Name: 人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞移植视网膜大眼模型的地理萎缩 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 了解人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞移植技术，用于视网膜地理萎缩的大眼模型研究。该方法通过光学相干断层扫描评估细胞整合，为年龄相关性黄斑变性的再生医学治疗提供新思路。

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本研究得到了卡罗林斯卡学院、玛格丽特王储妃盲人基金会、埃德温·乔丹眼科研究基金会、瑞典眼科基金会、古斯塔夫五世国王基金会、ARMEC 林德伯格基金会和克朗奎斯特基金会的资助。

以下方案遵循卡罗林斯卡学院的动物护理指南。所有使用新西兰白兔（材料表）的动物实验均已获得地区动物伦理委员会（Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd）批准（许可号：dnr 56/15）。使用人胚胎干细胞（hESC）（许可号：dnr 2011/745-31/3）以及人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）的移植与操作（许可号：dnr 2013/813-31/2）也符合瑞典法律法规及卡罗林斯卡学院的相关规定，并已获得地区人类伦理委员会（Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm）的批准。
1. 向大眼动物模型中进行玻璃体下注射碘酸钠（NaIO3）
<ol>
	<li>通过在大腿肌肉注射麻醉剂混合物使动物麻醉&#160;使用30 G注射器将氯化钠溶液中的35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪注射至动物体内，并使用含0.75%环戊通和2.5%去氧肾上腺素的眼药水进行点眼以扩大瞳孔。若动物后肢受到强力夹捏时不产生反应，则表明麻醉已达到适当深度。</li>
	<li>将兔子置于手术显微镜下，使其头部朝向术者（图1A）。使用开睑器并用无菌纱布去除眼睑和瞬膜，以尽量降低污染风险。在麻醉状态下，使用平衡盐溶液（BSS）滴眼，防止双眼干燥。</li>
	<li>采用2通道（或可选3通道）25G经玻璃体平坦部技术，使用无阀套管插入显微外科器械进行显微手术图1B）。多功能玻璃体切除仪配有连接灌注套管、眼内照明、玻璃体切割头和眼内激光的接口。进行视网膜下注射时，仅需使用眼内照明，因此采用双通道装置即可。将眼内照明经左上方套管插入，右上方套管用于插入视网膜下注射套管。
	<ol>
		<li>对于三通道手术设置，使用下侧颞部套管针置入BSS灌注套管。若使用可选器械（如玻璃体切除仪），则通过右上方套管针插入。</li>
		<li>使用有齿镊夹住并移开覆盖在穿刺部位上方的结膜，从角膜缘上方1-2 mm处插入上方的两个套管针。</li>
		<li>确保套管针以与角膜缘平行的30–45°角经巩膜插入，进针至套管针尖端中点位置。随后将套管针旋转90°并推进入眼内，方向对准眼球后极。该操作可避免术后巩膜切口渗漏，并降低眼内炎风险。即， 眼部细菌感染）。另见 图2B 用于套管针位置。</li>
		<li>将一次性平接触镜置于角膜上以观察视网膜，眼与接触镜之间使用人工泪液作为接触凝胶图1A).</li>
		<li>吸取 500 µL NaIO₄ 溶液3 连接至延长管（由助手操作）和38G聚酰胺尖端套管针（由外科医生操作）的1 mL注射器中。</li>
		<li>通过左上方套管插入眼内照明探头，通过右上方套管插入注射导管，并将导管经玻璃体腔向前推进至视网膜，目标位置为视盘下方区域。</li>
		<li>让套管针尖端缓慢接触视网膜，直至出现局部变白现象。注射过程本身将穿透视网膜，实现视网膜下给药。切勿让套管针刺入视网膜，以免引起出血。</li>
		<li>注入 50 µL NaIO3 在5秒内将液体缓慢注射至视网膜下腔。由于视网膜与下方脉络膜之间存在天然的解剖分离平面，注射过程中应逐渐形成一个清晰可见的半透明隆起。</li>
		<li>注射过程中应缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于皮丘内，以尽量减少反流。</li>
		<li>移除内照明装置和注射套管后，使用带齿镊子取出套管鞘，并用镊子尖端或钝端对可自行封闭的无缝线巩膜切口施加轻压30秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后给予10&#160;皮下注射生理盐水以防止脱水。&#160;不要给予&#160;术后&#160;局部用类固醇或抗生素。&#160;术后以及术后次日，皮下注射0.5 mL浓度为0.3 mg/mL的丁丙诺啡作为镇痛剂。</li>
	<li>使用后，将所有器械依次浸入70%乙醇、45%乙醇和蒸馏水中，每步数秒。随后用纸巾彻底擦干。</li>
	<li>观察动物直至其恢复足够的意识，并将它们全部单独关养。如有需要（例如，用于免疫组织化学目的），通过静脉注射 100 mg/kg 戊巴比妥麻醉动物（参见 材料表).</li>
