Name: 骨科手术的小鼠模型研究术后认知功能障碍与组织再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习使用小鼠骨科手术模型研究术后认知功能障碍与组织再生。通过联体共生技术连接年轻与老年小鼠，观察胫骨骨折后的神经炎症、骨愈合及认知功能变化，为老年患者术后并发症防治提供依据。

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感谢杜克大学医学中心麻醉科的 Kathy Gage（理学士）在编辑方面提供的帮助。NT 感谢杜克大学麻醉科 DREAM 创新奖和美国国立卫生研究院衰老研究所 R01 AG057525-01 项目的支持。

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经机构动物护理 &amp;#38; 杜克大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）。
1. 实验动物
<ol>
	<li>将小鼠饲养在具有12小时光照/12小时黑暗循环的空调环境中，并确保其能正常获取标准食物和饮水。每笼饲养不超过5只同窝小鼠，并避免可能诱发打斗的条件。</li>
	<li>使用3月龄（年轻）或18月龄（老年）的雌性C57BL6/J小鼠。</li>
	<li>进行异种共生手术前，需将两只小鼠共同适应至少两周&#160;。小鼠品系为野生型C57BL6/J或eGFP+。</li>
	<li>每天检查小鼠的身体状况和整体外观。</li>
</ol>
2. 连体手术和骨科手术的术前准备
<ol>
	<li>称量2只小鼠。</li>
	<li>通过麻醉系统以0.2 L/min的恒定O2流速进行全身麻醉。在诱导室中使用5%异氟烷进行诱导。 
	注意：可通过夹捏脚趾反应确认麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于加热垫上。在整个手术过程中使用直肠探头监测体温。</li>
	<li>为维持麻醉，通过面罩将吸入的异氟烷浓度降低至2.0%（氧气流速0.2 L/min），并持续监测以确保足够的麻醉深度。</li>
	<li>使用脉搏血氧仪无创监测生理参数（呼吸频率、血氧饱和度和心率）（可选）。</li>
</ol>
3. 连体手术（方案1A）
<ol>
	<li>给予镇痛剂（布托啡诺，SR/缓释剂型）&#160;皮下注射0.1 mg/kg剂量的药物，在诱导后、手术操作前给药。在切开前，于侧腹部注射布比卡因（0.25%）。使用眼用润滑剂。 
	注意：联体共生手术方案可独立于胫骨骨折手术进行。</li>
	<li>所有体内缝合均使用4-0聚二氧杂环己酮缝线材料，所有体表缝合均使用4-0聚丙烯缝线材料。</li>
	<li>用剃毛器沿肘部、侧腹和膝部的连续线条剃除待连接侧的2只小鼠的毛发。用碘伏和70%酒精进行皮肤消毒，交替循环3次，为切口做准备。&#160; 
	使用已灭菌的仪器，并保持无菌区域。 
	注意：将野生型小鼠置于 eGFP 小鼠的右侧，并准备对野生型小鼠的左侧 flank 和 eGFP 小鼠的右侧 flank 进行手术（图1).</li>
	<li>在每只小鼠上使用剪刀&#160;沿侧腹壁做皮肤切口，范围从膝关节近端至肘关节近端，注意勿损伤皮肤下方的肌肉组织。</li>
	<li>用2针间断缝合连接动物的三头肌。</li>
	<li>沿侧腹壁进行7到9针的连续缝合，将腹壁组织缝合在一起。</li>
	<li>用两条间断缝线缝合动物的股四头肌。</li>
	<li>用间断缝线缝合2只连体小鼠的皮肤。</li>
	<li>让小鼠在常温空气中苏醒。</li>
	<li>为确保本方案成功实施，必须维持配对动物的健康状态：每天监测配对动物状况，每周进行两次体况评分，并每周称重两次。 
	注意：每对个体单独饲养。 
	注意：若使用普通布托啡诺（即非缓释型），则需在每只小鼠皮下注射0.1 mg/kg剂量，溶于1 mL生理盐水中，每日两次，持续3天。</li>
	<li>给予4周恢复时间，以确保在进行胫骨骨折手术时联体小鼠间建立共同血液循环。</li>
</ol>
4. 胫骨骨折手术（方案1B）
<ol>
	<li>诱导后、手术操作前给予镇痛药（皮下注射布托啡诺，0.1 mg/kg）。在切开前，于膝关节近端手术部位注射布比卡因（0.25%）。使用眼用润滑剂。&#160;</li>
	<li>剃除小鼠右侧后肢内侧的毛发以暴露手术区域，并使用碘伏加70%酒精进行皮肤消毒，交替重复3个循环。&#160;整个手术过程中保持无菌操作区域。为减少污染，使用经高压灭菌的器械和手套；在解剖显微镜下完成手术（可选）；并使用加热垫维持小鼠体温。 
	注意：若该方案用于连体小鼠模型，则每对连体小鼠中仅对其中一只进行骨折处理（右侧小鼠的右胫骨）。连体小鼠骨折示意图参见&#160;图1B&#160;。</li>
	<li>使用剪刀沿右侧小鼠右侧后肢内侧、自膝关节近端向下至胫骨中段处做皮肤切口。</li>
	<li>暴露胫骨中段，肉眼定位骨干区域。屈曲膝关节，以髌股韧带作为解剖标志，观察胫骨平台。</li>
	<li>观察髌腱；用拇指和食指手动旋转25号针头，在髓腔内钻出一个直径0.5 mm的孔。 
	注意：钻孔方向应与胫骨平行，从胫骨平台进入。</li>
