Name: 利用 CRISPR/Cas9 基因编辑研究细胞因子依赖性造血细胞中突变钙的致癌活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 了解如何利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在细胞因子依赖性造血细胞中建立钙网蛋白突变模型，研究其致癌活性。该方法有助于深入理解驱动突变在血液恶性肿瘤中的生物学功能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院（R01HL131835）、达蒙·鲁尼恩临床研究员奖以及斯塔尔癌症联盟资助。

1. 使用在线工具设计sgRNA13
<ol>
	<li>使用免费的在线工具设计靶向目标基因的sgRNA。
	<ol>
		<li>将目标基因的NCBI参考序列复制并粘贴到Broad研究所sgRNA设计网页工具中：(http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)。 
		注意：该工具可识别位于外显子内的切割位点，以及跨越内含子/外显子边界但仍在外显子内进行切割的sgRNA序列。</li>
		<li>下载文本输出文件，并在Excel中打开。</li>
		<li>重点关注包含sgRNA序列和sgRNA上下文序列的列。请注意，sgRNA序列本身不包含原间隔序列邻近基序（PAM），但上下文序列包含PAM。</li>
		<li>请注意，靶向效率评分以0到1的范围列出，预测切割效率，评分为1表示更高的切割效率。</li>
		<li>使用Excel的“排序”功能，按效率评分或通过“Target Cut %”列按目标在基因内的位置对候选序列进行排序。 
		注意：按基因内的位置排序有助于识别靶向特定功能域或感兴趣外显子的sgRNA。</li>
		<li>选择3-6个靶向感兴趣区域且具有高（&#62;0.6）靶向效率评分的sgRNA。了解可能导致预期表型的突变类型可能有助于设计（请参见图1，解释用于钙网蛋白的靶向策略）。 
		注意：当缺乏其他良好候选序列时，可考虑使用效率评分低于建议阈值0.6的sgRNA。</li>
		<li>使用MIT gRNA分析网页工具筛选潜在的脱靶效应（http://crispr.mit.edu/）。对每个选定的sgRNA，运行其靶序列（包括PAM）。 
		注意：Broad研究所sgRNA设计网页工具也可用于筛选脱靶效应（http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）。
		<ol>
			<li>请注意，MIT sgRNA分析工具对每个sgRNA按1-100的评分标准进行打分，评分为100表示特异性更高。评分大于70为理想情况，代表该sgRNA具有最小的脱靶效应。该网站还会生成脱靶位点列表，包括其在基因组中的位置以及与候选引导序列的错配数量。 
			注意：具有四个或更多错配的脱靶位点被认为是安全的14。若错配少于四个且位于外显子内，则可能存在问题14。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择2-3个靶向目标基因感兴趣区域内不同位置、且具有最高成对切割效率和最佳脱靶评分的sgRNA（参见表1中靶向Calr基因第9外显子的sgRNA序列）。 
		注意：根据实验目标的不同，可对上述工具获得的不同数值赋予不同的权重。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 克隆sgRNA寡核苷酸13
<ol>
	<li>生成正向寡核苷酸
	<ol>
		<li>创建一个不含PAM位点的sgRNA序列列表。</li>
		<li>如果sgRNA序列的5'端不是G，则在序列的5'端添加一个G。 
		注意：此 G 对于最大化 U6 驱动的 sgRNA 转录水平是必需的。m1 sgRNA 必须添加一个 G。表1).</li>
		<li>添加序列 &#34;CACC&#34; 到G优化的向导序列（无PAM）的5'端表2以产生连接退火寡核苷酸至 BsmBI 所需的突出末端 已消化的 lentiGuide 载体（参见步骤 3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成反向引物
