Name: 小鼠尿的解剖和外植体培养对囊附着的作用分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习小鼠尿囊解剖与外植体培养技术，用于分析尿囊在α4β1整合素上的附着过程。该方法为研究胎盘形成的早期关键步骤提供了可靠的体外模型，有助于深入理解哺乳动物胚胎发育机制。

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本工作由德国研究基金会SFB688（资助编号：A.G.）资助。

小鼠繁育工作已获得下弗兰肯行政区的批准，所有分析均严格遵守德国及欧洲联盟关于实验动物护理与使用的各项法律法规。
1. 使用 α4β1 整合素包被微量滴定板 子宫外 尿囊外植体培养
<ol>
	<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将冻干的小鼠 α4β1 整合素重悬至 200 µg/mL。再用预热（37 °C）的 PBS 稀释至终浓度为 10 µg/mL。向微孔板所需数量的孔中每孔加入 20 µL 稀释后的 α4β1 整合素溶液（每孔 1 个尿囊）。 
	注意：包被微孔板孔壁时应避免产生气泡。</li>
	<li>将微孔板置于湿润的组织培养孵育箱中，在 37 °C 下孵育 60 分钟。</li>
	<li>用移液器小心吸除上清液。采用轻柔的负压，并倾斜微孔板，避免移液器吸头接触孔底。加入 50 µL 预热（37 °C）的培养基（如 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，DMEM）洗涤孔两次，每次均通过轻柔负压去除洗涤液。</li>
	<li>关键步骤：每孔加入 50 µL 含 0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的 DMEM 溶液，以封闭非特异性结合位点，并将微孔板置于湿润的组织培养孵育箱中，在 37 °C 下孵育 ≥ 30 分钟。 
	注意：在含血清条件下，尿囊外植体可附着于多种表面。因此，在用整合素包被孔板后、加入分离的尿囊进行外植体培养前（见步骤 4.4），必须封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>将包被后的孔板保留在封闭液中，于 37 °C 孵育，直至步骤 4.4 使用。</li>
</ol>
2. 在妊娠第8天从小鼠中解剖子宫
注意：通过体重增长差异来降低假阳性妊娠率15。
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠。用70%（v/v）乙醇喷洒腹部区域的被毛进行消毒。 
	注意：操作小鼠时应佩戴手套。采用颈椎脱位法对小鼠实施安乐死时无需使用麻醉剂，以避免化学物质污染尿囊，防止干扰尿囊的附着。</li>
	<li>用剪刀在腹部中线处做一小切口，切开腹腔皮肤。戴上手套的手指分别抓住切口上下方的皮肤，向小鼠胸部和尾部方向拉开皮肤。</li>
	<li>用镊子夹住腹膜，另一只手持剪刀从前往后做V形切口，将组织移开以暴露腹腔。用镊子将肠管推向一侧，以暴露子宫。</li>
	<li>找到两个子宫角。用镊子夹住宫颈（尾侧部分），用精细剪刀剪断韧带。随后剪断输卵管，分离两个子宫角。&#160;剪刀。</li>
	<li>使用镊子将子宫转移至含有无菌、室温（RT）PBS 的无菌 10 cm 培养皿中。用精细镊子和/或剪刀去除子宫角周围附着的脂肪组织、血管和神经。图1A).</li>
</ol>
3. 胚胎解剖
注意：以下步骤需在配备 8:1 变焦范围的体视显微镜下进行。
<ol>
	<li>用剪刀在植入部位之间剪开，分离胚胎。用镊子夹住子宫芽的肌性子宫内膜并将其拉开，以暴露蜕膜（图1B）。</li>
	<li>用镊子将子宫芽转移至一个新的含有无菌室温 PBS 的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>用镊子尖固定胚胎周围的蜕膜。</li>
	<li>用精细镊子在蜕膜的反系膜侧做切口&#160;（图1C），然后用镊子剥离蜕膜，暴露胚胎（图1D）。 
	注意：蜕膜的系膜极血管丰富，基部较宽，而反系膜部分含有胚胎，颜色较浅。</li>
	<li>用镊子解剖胚胎（图1E、F）。</li>
	<li>用微型勺将胚胎转移至无菌 3.5 cm 培养皿中的一滴无菌 PBS 液滴内。</li>
	<li>用微型勺将胚胎转移至同一 3.5 cm 培养皿中的新鲜 PBS 液滴，并用镊子将胚胎从卵黄囊上解剖下来（图1G、H）。</li>
	<li>如有需要（例如，用于聚合酶链式反应基因分型），可用大孔径 200 µL 移液枪头吸取约 5 µL PBS 将卵黄囊吸入无菌管中，于 -20 °C 保存。 