	<li>将一根直径0.38 mm的不锈钢针插入孔中，深入髓腔约15 mm，直至遇到阻力，然后使用断线钳将其与胫骨平台齐平剪断（参见补充视频1中的三维重建图像）。</li>
	<li>使用直头Bonn剪刀在胫骨中段（骨干）处造成骨折。骨折示意图参见图1C。</li>
	<li>肉眼观察骨折部位及周围组织，检查骨折部位是否已稳定固定。</li>
	<li>使用皮肤钉合器闭合切口。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上恢复意识，之后放回清洁的饲养笼中。每只小鼠皮下注射1 mL预热至37 °C的生理盐水以补充液体。</li>
	<li>每日检查小鼠是否出现跛行、感染或出血等异常表现。 
	注意：若使用常规布托啡诺（非缓释型），则需每日皮下注射0.1 mg/kg，溶于1 mL生理盐水中，连续给药3天。</li>
</ol>

<ol><li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+cognitive+decline+in+the+aging+population%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Perioperative cognitive decline in the aging population.</a> Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).</li>
<li>Lord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+systemic+immune+response+to+trauma%3A+an+overview+of+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment.</a> Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).</li>
<li>Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delirium+in+elderly+people%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Delirium in elderly people.</a> Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).</li>
<li>Han, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delirium+in+the+emergency+department%3A+an+independent+predictor+of+death+within+6+months%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months.</a> Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).</li>
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<li>Harry, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+healing+of+open+tibial+fractures+covered+with+either+muscle+or+fasciocutaneous+tissue+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model.</a> J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).</li>
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<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+alpha7+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Protects+against+Neuroinflammation+after+Tibia+Fracture+and+Endotoxemia+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice.</a> Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).</li>
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<li>Degos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+bone+marrow-derived+macrophages+perturbs+the+innate+immune+response+to+surgery+and+reduces+postoperative+memory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction.</a> Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).</li>