	<ol>
		<li>将G优化的引导序列（不含PAM）进行反向互补。</li>
		<li>添加序列 &#34;AAAC&#34; 到反向互补的G优化向导序列的5'端（表2).</li>
		<li>从引物合成公司订购设计好的寡核苷酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>退火并磷酸化寡核苷酸
	<ol>
		<li>加入1 µL正向寡核苷酸（100 µM）、1 µL反向寡核苷酸（100 µM）、1 µL 10x T4连接酶缓冲液、0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）和6.5 µL H₂O2加入PCR管中（总体积 = 10 µL）。</li>
		<li>在热循环仪中运行以下程序：37 ˚C 反应 30 分钟，95 ˚C 变性 5 分钟，以 0.1 °C/s 的速率从 95 ˚C 降温至 25 ˚C。</li>
		<li>将反应产物用 H 按 1:250 稀释2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. lentiGuide-Puro 载体的消化13
<ol>
	<li>消化 lentiGuide-Puro 载体
	<ol>
		<li>将以下组分混合配制成50 µL的酶切反应体系：5 µg环状质粒、2 µL（30单位）BsmBI限制性内切酶、5 µL限制性内切酶缓冲液，加H₂O至终体积50 µL2O.</li>
		<li>在55 °C下反应2小时。第一小时结束后，再加入1 µL BsmBI限制性内切酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对切割后的载体进行去磷酸化处理
	<ol>
		<li>向消化后的载体中加入7 µL磷酸酶反应缓冲液和2 µL磷酸酶酶。</li>
		<li>37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用商业试剂盒对切割并去磷酸化的载体骨架进行PCR纯化。 
	注意：由于蓝色柱子能更好地容纳较大的质粒尺寸，因此请用试剂盒提供的蓝色柱子替换图示的粉色柱子。为提高产量，可在洗脱前将洗脱缓冲液在90 ˚C金属浴中预热，并在最后一步对柱子进行两次洗脱（将第一次洗脱得到的DNA再次加入柱子中进行第二次洗脱）。</li>
</ol>
4. 将退火的寡核苷酸连接至酶切后的骨架13
<ol>
	<li>在PCR管中加入50 ng酶切后的骨架质粒、1 µL退火寡核苷酸稀释液、1 µL 10x T4连接缓冲液、1 µL T4 DNA连接酶，并用H2O补至总体积10 µL。在室温下孵育1小时。</li>
	<li>取2 µL连接反应产物转化Stbl3感受态细胞，涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37 °C过夜培养。</li>
	<li>挑取3个单菌落，接种至小量培养液中进行培养。</li>
	<li>验证寡核苷酸的正确插入
	<ol>
		<li>对每种培养物进行质粒小量提取，并使用商业试剂盒，以U6启动子内的引物起始，对寡核苷酸插入位点进行测序验证。</li>
		<li>对测序验证正确的菌株进行中量或大量质粒提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 稳定表达 SpCas9 的细胞系的建立
注意：本实验方案涉及通过慢病毒感染递送 pLX_TRC311-Cas9 质粒。本方案以依赖小鼠白细胞介素-3（mIL-3）的前B细胞（Ba/F3）悬浮细胞系为例进行详细描述，但可根据不同类型细胞的适宜培养条件进行调整，适用于其他细胞类型。Ba/F3 细胞的培养基由 RPMI 培养基组成，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺以及 10 ng/mL 小鼠白细胞介素-3。
<ol>
	<li>转染 HEK-293T 细胞
	<ol>
		<li>每10 cm组织培养皿接种3 × 106个HEK-293T细胞。转染前将接种的细胞培养过夜。 
		注意：HEK-293T细胞为贴壁细胞系，常用于病毒生产。细胞维持在含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的DMEM培养基中。转染时细胞融合度应达到80%。</li>