	<li>等待7天后，再进行hESC-RPE细胞的移植。</li>
</ol>
2. 在经处理的动物中进行hESC-RPE细胞的视网膜下移植
<ol>
	<li>在移植 hESC-RPE 前 1 周，对麻醉动物使用 30 号注射针头，在下颞象限距角膜缘 1-2 mm 处注入 2 mg（100 µL）玻璃体内曲安奈德，此后每 3 个月重复给药一次。注射时针尖应朝向眼球后极，以避免接触晶状体。</li>
	<li>按照先前所述方法培养hESC-RPE单层细胞1.</li>
	<li>去除细胞分化培养基（参见 材料表24 孔板中汇合的 hESC-RPE 单层细胞的孔中加入 500 µL PBS（不含 Ca）洗涤每孔2+ 和 Mg2+重复此操作一次，共计洗涤2次。</li>
	<li>弃去上清液，每孔加入 500 µL 胰蛋白酶，于 37 °C 培育 12 分钟。</li>
	<li>倾斜培养板，小心吸除胰蛋白酶（细胞应仍附着在培养板上）。加入800 µL新鲜的、37 °C预热的分化培养基，轻轻吹打混悬细胞，必要时可刮取，以获得单细胞悬液。 
	注意：若观察到细胞团块，应使用40 µm细胞滤网。</li>
	<li>使用0.2%台盼蓝，按照制造商说明书在血细胞计数板中对细胞进行计数。</li>
	<li>加入5 mL分化培养基，室温下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜过滤除菌的PBS（经25 mm注射器滤器过滤）中，调整细胞终浓度为1,000个细胞/µL。</li>
	<li>将之前的细胞悬液分装成每份600 µL，置于冰上保存，直至手术期间并保持在冰上。</li>
	<li>通过在大腿肌肉注射麻醉剂混合物使动物麻醉&#160;使用30 G注射器将氯化钠溶液中的35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪注射给药。使用0.75%环戊通和2.5%去氧肾上腺素的混合滴眼液进行瞳孔扩张。若动物后肢受到强力夹捏时无反应，则表明麻醉效果适当。</li>
	<li>将兔子置于头朝向术者的位置。使用开睑器并用无菌布去除眼睑和瞬膜，以尽量降低污染风险。在麻醉期间，使用BSS保持双眼湿润，防止干燥。</li>
	<li>进行显微手术时，采用双通道（或可选三通道）25G经玻璃体平坦部技术，套管针的位置应与步骤1.3中所述位置相同，并 图2若先前的巩膜切口可见，则应在紧邻但不穿过这些切口的位置进行套管插入，以尽量降低术后渗漏的风险。
	<ol>
		<li>将一次性平接触镜置于角膜上以观察视网膜，使用人工泪液作为眼球与接触镜之间的接触凝胶图1A).</li>
		<li>在正确放置针头后（参见步骤 1.3.5 和 1.3.6），将 50 µL 轻柔混匀的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞悬液（50,000 个细胞）注射至视网膜下腔。注射位置应以 NaIO₃ 处理区域的中心为目标。3 经预处理区域，其特征可辨 &#34;金属的&#34; 内照反射。神经感觉层视网膜应易于分离，形成清晰可见的视网膜下隆起。用无菌 H 冲洗针头2在兔子之间/使用后，用O冲洗以避免因细胞团块导致针头堵塞。一旦发现堵塞，立即更换针头。</li>
		<li>注射过程中，缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于皮丘内，以最大限度减少反流。</li>
		<li>移除内照明器和注射套管后，使用带爪镊子取出套管针，并用镊子尖端或钝端对无需缝合的自封闭巩膜切口施加轻柔压力，持续30秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后给予10&#160;皮下注射生理盐水以防止脱水。&#160;不要给予&#160;术后&#160;局部类固醇或抗生素。&#160;术后以及术后次日，皮下注射0.5 mL浓度为0.3 mg/mL的丁丙诺啡作为镇痛剂。</li>
	<li>使用后，将所有器械依次浸入70%乙醇、45%乙醇和蒸馏水中，每种液体中浸泡数秒。随后用纸巾彻底擦干。</li>
	<li>在动物恢复足够意识前持续看护，并将它们单独关养。如需（例如 为免疫组织化学目的，通过静脉注射100 mg/kg戊巴比妥处死动物。</li>
</ol>
3. 在体 内 视网膜及视网膜下成像
<ol>
	<li>使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）设备及其配套软件（见材料表），按照制造商说明获取经处理动物的横截面b-scan图像。为避免图像模糊，需每隔30-60秒用表面生理盐水冲洗角膜，以保持其湿润。
	<ol>
		<li>将已麻醉且瞳孔散大的动物（参见步骤1.1和2.10）置于可调节的固定装置中，以确保仪器光源至兔视网膜之间具有无障碍的光路。</li>
		<li>获取至少3次OCT扫描，同时采集注射区域上部、中部和下部的红外共焦扫描激光眼底显微镜（IR-cSLO）反射参考图像。</li>
		<li>使用cSLO蓝光、绿光、红外光及多色激光反射获取眼底表面图像（即，多种同时使用的激光颜色）</li>
		<li>使用SD-OCT设备的蓝光激光功能采集蓝光自发荧光（BAF）图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