<li>Zhang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopedic+surgery+modulates+neuropeptides+and+BDNF+expression+at+the+spinal+and+hippocampal+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).</li>
<li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+contributes+to+postoperative+cognitive+dysfunction+in+mice+undergoing+tibial+fracture+surgery+by+activating+the+TLR4%2FMyD88+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway.</a> Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+postoperative+hippocampal+inflammation+and+cognitive+decline+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice.</a> JCI Insight. 2 (7), e91229(2017).</li>
<li>Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+fear+conditioning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trace fear conditioning in mice.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+mice%3A+a+detailed+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
<li>Ning, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgicallyinduced+mouse+models+in+the+study+of+bone+regeneration%3A+Current+models+and+future+directions+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review).</a> Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).</li>
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<li>Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+systemic+GDF11+levels+reverses+age-related+dysfunction+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle.</a> Science. 344 (6184), 649-652 (2014).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+plasma+proteins+revitalize+hippocampal+function+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice.</a> Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

骨折是一种常见的临床问题，尤其在快速增长的老年群体中，仍是导致发病的主要原因之一。本文介绍了一种胫骨骨折小鼠模型的逐步操作方案，用于研究术后神经炎症和认知功能障碍的相关机制。该模型可与连体共生手术相结合，以研究神经-免疫相互作用、组织再生及其他信号传导过程。深入了解这些机制将为降低术后并发症风险和优化治疗效果提供战略性干预靶点。
已开发出多种骨科模型用于研究啮齿类动物的骨修复过程25。我们采用并改进了Harry et al.8最初描述的胫骨骨折手术，以研究骨科手术对脑功能的影响。我们还曾将该骨折模型与我们的连体共生模型结合使用，以探究负责骨愈合及年龄依赖性组织再生的相关因素。在挥发性全身麻醉下进行时，该胫骨骨折手术每只动物仅需约15分钟，死亡率极低甚至为零（具体取决于小鼠年龄及潜在的遗传易感性），并能重现长骨骨折和骨科手术创伤所常见的损伤特征。因此，该模型非常适合用于探究生物学通路及进行纵向评估。然而，关键在于截骨和内固定操作必须具有可重复性，且软组织损伤需保持一致。软组织损伤程度可通过例如剥离骨膜及夹捏周围肌肉等方式进行调节，从而使手术更具创伤性。由非固定钝性损伤或三点弯曲诱导的创伤性骨折模型则无法提供如此一致性和精确性。这些操作常导致再损伤，从而引发持续较久的炎症反应。相反，采用刚性固定的骨折模型所引起的炎症较轻，无法充分模拟骨科手术相关的组织损伤26,27。
