，兽医操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. 兔子心肌内注射（IMI）前的准备。 （A）剪除胸部毛发；（B）剪除四肢毛发；（C）连接电极，并将兔子四肢伸展置于保温毯上。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 兔经皮对比增强超声心动图引导下的心肌内注射技术
<ol>
	<li>使用基于氯己定的溶液清洁并消毒胸部皮肤。
	<ol>
		<li>在整个操作过程中，应遵循现行最佳实践，采用无菌技术。</li>
		<li>在条件允许且切实可行的情况下，应尽可能执行完全无菌操作，包括但不限于使用无菌材料，如无菌手术衣、手套、手术切口巾、用于台面的无菌敷料材料，以及无菌超声探头套和无菌超声耦合剂。这将最大限度地降低向接受乳房内注射（IMI）动物引入病原体的风险，并符合临床实践中的标准操作规范。例如，进行心脏穿刺时）。 
		注意：建议始终遵循适用于所在机构及执业国家的当地和国家有关动物研究的法规。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在胸部和/或探头上涂抹超声传导凝胶，将探头线绕在实验者颈部，对动物心脏进行快速扫查以寻找成像窗，这通常有助于观察解剖结构并规划心肌内注射（IMI）操作。</li>
	<li>手动将换能器置于第4位th-6th 肋间隙，距右侧胸骨旁线约 2-3 cm，入射角度约为 ~ 90° 相对于胸壁右侧（图2A).</li>
	<li>调整换能器相对于肋间隙的位置及其前后和背腹角度，以优化乳头肌水平的改良短轴切面。在此切面中识别右心室（RV）、左心室（LV）、室间隔（IVS）、后壁（PW），以及前外侧（AL）和后内侧（PM）乳头肌。图2B).
	<ol>
		<li>通过系统上的适当控制，显著增加景深，从而获得广阔的视野例如按钮，旋钮，转盘</li>
		<li>在此视图中，需特别注意获得对称的图像，以及心内膜和心外膜轮廓的适当区分；如有必要，可通过图像优化控制进行调整。例如，增益）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获得最佳超声心动图切面后（图2B），在整个后续操作过程中保持此位置，同时由第二名操作人员实施IMI（见下文）。
	<ol>
		<li>操作探头时，应避免遮挡探头方向标记，该标记应始终朝向前方，以便在后续步骤中与针具对齐。图2A, C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用连接1 mL注射器的24G针头，将针头置于左侧半胸壁皮肤附近，位置相对于换能器呈对称镜像。然后，手动将针头与换能器的方向标记对齐，角度约为~ 90° (图2C），并缓慢将针头穿过皮肤进入胸腔。 
	注意：以该位置和方向进行经皮穿刺进针，有助于在超声束平面内清晰显示针尖图 2D, E），从而实现实时监测，并在必要时调整针头相对于心肌目标区域的位置（图 2G, H).</li>
	<li>将针尖置于目标位置后，在10-30秒内缓慢注入注射液（每次注射点不超过0.25 mL）图2E），同时在注射过程中缓慢轻柔地回撤针头，以扩大心肌治疗范围。
	<ol>
		<li>使用 InI 10%（v/v）溶于 PBS 中，用于技术的标准化以及作为 原位 示踪剂，同时在获取操作技能的过程中确认对心肌内所有四个IMI位点的成功靶向，通过大体病理学和组织病理学进行验证（参见 代表性结果)。一旦达到操作熟练程度，可根据需要将InI替换为合适的商用超声造影剂。 
		注意：将用 PBS 稀释的 10%（v/v）InI（含或不含细胞）递送至心肌后，会导致透壁性高回声即，在注射靶点处呈现明亮回声）图 2E, F). 与室性早搏相关的心率一过性减慢或加快（例如，孤立性、成对及三个一组的早搏）甚至在针头首次接触心外膜时以及IMI期间和/或之后即常可观察到。然而，未出现危及生命的 心律失常，且使用剂量达0.25 mL（1.25 × 106 每个IMI注射部位注射液中的细胞数（参见 代表性结果 和 讨论).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要轻微调整进针角度，以完成对四个目标心肌内注射位点的注射（左心室游离壁三个位点，室间隔一个位点），每个位点注射0.25 mL。</li>
	<li>完成经皮对比超声心动图引导下的心肌内注射（IMI）手术后，评估心律（例如通过连续心电图描记和/或24小时动态心电图监测，并进行连续窗位超声心动图扫描以确认无并发症发生，直至动物完全从麻醉中恢复后，方可转移至光周期饲养室。
	<ol>