	注意：可能污染卵黄囊样本的母体组织（即，包括Reichert膜和外周胎盘锥体的壁层卵黄囊）可能导致错误的基因分型结果。在将胚胎从卵黄囊上解剖之前，最易去除这些组织。</li>
</ol>
4. 尿囊解剖与 子宫外 固定化 α4β1 整合素上的培养
<ol>
	<li>使用精细镊子从胚胎后端的基部附着处切下尿囊图1H).</li>
	<li>必要时，若需进行发育分期，可使用配备相差光学系统和5×、10×物镜的显微镜，通过目视观察计数胚胎的体节对数。 
	注意：可用镊子拉伸胚胎以方便数 somite。在具有 ≥ 6 对 somite 的胚胎中，绒毛膜-尿囊附着与融合发生在 E 8.0 至 E 9.0 之间。体节数为 6–8 对的胚胎开始发生胚胎转动。</li>
	<li>在所需数量的预包被微量培养板孔中，每孔加入40 µL添加了10%（v/v）胎牛血清、L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM。</li>
	<li>用200 µL枪头的大孔径吸头吸取约5 µL PBS，收集漂浮的尿囊。每孔转移1个尿囊。</li>
	<li>将微孔板置于湿润的组织培养孵育箱（37 °C，5% CO₂）中孵育尿囊膜组织。2）用于 例如6、12 和 24 小时。为避免干扰尿囊附着，切勿在上述时间点之间移动微量滴定板。</li>
	<li>在每个时间点，对尿囊附着情况进行评分（例如，无附着/漂浮的尿囊；部分或完全附着的尿囊；完全铺展的尿囊）使用配备相差或微分干涉对比光学系统的显微镜及5×或10×物镜观察图2). 
	注意：图中显示了新鲜分离并完全贴壁的尿囊膜的代表性示例 图2. 子宫外野生型C57BL/6J小鼠分离的尿囊远端尖端在4–6小时内附着（称为尿囊部分附着），整个尿囊的完全附着在培养约12小时内完成。至18–24小时，外植体变扁平并呈现圆形（称为完全铺展的尿囊），并形成CD31阳性血管网状结构9,16.</li>
</ol>
5. 对移植的尿囊进行内皮细胞标志物CD31的验证性染色
<ol>
	<li>吸除完全铺展的外植体的培养基，通过每孔加入 40 µL 的 4% (w/v) 多聚甲醛/PBS 固定细胞。 
	注意：多聚甲醛具有毒性。操作时应佩戴手套和护目镜，避免接触皮肤和眼睛。</li>
	<li>在室温下孵育 10 分钟，然后吸除上清液。每孔加入 40 µL PBS 洗涤三次，通过轻柔抽吸去除洗涤液。</li>
	<li>在室温下，每孔加入 40 µL 含 0.1% (v/v) Triton X-100、0.1% (w/v) BSA 和 10% (v/v) 正常山羊血清的 PBS 溶液，孵育 30 分钟，以通透细胞并阻断非特异性结合位点。每孔加入 40 µL PBS 洗涤两次，通过轻柔抽吸去除洗涤液。 
	注意：本步骤可在此处暂停，过夜保存。</li>
	<li>每孔加入 20 µL 用 0.1% (w/v) BSA/PBS 按 1:50 稀释的一抗抗 CD31 抗体，在 4 °C 下孵育过夜。每孔加入 40 µL PBS 洗涤三次，通过轻柔抽吸去除洗涤液。</li>
	<li>每孔加入 20 µL 用 0.1% (w/v) BSA/PBS 按 1:200 稀释的荧光标记的山羊抗大鼠二抗，在室温下孵育 1 小时以检测结合的一抗。用铝箔包裹或置于暗盒中，避免微孔板暴露于光照。每孔加入 40 µL PBS 洗涤三次，通过轻柔抽吸去除洗涤液。</li>
	<li>每孔加入 20 µL 封片介质以封固细胞。在室温下孵育约 1 小时，直至封片介质凝固。将微孔板置于室温或 4 °C 避光保存。</li>
	<li>使用配备 5× 或 10× 物镜及合适荧光滤光片的荧光显微镜观察尿囊外植体中的血管网结构。 
	注意：完全铺展的尿囊中 CD31 阳性血管网的代表性图像见图3。其他可用于血管网标记的分子，如针对 Flk-1、Flt、Tie-1 或 Tie-2 的抗体亦可使用16。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在含有血清的情况下，血清是纤连蛋白等促黏附细胞外基质分子的丰富来源，尿囊外植体将易于附着于各种塑料、玻璃或滤膜表面9,16因此，如果所进行的实验旨在特异性地研究基因修饰或任何其他处理对尿囊绒毛膜在固定化α4β1上附着的影响，则必须阻断非特异性结合位点例如，用整合素包被表面后、在与含血清培养基孵育前，加入含牛血清白蛋白的溶液。
所有尿囊外植体与固定的 α4β1 整合素之间的初始黏附对移动非常敏感，因此在评估尿囊黏附之前，应使组织培养板保持静止一段预设的时间（例如，12 小时）。请注意，与基质形成稳定接触所需的时间可能因分析的小鼠品系或固定的 α4β1 整合素浓度不同而有所差异。
细胞间VCAM-1/α4β1相互作用对成功实现绒毛尿囊融合的必要性已得到充分证实11,12</s...

