地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植 关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本实验的总体目标是建立一种大眼动物的地理样萎缩模型，将人胚胎来源的视网膜色素上皮细胞移植到眼内，并利用光学相干断层扫描评估供体细胞的整合情况。该方法有助于回答再生医学领域的一些关键问题，例如基于干细胞的退行性疾病治疗。该手术方案的主要优势在于可获得无限量的健康细胞，并且其视网膜下注射的手术操作与拟用于患者的临床操作具有高度相似性。

该技术的应用前景包括通过展示由人胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞，用于治疗年龄相关性黄斑变性。我们的动物技术员 Monica Aronsson 正固定住兔子，以便我们能够通过光学相干断层扫描观察和成像视网膜。根据文本方案将兔子麻醉后，将其置于手术显微镜下，头部朝向术者。

然后，使用开睑器移除眼睑，并用无菌纱布去除瞬膜。进行显微手术时，采用双通道或可选的三通道25G经玻璃体平坦部技术，使用无瓣膜套管插入显微手术器械。多功能玻璃体切除仪设有连接灌注套管、内照明、玻璃体切割头和内界膜激光仪的接口。

对于视网膜下注射，仅需内照明，因此双通道装置已足够。使用取核钳夹住并移开结膜，标记插入位置。从角膜缘起，距其1至2毫米处，以与角膜缘平行的30至45度角，经巩膜插入两个上方套管针中的一个。

继续将套管插入至其尖端的中点位置，随后将套管旋转90度并推进入眼内，方向对准后极部。此操作可防止术后经巩膜切口发生渗漏，并降低眼内炎的风险。

对第二个上方套管针重复上述操作。插入套管针时，应距离角膜缘1至2毫米，以建立隧道式插入路径，并朝向眼后极部，从而最大限度降低感染、玻璃体出血、视网膜脱离以及接触晶状体的风险。在角膜上涂抹人工泪液作为接触凝胶，然后将一次性平接触镜置于角膜上，以清晰观察视网膜。

接下来，将500 µL高碘酸钠滴入连接延伸管的一毫升注射器中，延伸管由助手操作，而38号聚酯尖端套管由外科医生操作。将内照明探头经左上方套管插入。然后，将注射套管经右上方套管插入，并穿过玻璃体腔向视网膜方向推进，目标位置为视神经乳头下方区域。

缓慢使套管尖端接触视网膜，直至出现局部变白现象。切勿让套管刺入视网膜，以免引起出血。现在，用针头刺入视网膜，在五秒时间内向视网膜下注射50 µL碘酸钠溶液。

由于视网膜与下方脉络膜之间存在天然的裂隙平面，注射过程中应逐渐形成一个清晰可见的半透明隆起。注射时缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于隆起内，以尽量减少反流。取出内照明装置和注射套管后，使用取核钳移除套管针。

然后使用吸头或镊子的钝端，对软性密封的无缝线巩膜切口施加轻柔压力，持续三十秒。在恢复期间，按照文本方案护理动物，并等待七天以进行移植。在注射碘酸钠七天后，以及根据文本方案玻璃体内注射曲安奈德后，从24孔板中完全融合的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮（hESC-RPE）单层细胞中移除细胞分化培养基，并用五百微升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗每个孔。

消化细胞后，倾斜培养板并小心吸除胰蛋白酶，使细胞仍附着在培养板上。用八百微升新鲜的、预热至三十七摄氏度的分化培养基，通过轻柔吹打或必要时轻轻刮取，收集细胞以获得单细胞悬液。使用0.2%台盼蓝，按照制造商说明书，用血细胞计数板对细胞进行计数。

然后向细胞悬液中加入5 mL分化培养基，在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜过滤除菌的PBS中，终浓度为每微升1000个细胞。将上述细胞悬液分装为每份600 µL，分装后置于冰上，直至手术及手术过程中使用。

按照文本方案对兔子进行麻醉并散瞳后，将兔子头部朝向外科医生放置。使用眼睑拉钩拉开眼睑，并用无菌布去除瞬膜。进行显微手术时，采用双通道或可选的三通道25号经玻璃体 pars plana 技术，套管插入的位置应如本视频前面所示相同。

若先前的巩膜切口可见，则应将套管穿刺位置选择在紧邻但不穿过这些切口的位置，以尽量降低术后渗漏的风险。同前法将人工泪液滴于眼球表面，并在角膜表面的溶液上放置一次性平面接触镜，以观察视网膜。将注射针头准确定位后，对准经碘酸钠预处理区域的中心（该区域具有特征性的金属样内照明反射），向视网膜下腔缓慢注射50 µL轻柔混匀的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）悬液。

神经感觉层视网膜应易于分离，形成清晰可见的隆起。注射过程中，缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于隆起内，以最大限度减少反流。取出内照明装置和注射套管后，使用取核钳移除套管针，再用镊子的钝端如前所述轻压30秒。

根据制造商的说明，使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）设备及其配套软件，获取经处理动物的横截面B扫描图像。将麻醉且瞳孔散大的动物置于可调节的固定装置中，以确保仪器光源与兔视网膜之间具有无障碍的光路。为避免图像模糊，每隔30至60秒使用局部生理盐水冲洗角膜，以保持其湿润。

获取至少三次OCT扫描，同时结合红外共焦扫描激光检眼镜或共焦SLO反射图像，以分别代表注射区域的上部、中央和下部。使用共焦SLO的蓝光、绿光、红外光及多色激光反射，获取多个同步激光颜色的 en-face 视网膜图像。利用SD-OCT设备的蓝光激光功能，采集蓝光自发荧光图像。

此处展示了正常白化兔视网膜的BAF、IR-cSLO和SD-OCT代表性活体图像。SD-OCT图像的放大图显示了SD-OCT仪器捕获的不同视网膜层各自特有的光反射水平。如该SD-OCT图像所示，在注射50 µL 1毫摩尔碘酸钠溶液三个月后，形成一个水泡样隆起，随后该隆起逐渐消退并导致外层视网膜进行性退化。

在SD-OCT中可观察到最外层神经视网膜变薄以及低自发荧光（hypo-BAF）区域，对应于视网膜色素上皮（RPE）的丢失，从而重现了类似地理样萎缩（GA）的表型。在确定损伤区域后，重新注射5万个hESC-RPE细胞进行移植，形成第二个隆起并随后消退。损伤区域边缘可见轻度至中度的高自发荧光（hyper-BAF）区域，局部hyper-BAF信号增强，提示内源性RPE处于慢性应激状态。

作为对照，展示了未经预处理的眼睛注射hESC-RPE后形成的泡状结构，MC图像中可见色素细胞斑块，SD-OCT扫描显示视网膜结构保存良好。掌握这种较为成熟的临床视网膜下注射技术，将有助于推动基于细胞治疗的临床移植，用于治疗年龄相关性黄斑变性等疾病。观看本视频后，您应能够充分理解如何在活体模型中实施视网膜下注射，如何准备用于视网膜下注射的人胚胎干细胞来源的细胞，以及如何利用光学相干断层扫描技术观察供体细胞的整合情况。