		<li>预热低血清培养基（Opti-MEM）和生长培养基。</li>
		<li>在离心管中加入500 µL低血清培养基、7 µg pLX_TRC311-Cas9质粒、4 µg pCMV-VSV-G慢病毒包装质粒和4 µg psPAX2慢病毒包装质粒。 
		注意：每10 cm培养皿293T细胞的总DNA用量为15 µg。</li>
		<li>充分混匀DNA溶液，加入45 µL转染试剂，轻轻混匀后室温静置20分钟。 
		注意：必须使用低血清培养基，因为血清会抑制转染试剂与质粒DNA之间的复合物形成。</li>
		<li>吸除293T培养皿中的旧培养基，加入5 mL新鲜生长培养基。</li>
		<li>将DNA与转染试剂的混合物逐滴加入293T培养皿中，轻轻摇晃混匀，于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
		<li>在转染后24小时和48小时收集病毒上清液，经0.22 µm滤器过滤后分装至冻存管中（每管1.6 mL，其中1.5 mL用于感染）。</li>
		<li>将病毒上清液于-80 °C保存。 
		注意：慢病毒上清液可在6个月内使用。如条件允许，应尽量使用新鲜病毒进行离心感染（spinfection）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ba/F3细胞的慢病毒感染
	<ol>
		<li>若病毒上清液为冷冻状态，需在冰上解冻。</li>
		<li>以300 × g离心4分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞重悬于浓度为3 × 106个细胞/mL的新鲜培养基中。</li>
		<li>在6孔组织培养板中加入500 µL重悬细胞、1.5 mL病毒上清液、4 µL聚凝胺（储存液：2 mg/mL）和10 ng/mL小鼠白细胞介素-3（m-IL3）。作为对照，需设置未感染孔，用1.5 mL培养基替代病毒上清液。 
		注意：加入的病毒上清液体积应使感染复数（MOI）&#60;1。</li>
		<li>将6孔板于37 °C、440 × g离心120分钟。</li>
		<li>从离心机中取出培养板，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。</li>
		<li>24小时后离心收集细胞，用5 mL新鲜预热培养基重悬，接种于6孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cas9感染细胞的筛选
	<ol>
		<li>在离心感染后48小时，离心收集细胞，并用含5 µg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）的新鲜预热培养基重悬。</li>
		<li>用杀稻瘟菌素筛选细胞9天，或直至未感染的（阴性）对照组细胞完全死亡。</li>
		<li>筛选完成后，将存活的抗性细胞转移至含较低浓度杀稻瘟菌素的培养基中继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Cas9 活性的报告基因检测15
<ol>
	<li>通过慢病毒感染，将 pXPR-011 载体转导至亲本细胞及稳定表达 Cas9 的细胞中（参见步骤 5.1–5.2）。 
	注意：该载体同时包含 GFP 及靶向 GFP 的向导序列。含有活性 Cas9 的细胞将导致 GFP 表达减少（图 2）。</li>
	<li>在离心感染后 48 小时，使用 2 µg/mL 嘌呤霉素对细胞进行为期 3 天的筛选。</li>
	<li>通过流式细胞术分析样品的 GFP 表达水平。 
	注意：GFP 表达减少 50% 或以上表明 Cas9 活性处于理想水平。若观察到的减少幅度低于 50%，可使用更高浓度的杀稻瘟菌素进行筛选以提高 Cas9 活性。但并非所有细胞系均能耐受杀稻瘟菌素筛选；在此情况下，可能需要使用携带其他筛选标记盒的 Cas9 载体。此外，并非所有细胞系均可耐受 Cas9 的稳定表达；此时可采用 Cas9 的瞬时转染方式。</li>
</ol>
7. 将sgRNA转导至表达Cas9的细胞中
<ol>