胎盘对于胚胎在子宫环境中的生长和发育至关重要。它构成了胎儿与母体循环之间进行氧气、代谢物和营养物质交换的界面，同时还具有内分泌和免疫器官的功能。任何损害胎盘发育的内源性或外源性因素，均可能导致小鼠和人类出现宫内生长受限、胎儿丢失或妊娠并发症1尽管导致胎盘生理异常的靶向小鼠突变数量持续增加2，目前小鼠基因组信息学（Mouse Genome Informatics, MGI）网站（http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0010038）列出了219种基因型，其中许多表型在机制层面上尚未被充分理解。除遗传改变外，小分子药物、单克隆抗体、毒素、病原体、过量代谢物或各种环境因素均可能影响胎盘的发育与功能3,4,5,6,7。然而，简单的 体外 模拟胎盘发育关键步骤的检测方法十分有限。
小鼠胎盘发育始于妊娠中期早期，此时尿囊（脐带的发育前体）从胚胎后端以芽状结构向外延伸，并朝向绒毛膜生长8尿囊芽外层的绒毛膜粘附细胞介导尿囊在绒毛膜表面的附着与铺展（尿囊绒毛膜） &#34;融合&#34;随后，绒毛膜折叠形成绒毛，尿囊的血管长入其中，形成迷路层，即胎盘内层，在此母体血窦与胚胎血管紧密相邻，进行营养物质和氧气的交换。9,10.
尿囊与绒毛膜的附着是迷路结构形成的初始且关键步骤，该过程的缺陷是中期妊娠胚胎致死最常见的原因之一。1尽管已有多种小鼠突变体被报道存在绒毛膜-尿囊膜附着失败的现象10，MGI 数据库目前列出了 108 种以绒毛膜尿囊融合异常为特征的小鼠突变体（http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824）。血管细胞黏附分子-1（VCAM-1，表达于尿囊中胚层）与 α4β1 整合素（表达于源自胚外中胚层的绒毛膜间皮层）之间的细胞间相互作用，对于绒毛膜与尿囊的附着和融合似乎不可或缺11,12,13对野生型胚胎整体进行免疫组织化学染色显示，VCAM-1 在约胚胎第 7.5 天（E7.5）时表达于尿囊柄远端的三分之二区域13 （1-4体节期），且其表达在绒毛尿囊附着及融合过程中持续保持高水平11,12绒毛膜与尿囊未能成功连接通常通过子宫芽的组织学分析来检测。然而，即使在同一发育阶段的同窝胚胎之间甚至同窝内，尿囊的大小在生理上也存在高度变异。14，且尿囊只有在生长到足以进行物理接触的大小时，才能附着于绒毛膜。由于这种自然变异性，绒毛膜-尿囊附着过程通常发生在约 E 8.0 至 E 9.0 之间的某个时间点 在子宫内因此，对该过程进行具有统计学可靠性的组织学评估，依赖于分析大量胚体，以获得足够数量处于适当发育阶段的样本。
此处，我们介绍一种评估尿囊附着的方法 子宫外 对尿囊大小依赖性较小的方法。我们展示了从小鼠妊娠约8天的子宫中分离小鼠胚胎及其尿囊的操作过程 交配后 （dpc；dpc 0.5 指检测到阴道栓），随后将尿囊组织外植体在固定的 α4β1 整合素上进行培养。该方法可实现对多个尿囊外植体在不同连续时间点的黏附与铺展行为进行快速、功能性的平行评估。本实验方案可用于筛选靶向突变、药物或各种环境因素对尿囊黏附的影响 离体.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J野生型小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>货号：&amp;nbsp;000664</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) 乙醇</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11000-12</td><td>用于打开腹腔的镊子。</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>杜蒙特 #5 医学生物学镊子，尖端精细且锋利。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>精细剪刀&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>直刃刀片</td></tr><tr><td>弹簧剪&amp;nbsp;</td><td>精细科学工具</td><td>15012-12</td><td>用于子宫芽解剖的14毫米刀片Noyes弹簧剪。</td></tr><tr><td>微勺</td><td>卡尔·罗斯</td><td>AT18.1</td><td>5 mm 勺子直径。</td></tr><tr><td>微量滴定板</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>我们使用未包被的无菌血管生成载玻片（内体积 50 &amp;micro;L）带有疏水表面且未经组织培养处理，以减少非特异性结合&amp;#945;4&amp;#946;1介导的与塑料的结合</td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>无菌组织培养皿</td></tr><tr><td>3.5 cm 培养皿</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>无菌组织培养皿</td></tr><tr><td>大孔径移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>低吸附移液器吸头，200 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>&amp;#945;4&amp;#946;1整合素</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>6054-A4</td><td>小鼠 &amp;#945;4&amp;#946;从中国仓鼠卵巢细胞系中重组表达并纯化的1整合素。