		<li>在此，我们采用24小时动态心电图（Holter ECG）监测IMI联合InI对心律持续24小时的影响。为此，我们比较了6只表型正常的家兔（正常组）与6只接受静脉注射阿霉素（一种具有心脏毒性的蒽环类药物，常用于癌症治疗；DOX组）的家兔，后者以2 mg/kg/周的剂量给药8周，随后两组均接受IMI联合InI治疗。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于动物模型心脏功能分析的超声成像及探头放置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2．在兔模型中通过经皮对比增强超声心动图引导心肌内注射。（A）将超声探头置于右侧半胸壁，角度约为 ~ 90°。（B）兔心脏乳头肌水平的胸骨旁短轴切面（PSSX）代表性图像。（C）注射针与探头定位标记成约 90° 角度对齐。（D）在心脏PSSX切面中，针尖位于目标部位（注意：针体在超声束平面内清晰可见）。（E 和 F）心肌内注射印度墨水后，目标部位出现强回声区域（箭头指示透壁性高回声）。（G）针尖意外进入左心室腔内（箭头指示针体）。（H）将针重新调整至左心室游离壁（箭头指示针体）。RV = 右心室；LV = 左心室；IVS = 室间隔；PW = 后壁；AL = 前外侧乳头肌；PM = 后内侧乳头肌。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. IMI 后续分析
<ol>
	<li>对兔心脏组织样本进行组织病理学分析。
	<ol>
		<li>将组织在10%甲醛中固定24小时，随后用浓度递增的乙醇进行脱水，步骤如下： 
		• 70%乙醇中1次（60分钟） 
		• 95%乙醇/5%甲醇中1次（60分钟） 
		• 100%乙醇中1次（60分钟） 
		• 100%乙醇中1次（90分钟） 
		• 100%乙醇中1次（120分钟） 
		注：上述所有孵育步骤均在室温（RT）下进行。然后，在100%二甲苯中置换两次（每次1小时，室温），最后分两步在石蜡中包埋（60分钟，58 °C）25。</li>
		<li>使用切片机对组织进行4–5 µm厚度的切片25，并将切片贴附于载玻片上。</li>
		<li>采用苏木精-伊红染色法和Masson三色染色法进行染色25,26,27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对移植心脏的组织切片进行免疫组织化学检测，以识别EGFP(+) HEK-293细胞（例如，使用亲和素-生物素复合物（ABC）法），简要步骤如下：
	<ol>
		<li>将4–5 µm厚的心脏切片置于100%二甲苯中脱蜡（10分钟，室温）。通过依次降低乙醇浓度的溶液洗涤进行再水化（100%乙醇中2次，每次2分钟；95%乙醇中2次，每次2分钟；70%乙醇中1次，2分钟；50%乙醇中1次，2分钟；30%乙醇中1次，2分钟；ddH2O中1次，2分钟），所有步骤均在室温下进行。</li>
		<li>用100 µL 3% H2O2甲醇溶液覆盖切片，以阻断内源性过氧化物酶活性（该溶液由5 mL 30% H2O2储存液加甲醇至总体积50 mL配制而成），室温孵育30分钟，随后用Tris缓冲盐水（TBS；pH 7.6）浸洗。</li>
		<li>通过酶消化法进行抗原修复：用100 µL 0.1% Pronase溶液（将0.01 g Pronase溶于10 mL TBS中配制）覆盖切片，室温孵育12分钟，随后用TBS洗涤5分钟（室温）。</li>
		<li>每张切片加入100 µL封闭液（TBS中含10%正常山羊血清），室温孵育30分钟，随后用TBS洗涤5分钟（室温）。</li>
		<li>加入鸡抗绿色荧光蛋白（GFP）一抗（TBS中1:500稀释），30 °C孵育1小时，随后用TBS洗涤5分钟（室温）。</li>
		<li>加入生物素化山羊抗鸡IgG二抗（TBS中1:250稀释），30 °C孵育1小时，随后用TBS洗涤5分钟（室温）。</li>
		<li>加入亲和素-生物素复合物（30 °C孵育20分钟），然后使用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色（室温，5–10分钟）。</li>
		<li>最后，在室温下用浓度递增的乙醇溶液洗涤进行脱水（30%乙醇中1次，2分钟；50%乙醇中1次，2分钟；70%乙醇中1次，2分钟；95%乙醇中2次，每次2分钟；100%乙醇中2次，每次2分钟），使用苏木精-伊红染色法进行复染25，封片。实验需包括阳性对照、阴性对照及同型对照。 
		注：上述简要方案不适用于常规免疫组织化学实验；针对特定组织和实验条件需进行优化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