所有作者均无竞争利益或利益冲突。

在此方案中，大眼型地理萎缩模型的建立及其用于评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞整合的临床前研究 体内 被描述。
为了将再生疗法在GA及相关疾病中的临床转化7，开发并优化能够真实反映临床移植和影像学检查方法的技术至关重要。在这方面，兔子具有吸引力：其眼睛相对较大，可进行眼内手术并使用标准成像设备，且与其他大眼动物相比，价格低廉且易于饲养。
我们描述了采用标准的经玻璃体25号套管玻璃体切除术技术，以形成视网膜下隆起（sub-retinal blebs），用于诱导视网膜下损伤或移植hESC-RPE。最初，我们采用三通道设置，如图1B所示，原计划在手术过程中进行玻璃体切除时使用灌注通道（套管）。然而，由于我们发现实施视网膜下注射时无需进行玻璃体切除，因此已省略灌注通道。尽管如此，若将来进一步调整操作流程并需要进行玻璃体切除时，仍应保留第三个通道的选项。
<p class="jove_content...

本方案描述了一种用于评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）在视网膜下腔移植后整合情况的大眼非临床地理样萎缩（geographic atrophy, GA）模型的建立方法。此处详述的技术已在最近发表的3篇论文中应用，证明了可从人胚胎干细胞高效生成富集、纯化且具有功能的RPE细胞群体。1，以及通过视网膜下注射生理盐溶液诱导产生外层视网膜损伤和类似地理性萎缩（GA）的表型即，BSS 和 PBS）或 NaIO₄3 在兔眼中2,3我们进一步证明，人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮（hESC-RPE）的视网膜下悬浮移植可形成广泛的功能性单层结构，并具有光感受器保护能力2.
使用兔眼构建地理性萎缩（GA）疾病模型具有多项优势。首先，兔眼的体积约为成人眼球体积的70%，可实现具有临床意义的细胞移植，且所需细胞密度远低于常规小鼠等小型啮齿类动物实验中所用的密度（1,000个细胞/µL）。 与 50,000 个细胞/µL4,5其次，啮齿类动物的手术通常经巩膜通过脉络膜进行，这会破坏视网膜屏障，可能引发炎症反应及潜在的排斥反应6这两个因素共同作用可能导致移植细胞出现多层堆积和聚集，从而使得移植细胞在受损的原生视网膜组织中整体整合效果较差。然而，大眼兔模型允许使用与临床环境完全相同的手术器械进行操作。第三，大眼模型还能够实现高分辨率成像 体内 随时间对移植细胞及其上方视网膜进行成像与监测1,2,3因此，我们描述了一种具有临床相关性且成本效益高的临床前模型，对于任何致力于正常及病变视网膜和视网膜下腔研究的研究人员而言，该模型应是一种颇具吸引力的啮齿类动物替代方案。