已有其他采用钛合金钉固定的模型被开发出来，可更紧密地模拟人类关节置换术，可能更适用于在小鼠中研究假体不稳、骨溶解及假体相关并发症28,29。钻孔模型（如本文所述）可提供足够的稳定性，且小鼠可在行为学实验范式中进行测试，不会出现明显功能缺陷，从而避免对恐惧条件反射或旷场运动/焦虑测试等任务造成干扰6,7,11,15,19,20。然而，若固定未完全锁牢，可能发生旋转畸形。部分模型采用外固定架，虽可提供更优的稳定性，但在小鼠胫骨中实施较为困难，尽管其在小鼠股骨中可成功应用27。
认知功能障碍，包括谵妄和术后认知功能障碍，是骨折修复骨科手术后常见的并发症，尤其在老年和体弱患者中更为普遍30。这种具有临床相关性的胫骨骨折手术小鼠模型表明，术后全身性细胞因子释放6,7,17、血脑屏障功能受损15,19以及小胶质细胞形态改变16,22均会导致记忆障碍，并可能代表许多患者在骨科手术后出现的神经系统并发症的关键特征。需要注意的是，已有其他手术方法被用于建立小鼠术后认知功能障碍模型，包括腹部31,32,33和血管34手术，以及浅表创伤35,36。联体共生技术适用于所有这些模型，因为它们具有相似的终点指标，包括炎症反应、胶质细胞活化和行为缺陷，这些可能由共同的机制介导。
包含异种共生（parabiosis）的研究揭示了循环因子在影响老年动物认知功能、神经炎症及组织再生方面的新作用37,38,39,40,41,42。我们已证明，异种共生可成功结合本文所述的胫骨骨折模型，用于探究再生通路以及研究影响愈合与骨折修复的血液传播因子相关机制12。在此，我们证明了当老年动物与年轻动物进行血管吻合后，其骨折修复能力可被 rejuvenated（恢复活力）。这种年龄逆转现象的根源在于造血细胞在骨折部位的植入。有趣的是，通过将年轻小鼠的骨髓移植至老年小鼠体内，也可实现类似的 rejuvenation（恢复活力）效果。在这方面，骨髓移植可被视为一种比异种共生更直接且更简便的替代方法。然而，异种共生是研究循环细胞和因子功能的更为稳健的模型。我们预期，异种共生与骨科手术模型的结合将在解答围手术期护理和衰老生物学中的关键问题方面发挥重要作用。
综上所述，我们介绍了一种用于研究骨科手术后术后神经炎症及认知功能障碍机制的胫骨骨折小鼠模型的逐步操作方案。该模型可与连体共生（parabiosis）手术相结合，用于研究神经-免疫相互作用、组织再生及其他相关通路。明确这些机制将为降低术后并发症风险并优化临床预后提供战略性干预靶点。

外科手术已彻底改变了医疗保健体系，并持续推动前沿技术的发展，提升安全性，并维持患者的生活质量。然而，手术也会引发一系列病理生理反应，可能导致术后并发症，包括伤口感染、神经功能损伤，甚至死亡，尤其是在老年患者中1,2。骨科手术在临床上常规开展，尤其在老年人群中，旨在改善生活质量并修复常见的骨骼损伤。但是，65岁及以上的骨科手术患者中，高达50%会出现术后神经功能损伤，例如术后谵妄。这种情况始终与不良预后相关，i.e.，术后6个月死亡风险增加5倍、持续性功能衰退、每位患者所需的护理时间增加、住院时间延长以及入住护理机构的比例升高3,4,5。尽管已识别出一些危险因素（如高龄），但目前对手术后神经功能损伤的潜在机制仍知之甚少。
由于骨折在老年人群中极为常见，我们建立了一种胫骨骨折小鼠模型，以确定外周创伤对术后恢复的影响，包括神经炎症和脑健康（认知功能）6,7。该模型最初由Harry et al.8描述，包括在全身麻醉和镇痛条件下进行髓内钉固定和胫骨骨折，从而模拟人类常见长骨骨折及修复过程中伴随的皮肤损伤、肌肉创伤和骨修复过程。术后，小鼠表现出与人类相似的炎症标志物变化9,10，以及海马区小胶质细胞的活化，后者与陈述性记忆缺陷和海马神经可塑性下降相关6,7,11。我们此前将该骨折模型与连体共生（parabiosis）技术结合使用。连体共生是一种外科模型，通过将两只小鼠进行吻合，使其共享一个循环系统。该模型在理解循环细胞和体液因子在年龄和疾病背景下对器官功能的调控作用方面取得了突破性进展12,13,14。利用该方法，我们近期发现了与年龄依赖性骨折愈合相关的系统性因子12。
本文介绍了一种将胫骨骨折模型与连体共生（parabiosis）技术相结合的实验方案，用于研究与再生医学和神经免疫学相关的骨-脑年龄依赖性机制。方案1A描述了连体共生手术操作，方案1B详细说明了胫骨骨折建模步骤（图1A）。根据研究目的的不同，这两个方案可独立进行，也可联合使用。