主要目标是开发一种微创技术，用于将干细胞递送至兔子（一种大体型的临床前动物模型）的心肌中17,18，同时利用许多临床和科研中心普遍配备的相对经济的成像系统。在此，我们证明，使用临床超声心动图系统，并结合广泛可用的显影剂InI，可实现 原位 由于具备示踪能力和回声特性，经皮超声造影引导下的心肌内注射在将注射物递送至兔心脏靶区域方面非常有效。据我们所知，这是首次在兔等大动物模型中描述经皮超声造影引导下的心肌内注射及细胞递送方法。18,19尽管InI此前已在研究中使用过 原位 注射物在组织内的定位7,28据我们所知，这是首次描述该试剂兼具双重特性的研究 体内 超声造影剂以及作为 原位 示踪剂 离体确实，造影...

细胞和基因治疗是用于再生或修复射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）中心肌损伤的令人期待且不断发展的策略。一些研究比较了不同细胞递送途径的有效性（例如，细胞滞留率），结果一致表明，经心肌内注射（IMI）优于经冠状动脉或静脉途径1,2,3,4,5。因此，大多数针对心肌损伤干细胞治疗转化模型的研究均采用开胸直视下经心肌内注射的方式递送注射物，这并不令人意外6,7。然而，该方法存在若干局限性，包括操作本身的侵入性，可能带来围术期死亡风险（常被低估）8。此外，直视下的心肌内注射仍无法完全避免误将细胞注入心室腔内的可能性。在临床实践中，开胸手术期间进行心肌内注射可能是治疗性细胞递送的合适方法，例如，在冠状动脉旁路移植术（CABG）期间；但该方法可能不适用于非缺血性病因引起的弥漫性心肌病（例如，由蒽环类药物诱导的心肌病（AICM）继发的HFrEF）的细胞递送。
毫无疑问，缺血性心脏病（IHD）是射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）最常见的病因（约66%）9,10；然而，非缺血性心肌病（包括抗癌药物诱导的心肌病，AICM）仍影响着相当比例的HFrEF患者（33%）9。事实上，近年来临床肿瘤学的进步使得仅在美国就有超过1000万癌症幸存者11，欧洲的估计数量也与此相近，这与癌症患者总体生存率不断提高的趋势一致12,13。因此，鉴于因抗癌药物继发心脏毒性而受影响的患者数量日益增加，探索干细胞移植等新型疗法在非缺血性心肌病中的益处，以及尝试有效且微创的干细胞递送途径，显得尤为重要。
值得注意的是，旨在修复或再生受损心肌的干细胞治疗假说验证研究通常涉及使用小型啮齿类动物（例如，小鼠和大鼠）。这些模型通常需要昂贵的高频超声系统来评估心肌功能，这类系统一般配备线性阵列换能器，而该类换能器存在一些固有的局限性（例如，混响）14然而，其他模型如兔子作为大型临床前模型，在HFrEF干细胞治疗的假设验证中具有一些优势。因此，与大鼠和小鼠不同，兔子维持一种钙+2 转运系统和细胞电生理学特性与人类及其他大型动物相似例如、狗和猪）15,16,17,18,19另一个优势是，它们适用于采用相对高频率相控阵换能器的、配备相对便宜且广泛可用的临床超声心动图系统的进行心脏超声成像， 例如12 MHz，常用于新生儿和儿科心脏病学。这些系统采用先进的技术，可实现优质的超声心动图成像，并充分利用谐波成像的优势20此外，对心脏再生疗法潜力的广泛假设检验（例如干细胞治疗）的安全性、有效性、心肌生成潜能，以及注射物进入心肌后归宿的评估，在考虑其用于人体之前是必不可少的，且需要使用兔等大型临床前动物模型。17,19在此，我们描述了一种通过经皮对比增强超声心动图引导下心肌内注射（IMI）进行细胞递送的微创技术，该技术使用临床超声心动图系统，旨在为非缺血性心肌病的干细胞移植治疗提供支持。20我们还描述了印度墨水（InI，又称中国墨水）作为超声造影剂的优势 原位 兔心脏中注射物的示踪剂。