	<li>按照步骤 5.1–5.2 对目标细胞进行慢病毒 sgRNA 感染。 
	注意：在步骤 5.1.3 中，将 pLX_TRC311-Cas9 载体替换为第 4 部分中已验证的 lentiGuide-Puro 载体。</li>
	<li>离心感染后 48 小时，用 2 µg/mL 嘌呤霉素对细胞进行 3 天的筛选。</li>
	<li>将抗性细胞转移至抗生素浓度较低的培养基中，继续筛选 4 天，以确保充分编辑。</li>
</ol>
8. 使用 m-IL3 撤除法进行 Ba/F3 细胞转化与阳性筛选
注意：本实验以依赖mIL-3的Ba/F3细胞为例进行描述，但可适用于任何依赖细胞因子的细胞系。
<ol>
	<li>离心收集稳定表达Cas9及目的sgRNA的对数生长期Ba/F3细胞。</li>
	<li>吸除上清液，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>离心收集细胞，并重复步骤8.2中的洗涤步骤共四次（此步骤可确保完全去除培养基中的IL-3）。</li>
	<li>吸除PBS，将细胞重悬于5 mL不含IL-3的新鲜培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板或细胞活力分析仪对细胞进行计数。</li>
	<li>将细胞以1 × 105 个/mL的浓度接种于6孔组织培养板中，每孔总体积为2 mL不含IL-3的新鲜培养基，每组设三个重复孔。</li>
	<li>每隔2天观察并计数细胞，持续共8天。 
	注意：缺乏IL-3的Ba/F3细胞通常在撤除IL-3后2天内死亡。实验中必须设置阴性对照（通常使用非靶向性向导RNA作为对照）。</li>
</ol>
9. CRISPR 靶向编辑的筛选
<ol>
	<li>在sgRNA切割位点的上游和下游设计CRISPR筛选引物 
	注意：引物应距离预测的切割位点至少100 bp，以确保在sgRNA靶位点发生较大插入和/或缺失（indel）时仍能有效检测。</li>
	<li>从转化后的细胞（生长曲线末期）以及细胞因子撤除前的细胞中提取基因组DNA（gDNA）。 
	注意：始终将过表达非靶向引导RNA的细胞作为基因编辑的对照。分别在转化前和转化后提取gDNA，可识别出被正向筛选并具有增殖优势的克隆。</li>
	<li>配制50 µL的PCR反应体系，包含以下组分：25 µL 2x PCR混合液，1 µL正向引物（10 µM），1 µL反向引物（10 µM），50–100 ng gDNA，加H2O至50 µL。 
	注意：步骤9.3中可使用多种高保真聚合酶。</li>
	<li>在热循环仪中运行样品，程序如下：95°C预变性1分钟，30个循环（94°C变性1分钟，52°C退火30秒，72°C延伸30秒），最后72°C延伸10分钟。本PCR程序针对表3中列出的Calr引物进行了优化。应根据在gDNA上的测试结果，对步骤9.1中设计的引物对优化PCR条件。</li>
	<li>取5 µL PCR产物，在1x Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中，以10 V/cm的电压在2%琼脂糖凝胶上电泳。观察样品中是否存在与目标基因大小相符的扩增条带。</li>
	<li>使用剩余的PCR反应产物（45 µL）进行PCR纯化。</li>
	<li>使用PCR克隆试剂盒将扩增产物克隆至质粒载体中。例如，通常使用pGEM T-easy载体。</li>
	<li>将质粒转化至Stbl3细胞或其他相容性细胞中，并涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板上。挑选10–20个单菌落，分别进行质粒小提，并对每个克隆进行Sanger测序，以鉴定CRISPR/Cas9编辑产生的indel类型。 
	注意：如有需要，可对混合编辑的细胞群体进行单细胞荧光激活细胞分选（FACS），以分离具有特定indel的克隆。此外，也可采用下一代测序（NGS）方法，通过对跨越sgRNA靶区域的PCR扩增子进行深度测序，更可靠地定量分析靶向编辑效率。例如，可使用“通过分解追踪indel”（Tracking of Indels by Decomposition，TIDE）方法替代亚克隆，精确测定细胞群体中靶向突变的谱型和频率（https://tide.nki.nl/#about）16。</li>
</ol>