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>也可使用其他挥发性麻醉剂或注射麻醉剂</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals</td><td>NDC 12496-6757-1</td><td>可选，具体取决于各机构动物护理和使用委员会的建议</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td>70% 消毒用皮肤处理及清洁溶液</td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘</td><td>Dynarex</td><td></td><td>用于皮肤的消毒处理</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>低流速&amp;nbsp; 麻醉系统</td></tr><tr><td>MouseSTAT</td><td>Kent Scientific</td><td>PS1161</td><td>脉搏血氧仪 &amp;和心率监测器</td></tr><tr><td>沙弗</td><td>Wahl</td><td>9854L</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>精细科学工具</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 - #11</td><td>精细科学工具</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Adson 镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11006-12</td><td>用于剥离骨膜</td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>精细科学工具</td><td>11066-07</td><td>有用（1x2 齿）以引起局部肌肉/软组织损伤</td></tr><tr><td>波恩剪刀（直型）</td><td>精细科学工具</td><td>14084-08</td><td>适用于截骨，注意定期更换，以免变钝</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>14058-09</td><td>用于剪断缝线的锐利剪刀</td></tr><tr><td>22G × 3.5 英寸 Quincke&amp;nbsp; 脊髓穿刺针</td><td>BD</td><td>405181</td><td>使用内杆进行固定</td></tr><tr><td>持针器</td><td>精细科学工具</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>缝合</td><td>观察</td><td>1079B</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>杰克逊实验室</td><td>&amp;nbsp;货号 000664</td><td></td></tr><tr><td>eGFP+（泛素性表达增强型绿色荧光蛋白）</td><td>杰克逊实验室</td><td>&amp;nbsp;货号 003291</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究术后认知功能障碍与组织再生的骨科手术小鼠模型

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

手术常用于改善和维持生活质量。然而，对于老年等脆弱人群，术后可能出现并发症，显著影响治疗效果。事实上，在接受常规骨科手术治疗骨折后，高达50%的老年患者会出现谵妄等神经系统并发症。此外，随着年龄增长，术后组织愈合与再生能力下降，可能影响骨折修复质量，甚至影响植入物的骨整合。因此，深入理解驱动这些年龄相关变化的机制，有助于确定可干预的关键靶点，以降低并发症风险并优化治疗结局。本文介绍一种具有临床相关性的胫骨骨折小鼠模型。这些小鼠术后的变化模拟了人类接受常规骨科手术后常见的部分认知功能障碍。简言之，在严格无菌条件下对小鼠右后肢进行切口，分离肌肉组织，将一根直径0.38 mm的不锈钢针插入胫骨上嵴的髓腔内。随后进行截骨操作，并用缝合钉关闭伤口。我们已利用该模型研究手术创伤对术后神经炎症及行为学改变的影响。通过将该骨折模型与连体共生（parabiosis）技术结合——一种将两只小鼠外科吻合的模型——我们研究了在损伤后能够系统性地恢复器官功能和组织再生的细胞及分泌因子。遵循本逐步操作方案，可高保真地复制这些模型，并可用于探究手术创伤所影响的多种生物学通路。

在无菌条件下进行横断截骨术，稳定插入钢针并妥善缝合后，小鼠术后左后肢未出现跛行、感染或出血等异常表现。通过番红O染色后的放射学分析和组织形态学测量评估骨科愈合情况（图2）。胫骨中段骨折部位的X线影像显示，年轻小鼠骨折愈合组织中的组织沉积量多于老年小鼠。将骨折愈合组织脱钙后包埋于石蜡中，用于组织学分析。切片经番红O染色，并通过组织形态学分析对组织沉积进行定量。结果显示，年轻小鼠的骨折愈合组织中骨组织含量更高，纤维化组织更少，而老年小鼠的愈合组织则相反。
胫骨骨折会引发全身性和中枢性炎症6,7,11,15,16。事实上，在小鼠和人类中，骨科手术后外周促炎性细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs）的水平会迅速升高7,17,18。这通过体液、细胞和神经通路相关的多种信号机制，促进脑内小胶质细胞的活化7,15,19,20,21。手术后，内皮功能障碍、血脑屏障开放以及外周巨噬细胞浸润共同导致野生型和Ccr2RFP/+ Cx3cr1GFP/+成年小鼠急性海马神经炎症15,19，并与随后出现的记忆功能障碍相关，该功能障碍类似于人类的谵妄和术后认知功能障碍15,19,22。在老年动物中，这种神经炎症反应加剧，并可通过IBA-1免疫染色观察到小胶质细胞形态的显著改变（图3）。