<table><tbody><tr><td>HD11 XE 超声系统</td><td>Philips</td><td>10670267</td><td>超声心动图系统。</td></tr><tr><td>S12-4</td><td>Philips</td><td>B01YgG</td><td>4-12 MHz 相控阵探头</td></tr><tr><td>超声传导凝胶（Aquasone）</td><td>Parket Laboratories Inc</td><td>N 01-08</td><td></td></tr><tr><td>Vasovet 24G</td><td>Braun</td><td>REF 381212</td><td>&amp;nbsp;套管针导管</td></tr><tr><td>Omnifix-F 1 ml 注射器</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Imalgene（氯胺酮）</td><td>Merial</td><td>RN 9767</td><td>需兽医处方</td></tr><tr><td>Domtor（美托咪定）</td><td>Esteve</td><td>CN 570686.3</td><td>需兽医处方</td></tr><tr><td>加热垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faber-Castel TG1</td><td>Faber-Castel</td><td>16 33 99</td><td>印度（中国）墨水</td></tr><tr><td>Holter Syneflash</td><td>Ela Medical</td><td>SF0003044S</td><td>24 小时动态心电图（Holter ECG）系统。</td></tr><tr><td>Blue Sensor&amp;reg; 电极</td><td>Ambu (NUMED)</td><td>VLC-00-S</td><td>动态心电图电极。</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>CO11</td><td></td></tr><tr><td>ABC Vector Elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td>亲和素-生物素复合物试剂盒。</td></tr><tr><td>鸡抗 GFP 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A10262</td><td>一抗。</td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗鸡 IgG 抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9010</td><td>二抗。</td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）</td><td>DAKO (Agilent)</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss&lt;br/&gt; MicroImaging</td><td>Zeiss AX10 Axioskop</td><td></td></tr><tr><td>动态心电图（Holter ECG）</td><td>Elamedical</td><td>Syneflash SF0003044S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基（DMEM）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>10% 胎牛血清（FCS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11573397</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000（脂质转染试剂）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>低血清培养基（Opti-MEM）</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>Calbiochem (MERCK)</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯（组织学用）</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液（H2O2）</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Fisher Scientific</td><td>53-702-250KU</td><td></td></tr></tbody></table>

经皮对比超声心动图引导下心肌内注射及细胞递送在大型临床前模型中的应用

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

细胞与基因治疗是针对射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）背景下实现心脏再生的富有前景且极具潜力的策略。在考虑将其应用于人体并开展临床实施之前，必须在大型动物模型中进行广泛的临床前研究，以评估注射物的安全性、有效性和归宿例如，干细胞）一旦被递送至心肌后。小型啮齿类动物模型具有以下优势（例如，具有成本效益高、易于进行遗传操作等优点）；然而，由于这些模型存在固有的局限性，其研究结果很少能转化为临床应用。相反，兔子等大型动物模型则具有以下优势（例如，与人类及其他大型动物具有相似的心脏电生理特性），同时具备良好的成本效益。本文展示了如何在兔模型中实施经皮对比超声心动图引导下的心肌内注射（IMI）技术，该方法具有微创、安全、耐受性好等优点，可高效地将注射物（包括细胞等）靶向递送至心肌多个部位。本技术的实施还利用了临床广泛使用的超声心动图系统。通过实践本方案，具备基础超声知识的研究人员即可掌握这一用途广泛且微创的技术，用于在兔模型中常规开展心脏再生治疗能力的假设验证实验。一旦操作熟练，自兔麻醉完成后起，整个操作可在25分钟内完成。