<table><tbody><tr><td>NutriStem hESC XF 分化培养基 &amp;ndash;bFGF 和 &amp;ndash;TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 PBS</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网 40 &amp;mu;m 尼龙</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>针头 30 G 0.5&amp;rsquo;&amp;rsquo;；0.3 mm × 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm 注射器滤器</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>使用浓度为 0.2%</td></tr><tr><td>NaIO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮，100 mg/mL</td><td>Intervet, Boxmeer</td><td>511519</td><td>使用剂量为 35 mg/kg 氯胺酮</td></tr><tr><td>Rompun vet，20 mg/mL</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>使用剂量为 5 mg/kg 赛拉嗪</td></tr><tr><td>Triescence，40 mg/mL</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>412915</td><td>玻璃体内注射 2 mg</td></tr><tr><td>环戊醇苯肾滴眼液，0.75% + 2.5%</td><td>APL</td><td>321968</td><td>每眼使用 1 滴</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Laboratoires Th&amp;eacute;a</td><td>597562</td><td></td></tr><tr><td>局部生理盐水</td><td>Apotea AB</td><td>7053249369080</td><td></td></tr><tr><td>Allfatal vet.，100 mg/mL</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>使用 100 mg/mL 戊巴比妥钠</td></tr><tr><td>延长管（Hammer）</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G 多尖端视网膜下套管</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>一次性平光镜</td><td>Volk</td><td>#VWFD10</td><td></td></tr><tr><td>Barraquer Colibri 眼睑牵开器</td><td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>无阀套管针</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>爪状镊</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS 玻璃体切除仪</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Accurus 25+ 规格玻璃体切除 TotalL Plus 套件</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT 设备</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+OCT</td><td>使用 Heidelberg Eye Explorer 版本 1.9.10.0</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 血细胞计数板</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>新西兰白兔</td><td>Lidk&amp;ouml;pings Rabbit Farm, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hESC-RPE 细胞</td><td></td><td></td><td>参见参考文献编号 &lt;sup class=&quot;xref">1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet，0.3 mg/mL</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>皮下注射 0.5 mL 布托啡诺</td></tr></tbody></table>

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

地理性萎缩（GA）是干性年龄相关性黄斑变性的晚期阶段，其特征是视网膜色素上皮（RPE）层的丧失，进而导致视网膜重要结构的继发性退化例如，光感受器）导致严重的视力损害。同样，在接受玻璃体内抗血管内皮生长因子（VEGF）治疗的晚期湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）患者的长期随访中，也观察到视网膜色素上皮（RPE）的丧失以及视力下降。因此，一方面，从无限来源高效地获得可用于替代治疗的RPE细胞至关重要；另一方面，重要的是在一种接近人类临床应用的手术和成像方法的疾病模型中，评估所获得细胞的行为及其整合能力。本文基于我们先前发表的研究，提供了一项详细方案，描述了利用白化兔眼建立地理性萎缩（GA）的临床前模型，用于在具有临床相关性的环境中评估人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）。将已分化的hESC-RPE移植至未经处理的眼睛或经NaIO₃处理诱导RPE损伤的眼睛中3采用25G经玻璃体平坦部技术诱导类似GA的视网膜变性。通过多模态高分辨率无创实时成像对变性区域及移植区域进行评估。

代表性 体内 正常白化兔视网膜的BAF、IR-cSLO和SD-OCT图像如图所示 图2注意SD-OCT仪器捕获的不同视网膜层及其特有的光反射水平。
在图1A和图1B中，展示了创建视网膜下隆起的操作装置：放置眼睑拉钩以牵开眼睑，便于插入3个套管穿刺针（图1B），穿刺位置位于距角膜缘1-2 mm处，以避免接触晶状体，穿刺角度与角膜缘呈30-45˚平行方向。这些套管可用于插入可选的灌注导管，以及导光纤维和经巩膜注射针。在手术过程中，散大的瞳孔配合平接触镜可便于观察眼底及视网膜下间隙。
...