利用此处描述的胫骨骨折模型，我们还发现海马神经发生出现短暂性受损，表现为齿状回中双皮质素（DCX）免疫染色减少20。对长时程增强（LTP）的电生理测量——作为记忆功能的替代指标——显示术后神经可塑性存在时间依赖性的破坏11。术后小鼠还表现出海马依赖性记忆功能的损害，例如通过恐惧条件反射行为评估（图4）。在恐惧条件反射实验中，将小鼠置于一个腔室中，先给予听觉刺激，随后施加厌恶刺激（即，足部电击）。胫骨手术三天后，将小鼠再次放入条件反射腔室，但此次不给予任何听觉或厌恶刺激，记录其僵直行为作为记忆的指标（详细方案见23）。
高龄是记忆衰退的关键风险因素。然而，随着年龄增长，组织修复与再生能力也随之下降，尽管这些机制目前仍不甚清楚。因此，我们采用本文所述的方案进行异时异种共生（将年轻与年老动物配对），并评估了年老小鼠的骨折愈合情况（详细的异种共生方案参见24）。已确认异种共生配对动物之间的血液共享且程度相当12。暴露于年轻循环系统可增强骨修复，表现为更早愈合、骨沉积增加以及纤维化减少（图5）12。这种骨再生的 rejuvenation（恢复活力）现象并不依赖于内源性的骨钙素阳性成骨细胞（图5，棕色细胞），而是依赖于从年轻共生体迁移而来的CD45阳性细胞（图5，蓝色细胞）。这些结果表明，CD45阳性造血细胞分泌出一种年轻而健康的微环境，能够向年老的成骨细胞发出信号，促使其活性增强。
<img alt="显示小鼠胫骨骨折模型中异种共生手术方案的示意图；实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：异种共生与胫骨骨折手术的示意图。（A）进行异种共生和胫骨骨折（方案1A）或仅进行胫骨骨折（方案1B）的时间线。（B）同龄或异龄异种共生配对中20月龄小鼠的胫骨发生骨折（右侧小鼠的右腿发生骨折，以X表示）。灰色小鼠代表野生型小鼠，绿色小鼠代表eGFP小鼠。（C）采用髓内钉固定和骨干中段骨折的小鼠胫骨骨折模型示意图。另请参见补充视频1，了解后肢及胫骨钉固定的三维重建。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="年龄相关的骨组织分析：显示骨、软骨和纤维组织比较的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：年轻与老年小鼠模型中的胫骨骨折愈合。 对年轻或老年小鼠的胫骨进行骨折处理，并在损伤后21天检测骨折愈合组织。（A）采用放射影像学和组织学染色（番红O染色）方法评估骨折后21天的骨折愈合组织。染色结果显示胶原组织呈蓝色，软骨中含有的蛋白聚糖呈红色。虚线表示骨折愈合组织的大致位置。（B）通过组织形态计量学分析评估骨折后21天骨折愈合组织中骨、软骨和纤维化组织的沉积量。数据以均值±95%置信区间表示，*P&lt;0.05，具有统计学显著性（单因素方差分析，Dunnett检验）；比例尺代表2 mm；图像使用显微镜以1.25倍物镜获取。每组样本数n = 9。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="海马体中IBA-1在小胶质细胞中的表达；免疫荧光图像；假手术组，年轻组，老年组；胫骨骨折" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：手术诱导海马体中年龄依赖性的小胶质细胞活化。 与4月龄C57BL6/J小鼠相比，胫骨骨折手术在老年小鼠（20月龄）中引起更显著的海马体神经炎症。术后24小时，通过小胶质细胞标志物IBA-1对脑切片进行染色，结果显示手术组中小胶质细胞阳性细胞数量增多且形态发生改变。图像使用100倍放大倍率的落射荧光显微镜获取；比例尺代表10 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="海马体中DCX/DAPI表达、fEPSP斜率图、% freezing柱状图；胫骨骨折研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：胫骨骨折手术后神经发生、长时程增强作用及记忆功能受损。（A）神经发生的定量标志物DCX在术后24小时海马齿状回中的表达显著降低。图像采用10倍放大倍数的共聚焦激光扫描显微镜物镜获取；比例尺代表10 µm。（B）对照组小鼠与术后24小时小鼠海马脑片的电生理记录。通过高频刺激（HFS）诱导长时程增强（LTP），并持续记录1小时。使用充满标准人工脑脊液的细胞外记录电极，从CA1区辐射层记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）。术后24小时，与对照组小鼠相比，LTP的诱导明显减弱。数据以均值±标准误表示，n = 3，* p &lt; 0.05，单因素方差分析。（C）依赖海马的记忆功能（通过痕迹恐惧条件反射定义为“冻结百分比”）在术后小鼠中较对照组及仅接受麻醉的小鼠显著受损。数据以均值±标准误表示，n = 9–10，* p &lt; 0.05，单因素方差分析。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="骨分析：（a）X射线图像，（b）荧光细胞染色，（c）染色组织学切片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：异种共生手术促进骨折愈合的 rejuvenation、血液共享及供体细胞植入。 