<ol><li>DeWitt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-free+genome+editing+of+the+sickle+mutation+in+human+adult+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Sci Trans Med. 8, 360(2016).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li>
<li>Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li>
<li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+%28CRISPRi%29+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+Gene-knockout+screens+and+target+identification+via+Whole+genome+sequencing+uncover+host+genes+required+for+picornavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection.</a> J Biol Chem. 10, 1074(2017).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4160386/">Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).</li>
<li>Daley, G. Q., Baltimore, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3143116">Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v8/n11/full/nprot.2013.143.html">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucl Acid Res. 42, e168(2014).</li>
<li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).</li>
<li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).</li>
<li>Elf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Calreticulin+requires+both+its+mutant+C-terminus+and+the+thrombopoietin+receptor+for+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation.</a> Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Genomic+Deletions+in+Mammalian+Cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9.</a> J. Vis. Exp. (95), e52118(2015).</li>
<li>Watanabe-Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+acquired+mutations+in+transgenes+arising+in+Ba%2FF3+transformation+assays%3A+findings+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations.</a> Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22NatBiotechnol%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).</li>
</ol>

我们与本报告无任何利益冲突。

本文演示了使用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究CALR突变在造血细胞中生物学功能的方法。该实验方案的成功高度依赖于多个因素。首先，必须明确哪些类型的突变可能导致预期的表型。在本方案中，检测指标是Ba/F3细胞转化为对mIL-3非依赖性生长，所关注的突变类型为CALR基因第9外显子中的插入或缺失（indel）。然而，如果目标是实现单碱基对替换，则应优先选择通过HDR介导的修复方式，因为该方法能够利用单链或双链DNA供体模板精确引入点突变或插入序列2,3。若目标是完全敲除基因功能，则更推荐通过靶向早期编码外显子产生大规模基因组缺失的方法20。
其次，细胞系必须具有细胞因子依赖性，以便在撤除细胞因子后施加正向筛选压力。需要注意的是，并非所有细胞系都能耐受Cas9的稳定表达（参见步骤6.3）。这可能是由于部分细胞系无法耐受杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选。在此情况下，可能需要选...

CRISPR/Cas9 技术最近彻底改变了活细胞和生物体中的靶向基因组编辑。它已成为生物医学研究中一种极为强大的工具，并正在被探索作为治疗遗传性疾病的一种潜在途径1。所有基因组编辑工具的基础都是在需要修饰的基因组位点处由核酸酶诱导产生DNA双链断裂（DSB）。这些双链断裂可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复2,3。与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等其他基因组工程核酸酶相比，Cas9核酸酶的优势在于其通过RNA引导核酸酶靶向特定DNA序列，而ZFNs和TALENs依赖的是蛋白质-DNA相互作用2,3。
在发现CRISPR/Cas9核酸酶通路是原核细胞中的一种适应性免疫系统之后4,5，大量研究致力于将该通路改造用于哺乳动物细胞系和模式生物2,3。作为基因编辑工具，CRISPR/Cas9通路主要利用两个组分：来自Streptococcus pyogenes（Sp）的Cas9核酸酶以及靶向目的基因的sgRNA2,3。sgRNA包含20个核苷酸，通过RNA-DNA碱基互补配对引导Cas9定位到基因组上的特定位点2,3。sgRNA的靶位点必须紧邻一个原间隔序列邻近基序（PAM），其序列为5' NGG，可被SpCas9核酸酶识别。利用这些工具，只需设计靶向目标区域的sgRNA，即可将Cas9引导至任意DNA序列。除了来源于Sp的Cas9外，还存在具有不同特性的Cas9变体，适用于特定应用场景。例如，某些Cas9变体具有更高的靶向编辑特异性，或具备单链切割能力用于DNA切口6,7。此外，催化失活的Cas9最近已被开发用于转录调控8。目前，科学家已将CRISPR/Cas9系统应用于多种研究领域，如基因敲入和敲除以研究基因的生物学功能9、功能缺失和功能获得性文库筛选10，以及模式生物的遗传工程改造11。
在本实验方案中，我们将CRISPR/Cas9技术与Ba/F3细胞转化实验相结合，以研究CALR突变的生物学功能。Ba/F3细胞是一种依赖小鼠白细胞介素-3（IL-3）的造血细胞系，当表达某些癌基因（如BCR-ABL12）时，可转变为IL-3非依赖性生长。为了明确突变型钙网蛋白是否能够使Ba/F3细胞获得细胞因子非依赖性生长能力，我们利用CRISPR/Cas9靶向内源性Calr基因的第9号外显子，引入插入/缺失（indel）突变，随后撤除培养基中的IL-3，施加正向选择压力，旨在模拟骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中所见的CALR功能获得性突变。本方案包括sgRNA的设计、克隆与递送，稳定表达Cas9的细胞系的构建，以及CRISPR靶向基因编辑效果的筛选。该方法可适用于不同基因及多种细胞因子依赖性细胞系的研究，尤其在建模和探究癌症相关基因的生物学功能方面具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>BsmBI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>15025</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>生命技术公司</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 细胞</td><td>生命技术公司</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>生命技术公司</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Omega 科学公司</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺</td><td>生命技术公司</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>mIL-3</td><td>Peprotech 公司</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene 公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene 公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pLX_TRC311-Cas9</td><td>Addgene 公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>pXPR-011</td><td>Addgene 公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Genessee 科学公司</td><td>25-507</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FERB49</td><td></td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro</td><td>Addgene 公司</td><td>质粒 #52963</td><td></td></tr><tr><td>PNK</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen 公司</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen 公司</td><td>27104</td><td></td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）是原核生物中的一种适应性免疫系统，科学家已将其改造用于生成RNA引导的核酸酶，例如CRISPR相关蛋白9（Cas9），以实现真核生物基因组的位点特异性编辑。利用Cas9进行基因组工程改造，可高效、简便且稳健地修饰多种与生物医学相关的哺乳动物细胞系和生物体中的内源基因。本文展示了一个如何利用CRISPR/Cas9技术研究特定基因突变生物学功能的实例。我们通过向小鼠白细胞介素-3（mIL-3）依赖性前B细胞（Ba/F3）中递送靶向内源CALR基因座的单导向RNA（sgRNA），在骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中发生插入和/或缺失（indel）CALR突变的特定区域建立钙网蛋白（CALR）突变模型。这些sgRNA在靶向区域诱导产生双链断裂（DSBs），并通过非同源末端连接（NHEJ）修复机制形成不同大小的插入缺失突变。随后，我们采用标准的Ba/F3细胞转化实验，以研究生理水平表达的Calr突变对造血细胞转化的影响。该方法可推广至其他基因，用于研究其在多种哺乳动物细胞系中的生物学功能。