</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>无钙&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>该培养基配方含有 4.5 g/L 葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠和 3.7 g/L NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 但不含L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺需单独添加。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco（ThermoFisher Scientific）</td><td>15140-122</td><td>100 ×（10,000 U/mL 青霉素和 10,000 &amp;micro;g/mL 链霉素）储备液。&amp;nbsp;在 -20 ℃ 下分装并储存 aliquots &amp;deg;C，以避免冻融。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 × (200 mM) 储存液。配制后分装，于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C，以避免冻融。</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>我们使用热灭活的FBS（加热至56℃） &amp;deg;37°C 下孵育 30 分钟并混匀，以灭活补体。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>我们使用无蛋白酶和无脂肪酸的白蛋白。用DMEM配制0.1%（w/v）的溶液。使用一次性细胞培养滤器（孔径0.22 μm）对溶液进行无菌过滤。 &amp;micro;m 孔径和低蛋白结合膜，分装后于 -20 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-甲醛</td><td>卡尔·罗斯</td><td>0335.2</td><td>在 PBS 中配制甲醛溶液，称取 &lt;em&gt;para&lt;/em&gt;在通风橱中将甲醛粉末加入预热至约 60 ℃ 的 PBS 中 &amp;deg;将溶液置于烧杯中，放在搅拌器上搅拌。逐滴加入1 N NaOH，直至溶液变澄清。让溶液冷却至室温，然后通过0.22 mm滤膜注射器过滤。用稀释的HCl调节pH至约6.9，并用PBS定容。我们将该溶液分装后冷冻保存，但也可在4℃储存 &amp;deg;约四周。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>使用宽孔径移液器吸头操作未稀释的Triton X-100。</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>用于阻断免疫荧光分析中抗体的非特异性结合。</td></tr><tr><td>&amp;#945;抗-CD31 抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>550274</td><td>纯化的抗小鼠单克隆抗体（大鼠源），克隆株 MEC 13.3</td></tr><tr><td>二抗山羊抗大鼠抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11006</td><td>山羊抗大鼠IgG（重链和轻链），经交叉吸附，用Alexa Fluor 488荧光标记。也可使用其他荧光标记。</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>细胞化学用封片介质。分子量约 31,000</td></tr><tr><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>配备4倍和10倍物镜的倒置相差显微镜，用于体节对数计数。其他相差显微镜（例如常规用于组织培养的显微镜）也同样适用。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>徕卡显微系统</td><td>M80</td><td>具有8:1变焦范围（放大倍数为7.5×至60×）的体视显微镜，用于胚胎和尿囊的解剖。</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>徕卡显微系统</td><td>DM4000B</td><td>用于组织学的LED照明显微镜系统。我们使用HCX PL FLUOTAR 5×/0.15和HC PL FLUOTAR 10×/0.30物镜。其他配备相差和荧光光学系统的显微镜也可用于评估尿囊附着情况。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>配备3-CCD数字成像相机的DM4000B LED显微镜。我们使用Diskus软件（Hilgers）控制显微镜和相机。</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>SP5</td><td>用于对尿囊外植体血管丛中内皮细胞进行高分辨率成像的共聚焦显微镜。免疫荧光图像使用40倍物镜拍摄。</td></tr></tbody></table>