经皮对比超声心动图引导下经间隔心肌内注射联合冠状动脉内注射：
根据上述方案，在通过超声心动图确认针尖处于最佳位置并开始注射后，可在注射InI（PBS中10% v/v）过程中观察到透壁性高回声现象。图 2E），以及在IMI后不久到达目标区域（图 2F）。当IMI后立即实施安乐死并取出心脏时，通过心脏外部检查即可清晰观察到InI沉积物。图3A）。此外，心脏组织切片， 例如，乳头肌水平的短轴切面（图3B)，在注射部位显示出InI染料的透壁沉积，从而证明利用该技术可成功且有效地将注射物递送至心肌。值得注意的是，所观察到的透壁高回声性 体内 在IMI期间<s...

在考虑将新型治疗策略应用于人体之前，心脏再生医学领域需要在大型临床前动物模型中进行广泛而详细的研究。本文中，我们演示了一种在兔模型中通过经皮对比超声心动图引导下进行心肌内注射的技术，该技术对于验证此类新型疗法的有效性具有重要的假说检验价值。

细胞与基因治疗是针对射血分数降低型心力衰竭背景下实现心脏再生的富有前景且令人期待的策略……

本操作的总体目标是利用经皮对比超声心动图引导，安全、准确地将一定体积的注射液递送至兔心脏的左心室心肌内。首先对动物进行麻醉，然后为手术操作准备胸腔。接下来，将兔子放置在保温毯上，确认心电图信号正确显示后，使用临床超声系统获取合适的声窗，并在宽视野下优化图像。然后，将标记细胞与合适的对比剂混合后装入注射器，在超声引导下，小心调整穿刺针使其正对探头，并将其置于左侧半胸壁皮肤附近，再缓慢推进穿刺针至心肌目标区域。最后，通过超声心动图图像中注射部位出现跨壁高回声信号，证实注射物已安全送达目标位置。最终，通过观察心肌中染料的存在，可在离体情况下证实注射物的成功递送；而通过心肌组织切片的横断面免疫组织化学分析，则可用于显示细胞标记物和染料已成功递送至目标心肌区域。本视频旨在演示如何安全、准确地在今日所用的兔模型上实施该技术，使用临床超声心动图系统进行操作。该技术的主要优势在于设备简单、基础，并且能够利用对比增强超声心动图引导，精确可视化注射靶点，从而将意外发生心腔间注射的风险降至最低。在进行心肌内注射之前，首先注射氯胺酮和美托咪啶的混合物以麻醉动物。如图所示，用手术巾覆盖兔的头部后，动物会保持安静。动物麻醉后，使用电推剪去除胸壁皮肤上的毛发，从颈部下方开始，然后移至剑突下区域。剃除右前肢内侧以及左右后肢胫骨内侧区域各1至3厘米范围的毛发。然后在电极上涂抹适量的导电凝胶，并将其放置于剃毛后的肢体区域。使用外科胶带固定电极，以防止在操作过程中因动物移动而导致电极接触脱落。接下来，将动物放置于加热毯上，确认系统屏幕显示正确的心电图信号，保持动物仰卧位，并在整个操作过程中通过面罩给予氧气，使其自主呼吸。使用含氯己定的溶液彻底清洁和消毒已剃毛的胸部皮肤。为了确保探头与皮肤的良好接触，并减少伪影、提高整体成像质量，应在探头上涂抹足量的超声耦合剂。然后，将探头手动放置于右侧胸骨旁线外2至3厘米处的第四至第六肋间隙，超声束的入射角度相对于胸壁约为90度。确保探头的方向标记朝向前方，以便在后续步骤中与穿刺针保持对齐。此时应获得乳头肌水平的胸骨旁短轴切面心脏图像。通过系统中的适当调节来增加深度，从而获得较宽的视野，这一点非常重要。如有必要，调整换能器相对于肋间隙的位置，以及其前后和背腹角度，以优化图像，然后在此视图中识别右心室（RV）、左心室（LV）、室间隔（IVS）、后壁（PW），以及前内侧和后内侧乳头肌。应特别注意获得对称的图像，并清晰区分心内膜和心外膜轮廓；如有需要，可通过增益控制等图像优化调节进行调整。获得正确的超声心动图切面后，在其余操作过程中应保持该位置不变，同时由第二位操作者进行心肌内注射。操作时，使用预先装好试剂的注射器并连接针头，将其置于左前胸壁皮肤附近，位置应相对于超声探头呈对称镜像。随后，手动将针头与探头上的定位标记对齐，角度约为90度，然后缓慢将针头穿过皮肤进入胸腔