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。

地理性萎缩（geographic atrophy, GA）是干性年龄相关性黄斑变性的晚期阶段，其特征为视网膜色素上皮（RPE）层的丧失，……

本实验的总体目标是建立一种大眼动物的地理样萎缩模型，将人胚胎来源的视网膜色素上皮细胞移植到眼内，并利用光学相干断层扫描评估供体细胞的整合情况。该方法有助于回答再生医学领域的一些关键问题，例如基于干细胞的退行性疾病治疗。该手术方案的主要优势在于可获得无限量的健康细胞，并且其视网膜下注射的手术操作与拟用于患者的临床操作具有高度相似性。该技术的应用前景包括通过展示由人胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞，用于治疗年龄相关性黄斑变性。我们的动物技术员 Monica Aronsson 正固定住兔子，以便我们能够通过光学相干断层扫描观察和成像视网膜。根据文本方案将兔子麻醉后，将其置于手术显微镜下，头部朝向术者。然后，使用开睑器移除眼睑，并用无菌纱布去除瞬膜。进行显微手术时，采用双通道或可选的三通道25G经玻璃体平坦部技术，使用无瓣膜套管插入显微手术器械。多功能玻璃体切除仪设有连接灌注套管、内照明、玻璃体切割头和内界膜激光仪的接口。对于视网膜下注射，仅需内照明，因此双通道装置已足够。使用取核钳夹住并移开结膜，标记插入位置。从角膜缘起，距其1至2毫米处，以与角膜缘平行的30至45度角，经巩膜插入两个上方套管针中的一个。继续将套管插入至其尖端的中点位置，随后将套管旋转90度并推进入眼内，方向对准后极部。此操作可防止术后经巩膜切口发生渗漏，并降低眼内炎的风险。对第二个上方套管针重复上述操作。插入套管针时，应距离角膜缘1至2毫米，以建立隧道式插入路径，并朝向眼后极部，从而最大限度降低感染、玻璃体出血、视网膜脱离以及接触晶状体的风险。在角膜上涂抹人工泪液作为接触凝胶，然后将一次性平接触镜置于角膜上，以清晰观察视网膜。接下来，将500 µL高碘酸钠滴入连接延伸管的一毫升注射器中，延伸管由助手操作，而38号聚酯尖端套管由外科医生操作。将内照明探头经左上方套管插入。然后，将注射套管经右上方套管插入，并穿过玻璃体腔向视网膜方向推进，目标位置为视神经乳头下方区域。缓慢使套管尖端接触视网膜，直至出现局部变白现象。切勿让套管刺入视网膜，以免引起出血。现在，用针头刺入视网膜，在五秒时间内向视网膜下注射50 µL碘酸钠溶液。由于视网膜与下方脉络膜之间存在天然的裂隙平面，注射过程中应逐渐形成一个清晰可见的半透明隆起。注射时缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于隆起内，以尽量减少反流。取出内照明装置和注射套管后，使用取核钳移除套管针。然后使用吸头或镊子的钝端，对软性密封的无缝线巩膜切口施加轻柔压力，持续三十秒。在恢复期间，按照文本方案护理动物，并等待七天以进行移植。在注射碘酸钠七天后，以及根据文本方案玻璃体内注射曲安奈德后，从24孔板中完全融合的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮（hESC-RPE）单层细胞中移除细胞分化培养基，并用五百微升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗每个孔。消化细胞后，倾斜培养板并小心吸除胰蛋白酶，使细胞仍附着在培养板上。用八百微升新鲜的、预热至三十七摄氏度的分化培养基，通过轻柔吹打或必要时轻轻刮取，收集细胞以获得单细胞悬液。使用0.2%台盼蓝，按照制造商说明书，用血细胞计数板对细胞进行计数。然后向细胞悬液中加入5 mL分化培养基，在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜过滤除菌的PBS中，终浓度为每微升1000个细胞。将上述细胞悬液分装为每份600 µL，分装后置于冰上，直至手术及手术过程中使用。按照文本方案对兔子进行麻醉并散瞳后，将兔子头部朝向外科医生放置。使用眼睑拉钩拉开眼睑，并用无菌布去除瞬膜。进行显微手术时，采用双通道或可选的三通道25号经玻璃体 pars plana 技术，套管插入的位置应如本视频前面所示相同。若先前的巩膜切口可见，则应将套管穿刺位置选择在紧邻但不穿过这些切口的位置，以尽量降低术后渗漏的风险。同前法将人工泪液滴于眼球表面，并在角膜表面的溶液上放置一次性平面接触镜，以观察视网膜。将注射针头准确定位后，对准经碘酸钠预处理区域的中心（该区域具有特征性的金属样内照明反射），向视网膜下腔缓慢注射50 µL轻柔混匀的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hESC-RPE）悬液。神经感觉层视网膜应易于分离，形成清晰可见的隆起。注射过程中，缓慢回撤针头，但需确保针尖始终位于隆起内，以最大限度减少反流。取出内照明装置和注射套管后，使用取核钳移除套管针，再用镊子的钝端如前所述轻压30秒。根据制造商的说明，使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）设备及其配套软件，获取经处理动物的横截面B扫描图像。将麻醉且瞳孔散大的动物置于可调节的固定装置中，以确保仪器光源与兔视网膜之间具有无障碍的光路。为避免图像模糊，每隔30至60秒使用局部生理盐水冲洗角膜，以保持其湿润。获取至少三次OCT扫描，同时结合红外共焦扫描激光检眼镜或共焦SLO反射图像，以分别代表注射区域的上部、中央和下部。使用共焦SLO的蓝光、绿光、红外光及多色激光反射，获取多个同步激光颜色的 en-face 视网膜图像。利用SD-OCT设备的蓝光激光功能，采集蓝光自发荧光图像。此处展示了正常白化兔视网膜的BAF、IR-cSLO和SD-OCT代表性活体图像。SD-OCT图像的放大图显示了SD-OCT仪器捕获的不同视网膜层各自特有的光反射水平。如该SD-OCT图像所示，在注射50 µL 1毫摩尔碘酸钠溶液三个月后，形成一个水泡样隆起，随后该隆起逐渐消退并导致外层视网膜进行性退化。在SD-OCT中可观察到最外层神经视网膜变薄以及低自发荧光（hypo-BAF）区域，对应于视网膜色素上皮（RPE）的丢失，从而重现了类似地理样萎缩（GA）的表型。在确定损伤区域后，重新注射5万个hESC-RPE细胞进行移植，形成第二个隆起并随后消退。损伤区域边缘可见轻度至中度的高自发荧光（hyper-BAF）区域，局部hyper-BAF信号增强，提示内源性RPE处于慢性应激状态。作为对照，展示了未经预处理的眼睛注射hESC-RPE后形成的泡状结构，MC图像中可见色素细胞斑块，SD-OCT扫描显示视网膜结构保存良好。掌握这种较为成熟的临床视网膜下注射技术，将有助于推动基于细胞治疗的临床移植，用于治疗年龄相关性黄斑变性等疾病。观看本视频后，您应能够充分理解如何在活体模型中实施视网膜下注射，如何准备用于视网膜下注射的人胚胎干细胞来源的细胞，以及如何利用光学相干断层扫描技术观察供体细胞的整合情况。