本实验旨在通过在内源性Calr基因座中引入插入/缺失（indel）突变，研究其对造血细胞转化的功能影响。采用CRISPR/Cas9系统作为工具，在Ba/F3细胞中构建内源性Calr突变。选择两条sgRNA靶向Calr基因的第9号外显子（图1），该区域是CALR突变型骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中插入和/或缺失（indel）突变的常见发生区域17,18。第一条sgRNA（m1）因其较高的切割效率和理想的脱靶评分而被选用（Table 1）。第二条sgRNA（m2）主要基于其在第9号外显子内的位置被选择，且该区域缺乏其他具备高切割效率和理想脱靶评分的可用sgRNA（Table 1）。在独立的感染实验中分别使用两条不同的sgRNA（m1或m2），以确保所观察到的效应源...

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）是一种原核生物的适应性免疫系统，已被科学家重新利用以……

本实验的总体目标是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。该方法有助于回答血液系统恶性肿瘤研究领域中的关键问题，例如在生理表达水平下驱动突变的生物学功能。该技术的主要优势在于利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对与癌症相关的基因进行建模，并研究其生物学功能。为退火并磷酸化寡核苷酸，将试剂加入PCR管（置于冰上）中，总体积为10微升。在PCR仪中设置程序。循环结束后，用水稀释反应体系。为了消化 lentiGuide-Puro 载体，准备 50 微升的消化反应体系。然后，在 55 摄氏度的加热块中开始消化反应。一小时后，加入额外的 1 微升 BsmB1 限制性内切酶，并继续反应另一小时。为了使切割后的载体骨架去磷酸化，向消化载体中加入7微升磷酸酶反应缓冲液和2微升磷酸酶酶。然后在37摄氏度下孵育30分钟。使用商业化试剂盒纯化已切割并去磷酸化的载体骨架。配制连接反应体系时，将15纳克已消化的载体片段及其他试剂加入置于冰上的PCR管中，并加水调整总体积至10微升。在室温下孵育反应体系1小时。然后取2微升连接产物转化STBL3感受态细胞。然后将菌液涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。随后，将平板在37°C条件下过夜培养。挑取三个菌落并进行接种。对每种培养物进行小量质粒提取，并使用U6启动子区域引物对寡核苷酸插入位点进行测序。在10厘米培养皿中接种hek293t细胞，并过夜培养。为准备转染用的DNA混合物，将45微升转染试剂加入DNA中。用移液器小心混合DNA与转染试剂，并静置20分钟。此后，将DNA转染混合物逐滴加入已接种的细胞中。轻轻摇晃培养板，在5%二氧化碳、37°C条件下培养一天。分别在24小时和48小时后收集含有病毒的上清液，并通过0.22 µm滤器过滤。 将上清液每管1.6毫升分装至每个冻存管中。接下来，吸走上清液，并通过反复吹打数次，用培养基重悬Ba/F3细胞。在六孔组织培养板中加入500微升重悬的细胞、1.5毫升病毒上清液、4微升聚凝胺以及每毫升10纳克的小鼠白细胞介素3。在37摄氏度下，以440 ×g离心板120分钟。离心后，将板转移至含有5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下过夜培养。此后，以440 ×g离心3分钟沉淀细胞。在六孔板中，用5毫升新鲜的温热培养基重悬细胞。为了筛选Cas9感染的细胞，首先离心收集细胞，然后在转导48小时后，将细胞重悬于添加了5微克/毫升杀稻瘟菌素的新鲜温热培养基中。使用杀稻瘟菌素连续筛选细胞九天，直至所有未感染的细胞死亡。然后，将抗性细胞转移至含有每毫升一微克杀稻瘟菌素的培养基中。通过慢病毒感染，将pXPR-011报告构建体转导至亲本细胞以及稳定表达Cas9的细胞中。在感染后48小时，使用每毫升2微克的嘌呤霉素继续筛选细胞，持续三天。利用慢病毒将表达Cas9的细胞与单导向核糖核酸酸（sgRNA）进行感染。随后，在离心感染后48小时，使用每毫升2微克的嘌呤霉素对细胞进行三天的筛选。