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医学

经皮超声心动图引导心肌注射液与大鼠前体细胞的临床研究

在心血管疾病（如高血压或心肌梗死）的鼠类模型中，心肌内细胞移植被广泛用于评估不同细胞类型在再生研究中的治疗潜力。因此，对该手术操作进行详细描述并提供清晰的可视化展示，将有助于明确在小型啮齿类动物中开展心血管细胞治疗分析的局限性与优势。...

心肌内细胞递送：小鼠心脏中的观察

超声心动图引导下的经皮心肌内注射是一种高效、可靠且可靶向的小鼠心脏基因转导剂或细胞递送方法。按照本方案所述步骤操作，实验人员可迅速掌握这种用途广泛且微创的技术。...

超声引导下经胸心肌内注射小鼠技术

在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导下的细胞递送是一种安全、有效且便捷的细胞移植方法。...

超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

本方案描述了在猪模型中给予心脏活性治疗药物的三种方法。雌性长白猪通过以下任一途径接受治疗：（1）开胸经心外膜注射，（2）导管介导的经心内膜注射，或（3）静脉输注 通过...

在猪心肌梗死模型中递送心脏活性治疗药物

本文详细介绍了一种采用29 G x 88...

超声心动图引导下靶向且可靠的干细胞心肌内注射在心肌梗死大鼠模型中的应用

在小鼠急性缺血/再灌注损伤和慢性重塑的研究中，涉及多种基因操作和/或心肌内注射基因、蛋白质、细胞和/或生物材料，这些操作随时间维度叠加进行。本视频展示了缺血/再灌注、永久性冠状动脉结扎以及心肌内注射研究的显微外科操作步骤。...

冠状动脉结扎与心肌内注射在小鼠心肌梗死模型中的应用

通过半脾注射技术建立的肝转移瘤的临床前小鼠模型。...

一种肝转移的临床前小鼠模型

本实验的总体目标是从小鼠肋骨上成功切除一段骨组织。该手术程序被开发用于研究大段长骨修复的模型。...

小鼠肋骨切除手术操作：一种大规模长骨修复模型

来源于人诱导性多能干细胞的自发收缩心肌细胞合胞体是研究人类心脏生理学和药理学的有用模型。本文介绍了一种高通量筛选系统，该系统利用钙敏感性荧光染料和温度可控的成像多孔板读数仪，定量分析外源性化合物对搏动频率的影响。...

在温度控制的384孔板中使用钙敏感荧光染料测量人诱导多能干细胞衍生心肌细胞合胞体的收缩

我们描述了一种用于在高脂血症和糖尿病兔模型中诱导外周缺血的外科手术方法。该手术可作为外周动脉疾病患者临床前研究的模型。同时介绍了血管造影术，用于评估所诱导缺血的程度以及灌注恢复情况。...

糖尿病兔后肢缺血的临床前模型

学习经皮超声心动图引导下向兔左心室心肌注射药物的技术，用于心脏再生医学的临床前研究。该方法利用造影剂增强超声可视化，确保精准递送并降低并发症风险。

经皮对比超声心动图引导下心肌内注射及细胞递送在大型临床前模型中的应用

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