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人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞移植视网膜大眼模型的地理萎缩

细胞移植是一种针对以感光细胞丧失为特征的视网膜退行性疾病的治疗策略。本文介绍一种富集可移植感光细胞并将其移植至成年小鼠视网膜下腔的方法。...

成年小鼠视网膜下移植MACS纯化的光感受器前体细胞

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

视网膜色素上皮（RPE）替代策略和基于基因的治疗已被考虑用于多种视网膜变性疾病。在临床转化过程中，需要使用大型眼动物模型来研究适用于患者的手术技术。本文介绍了一种用于视网膜下手术的兔模型，该模型专为RPE移植设计，具有多功能性和成本效益。...

兔眼视网膜下手术的逐步操作方案

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。...

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。...

由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。...

在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

非人灵长类动物（NHP）由于其在解剖结构和遗传上的相似性，是研究人类视网膜细胞治疗的理想模型。本文描述了一种在NHP眼球中进行黄斑下视网膜色素上皮细胞移植的方法，以及预防与黄斑操作相关的术中并发症的策略。...

退行性视网膜疾病非人灵长类动物模型中的视网膜色素上皮移植

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。...

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

人类胚胎干细胞（ES细胞）的传代培养

了解人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞移植技术，用于视网膜地理萎缩的大眼模型研究。该方法通过光学相干断层扫描评估细胞整合，为年龄相关性黄斑变性的再生医学治疗提供新思路。

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

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