收集表达外源 Cas9 和目的单链向导核糖核酸的指数生长期 Ba/F3 细胞。吸除上清液，并用 5 毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞。离心沉淀细胞，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次。然后，使用细胞活力分析仪计数细胞数量。随后，在六孔培养板中，每孔加入两毫升不含白细胞介素3的新鲜培养基，将细胞以每组三个重复孔接种。从接种开始，每两天监测并计数细胞一次，持续八天。此处展示的是代表性的流式细胞术数据，表明在亲代Ba/F3细胞和过表达Cas9的Ba/F3细胞中Cas9的活性。在过表达Cas9的Ba/F3细胞中，绿色荧光蛋白信号降低了76%，表明Cas9具有较强的活性；而在亲代Ba/F3细胞中，绿色荧光蛋白信号仍保持在100%。此处还展示了显示钙网蛋白致癌活性的代表性细胞生长曲线。利用m1和m2单导向RNA酶，在钙网蛋白的第9号外显子位点引入了CRISPR/Cas9介导的插入一个碱基对的移码突变。钙网蛋白靶向的Ba/F3血小板生成素受体Cas9细胞的生长曲线显示其可在无小鼠白细胞介素3的条件下独立生长。然而，其他细胞类型的生长曲线均未显示任何细胞因子非依赖性生长。测序结果证实，使用m1和m2单导向RNase对钙网蛋白靶向的Ba/F3血小板生成素受体Cas9细胞中的内源性钙网蛋白第九外显子实现了靶向编辑。插入一个碱基对的移码突变以黑色标示。若操作得当，掌握此技术后可在两周内完成。在尝试该实验流程时，重要的是要理解目的基因中可能引起目标表型的突变类型。完成此操作后，可进一步采用其他方法对突变进行表征，例如研究其在细胞信号传导或蛋白质-蛋白质相互作用中的作用，以更深入地理解该突变导致疾病的具体机制。该技术建立后，为血液学领域的研究人员探索功能获得性突变在生理水平上对Ba/F3造血细胞转化的影响铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在细胞因子依赖性造血细胞中研究功能获得性突变的致癌活性。请注意，使用慢病毒可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，务必采取相应预防措施，例如在生物安全二级及以上（BL2 plus）实验室中操作。

using-crisprcas9-gene-editing-to-investigate-oncogenic-activity

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

利用 CRISPR/Cas9 基因编辑研究细胞因子依赖性造血细胞中突变钙的致癌活性

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本文描述了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）CRISPR-Cas9...

基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。...

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

我们介绍一种将引导RNA通过逆转录病毒转导至Cas9转基因小鼠原代T细胞的实验方案，为研究Th17细胞分化过程中的基因编辑提供了一种高效的替代方法。...

逆转录病毒CRISPR/Cas9介导的基因靶向技术用于体外研究Th17细胞分化

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。...

通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

了解如何利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在细胞因子依赖性造血细胞中建立钙网蛋白突变模型，研究其致癌活性。该方法有助于深入理解驱动突变在血液恶性肿瘤中的生物学功能。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

探索更多视频