建立同龄和异龄异体共生配对，对每对中的老龄小鼠进行骨折处理，并评估其骨愈合情况。A) 采用放射影像学方法检测骨折愈合组织。虚线表示骨折愈合组织的大致位置。B) 通过骨髓检测证实了 eGFP+ 细胞的植入。C骨折愈合组织的免疫组织化学染色用于鉴定 eGFP+ 供体细胞（蓝色）和骨钙素+ 来自异种共生体的成骨细胞（棕色）。比例尺表示 50 µm 使用40倍物镜获取图像。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充视频 1：后肢的三维重建及胫骨固定。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/parte_slow.wmv">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种用于研究术后神经炎症和行为变化机制的骨科手术小鼠模型，当与连体共生技术结合时，还可用于研究衰老过程中的组织再生。

手术常用于改善和维持生活质量。然而，对于老年人等脆弱患者，可能会发生并发症，并……

这些手术方法的总体目标是观察创伤对多器官功能障碍的影响，具体而言，将采用异种共生技术将一只年轻小鼠与一只年老小鼠连接在一起，使其共享血液循环系统。在此模型中，其中一只小鼠将被制造骨折，以观察其再生效应以及对认知功能的影响，进而研究年轻与年老小鼠在共享循环系统下的相互作用。这些方法有助于回答免疫学、衰老、组织再生以及认知功能等领域的关键科学问题。骨科手术的主要优势在于这些研究结果在临床上可应用于术后常见并发症，例如谵妄和术后认知功能障碍。实验前，将小鼠饲养在具有12小时光照与12小时黑暗循环的空调环境中，并确保其能够正常获取标准食物和饮水。每笼饲养不超过五只同窝小鼠，并避免可能诱发争斗的饲养条件。使用一只3月龄的雌性小鼠和一只17月龄的老年小鼠。进行异种共生手术前，将两只小鼠共同饲养至少两周以适应环境。每天检查小鼠的身体状况和整体外观。手术准备时，称量两只小鼠的体重。给予全身麻醉后，将小鼠仰卧位放置于加热垫上。最后，维持每只小鼠适当的麻醉深度。接下来，沿将要连接的一侧从肘部、体侧到膝盖的连续线剃除两只小鼠的毛发。使用碘伏加70%酒精对皮肤进行消毒，交替重复三次，为切口做准备。在麻醉诱导后、手术操作前，首先给予镇痛处理。在切开前，于小鼠两侧 flank 处注射 0.25% 布比卡因。每只小鼠使用手术刀沿 flank 从近膝部至肘部近端做皮肤切口，注意不损伤皮肤下方的肌肉。用两个间断缝合线将动物的肱三头肌缝合连接。然后用连续锁边缝合法，沿两侧体壁进行7到9针缝合。接着，用两针间断缝合将动物的股四头肌缝合，并用间断缝合法闭合两只连体小鼠的皮肤。在小鼠俯卧位时完成间断缝合。让小鼠在室温空气中苏醒。将每对小鼠单独饲养，并确保每天进行监测，每周进行两次体况评分，并每周称重两次。最后，给予四周的恢复时间，以确保在进行胫骨骨折手术时，连体小鼠之间实现血液循环共享。接下来，剃除小鼠右后肢内侧的毛发以暴露手术区域，并使用碘伏与70%酒精皮肤擦拭进行三次交替消毒。在麻醉诱导后、手术操作前，开始给予镇痛处理。在切口前，于膝关节近端手术部位注射0.25%布比卡因。在整个手术过程中使用经高压灭菌的器械以维持无菌手术区域。用剪刀在右侧后肢膝关节近端沿内侧做切口，延伸至左侧小鼠胫骨中段。暴露胫骨中段并肉眼定位骨干部分。屈曲膝关节，以髌股韧带作为解剖标志观察胫骨平台。观察髌腱，然后用手指和拇指做滚动动作，使用25号针头在髓腔内手动钻孔。接下来，将一根直径0.38毫米的不锈钢针从孔中插入，深入髓腔约15毫米，直至遇到阻力，然后使用钢丝钳沿胫骨平台剪断软组织。随后使用直头组织剪在胫骨中段处折断骨骼。肉眼观察骨折部位及周围组织，检查骨折部位是否已稳定固定。然后使用皮肤钉合器闭合皮肤。最后，每只小鼠皮下注射1毫升预热至37摄氏度的生理盐水，以补充液体。将小鼠置于加热垫上恢复，之后放回清洁的饲养笼中。每天检查小鼠是否出现跛行、感染或出血的迹象。胫骨中段骨折的X光片显示，年轻小鼠骨折愈合组织中的组织沉积多于年老小鼠的骨折愈合组织。此外，年轻小鼠的骨折愈合组织中骨组织更多，纤维化组织更少，而年老小鼠的骨折愈合组织则相反。与4月龄小鼠相比，20月龄老年小鼠在胫骨骨折手术后出现更显著的海马区神经炎症。此外，手术后的小鼠还表现出海马依赖性记忆功能受损，例如在恐惧条件反射行为评估中所观察到的表现。暴露于年轻循环系统可促进骨修复，表现为更早的骨愈合、增加的骨沉积以及减少的纤维化。这种骨再生的 rejuvenation 与内源性骨钙素阳性成骨细胞无关，而是依赖于从年轻共联体迁移而来的 CD45 阳性细胞。一旦掌握，异种共生技术可在 1.5 小时内完成，而胫骨骨折模型可在 15 分钟内完成。如有需要，这两种操作也可独立进行。在进行胫骨骨折手术操作时，重要的是要保持无菌的手术区域，并确保钢针放置位置正确以及截骨操作准确。最后，务必在整个研究过程中密切监测小鼠的状况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何实施联体共生模型及胫骨骨折手术。

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