小鼠尿囊的分离与外植体培养 体外 尿囊附着分析

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

胎盘对于哺乳动物胚胎的生长和发育至关重要。正因如此，许多遗传改变以及可能存在的多种环境有害因素若干扰胎盘的发育或功能，均可能导致小鼠和人类早期妊娠失败。然而，目前仍缺乏简单 体外 用于筛选对胎盘形成潜在影响的检测方法尚付阙如。本文重点在于模拟胎盘形成的第一步及关键步骤，即尿囊与绒毛膜的附着过程。我们描述了一种快速评估尿囊外植体在固定化α4β1整合素（作为模拟绒毛膜的基质）上附着能力的方法。 体外 该方法能够对多个尿囊外植体在不同连续时间点的附着和铺展行为进行定性评估。该实验方案可用于研究靶向小鼠突变、药物或各种与妊娠并发症或胎儿丢失相关的环境因素对尿囊附着的影响。 离体.

本方案描述了一种分离和外植小鼠尿囊的方法 离体，并详细描述了尿囊与α4β1整合素结合的定性评估，这是发育过程中的关键步骤 体内 绒毛尿囊融合。所示的代表性结果见于 图1A-H 展示从妊娠子宫开始的尿囊分离的各个连续步骤。包围子宫角的母体组织，如脂肪组织和血管（图1A) 被移除后，通过逐层切开肌性子宫壁，将胚胎从子宫内膜中逐步分离出来图1B-E）。随后，去除其他母体组织，如壁层卵黄囊和外周胎盘锥体（图1E，F). 图 1G-H<...

我们描述了一种 体外 建立绒毛尿囊附着（胎盘形成的首个步骤）的实验模型。该方案展示了将小鼠尿囊在固定化的α4β1整合素上进行解剖及外植体培养的操作流程。通过显微镜在预设的时间点评估尿囊的附着情况。

胎盘对于哺乳动物胚胎的生长和发育至关重要。正因如此，多种遗传改变以及可能的环境因素……

本实验的总体目标是对小鼠尿囊进行分离和外植体培养，以体外分析尿囊附着过程。该方法有助于解答哺乳动物胚胎发育领域的关键问题，例如胎盘形成过程中尿囊附着的调控机制。该技术的主要优势在于，它能够在体外模拟胎盘形成的第一步，也是关键步骤。本实验操作由本实验室的技术员 Kerstin Hadamek 演示。在准备培养板时，首先向每个孔中加入 20 µL 新鲜配制的 Alpha 4/Beta 1 整合素溶液。每个孔计划放入一条尿囊。切勿加入含有气泡的溶液，以免影响正常包被。加样后，将酶标板置于湿盒中孵育1小时。孵育结束后，倾斜放置酶标板，用移液器小心吸去上清液，避免接触孔底。接着，使用 50 微升预热的培养基洗涤各孔两次。去除洗涤液时，采用轻柔的负压抽吸。向每孔中加入 50 微升封闭液。然后，将培养板孵育至少30分钟，直至需要使用。尿囊外植体具有很强的黏附性，因此，阻断步骤对本方案的成功至关重要。处死一只怀孕小鼠后，用70%乙醇对腹部区域进行消毒。接着，用剪刀在腹中线处做一个小切口，打开腹部皮肤。戴上手套的手指分别抓住切口上下方的皮肤，向小鼠胸部和尾部方向将皮肤分开。现在，用镊子夹住腹膜，另一只手从前方朝后方做V形切口。分离组织以进入腹腔，然后将肠道推向一侧以暴露子宫。接着，找到两个子宫角。用镊子夹住子宫角的尾侧部分（即子宫颈），用精细剪刀剪断韧带。随后，用剪刀切断两侧输卵管，将两侧子宫角分离。分离后，用镊子将子宫转移至含有室温 PBS 的 10 厘米培养皿中。在培养皿中，使用精细镊子和弹簧剪去除子宫角周围附着的脂肪组织、血管和神经。随后，进行胚胎的精细解剖。胚胎解剖应在具有8:1变焦范围的体视显微镜下进行。首先用剪刀在植入部位之间剪开，分离胚胎。用镊子夹住子宫芽的肌层子宫内膜并将其拉开，以暴露蜕膜。接着，用镊子将子宫芽转移至一个新的、直径10厘米并含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。现在，用镊子固定住胚胎周围的蜕膜。蜕膜的子宫胎盘部血供丰富，其基部通常比含有胚胎的对子宫胎盘部更宽。接下来，去除蜕膜的子宫胎盘部分。用精细镊子在蜕膜的抗系膜侧做一切口，用镊子剥离蜕膜以暴露胚胎。使用另一对镊子分离胚胎。用显微勺收集胚胎。将胚胎放入3.5厘米培养皿中的一滴PBS中。然后在培养皿内转移至第二滴PBS中。现在，使用镊子将胚胎从卵黄囊中解剖分离。由于母体组织可能污染卵黄囊样本，导致基因分型结果错误，因此需分离壁层卵黄囊，包括Reichert膜和外周胎盘锥体。随后，将分离出的卵黄囊连同部分PBS转移至储存管中，用于分子分析。将这些样本储存在-20摄氏度条件下。解剖的下一步是用精细镊子从胚胎后端的基底附着处剪下尿囊。如果需要进行发育分期，可在相差显微镜下计数胚胎的体节对数。绒毛尿囊的附着与融合发生在胚胎第8天至第9天（E8至E9），涉及至少六对体节。对于尿囊组织，将预包被的培养板孔中

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