利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

本实验的总体目标是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。该方法有助于回答血液系统恶性肿瘤研究领域中的关键问题，例如在生理表达水平下驱动突变的生物学功能。该技术的主要优势在于利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对与癌症相关的基因进行建模，并研究其生物学功能。

为退火并磷酸化寡核苷酸，将试剂加入PCR管（置于冰上）中，总体积为10微升。在PCR仪中设置程序。循环结束后，用水稀释反应体系。

为了消化 lentiGuide-Puro 载体，准备 50 微升的消化反应体系。然后，在 55 摄氏度的加热块中开始消化反应。一小时后，加入额外的 1 微升 BsmB1 限制性内切酶，并继续反应另一小时。

为了使切割后的载体骨架去磷酸化，向消化载体中加入7微升磷酸酶反应缓冲液和2微升磷酸酶酶。然后在37摄氏度下孵育30分钟。使用商业化试剂盒纯化已切割并去磷酸化的载体骨架。

配制连接反应体系时，将15纳克已消化的载体片段及其他试剂加入置于冰上的PCR管中，并加水调整总体积至10微升。在室温下孵育反应体系1小时。然后取2微升连接产物转化STBL3感受态细胞。

然后将菌液涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。随后，将平板在37°C条件下过夜培养。挑取三个菌落并进行接种。

对每种培养物进行小量质粒提取，并使用U6启动子区域引物对寡核苷酸插入位点进行测序。在10厘米培养皿中接种hek293t细胞，并过夜培养。

为准备转染用的DNA混合物，将45微升转染试剂加入DNA中。用移液器小心混合DNA与转染试剂，并静置20分钟。此后，将DNA转染混合物逐滴加入已接种的细胞中。

轻轻摇晃培养板，在5%二氧化碳、37°C条件下培养一天。分别在24小时和48小时后收集含有病毒的上清液，并通过0.22 µm滤器过滤。

将上清液每管1.6毫升分装至每个冻存管中。接下来，吸走上清液，并通过反复吹打数次，用培养基重悬Ba/F3细胞。在六孔组织培养板中加入500微升重悬的细胞、1.5毫升病毒上清液、4微升聚凝胺以及每毫升10纳克的小鼠白细胞介素3。

在37摄氏度下，以440 ×g离心板120分钟。离心后，将板转移至含有5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下过夜培养。此后，以440 ×g离心3分钟沉淀细胞。

在六孔板中，用5毫升新鲜的温热培养基重悬细胞。为了筛选Cas9感染的细胞，首先离心收集细胞，然后在转导48小时后，将细胞重悬于添加了5微克/毫升杀稻瘟菌素的新鲜温热培养基中。

使用杀稻瘟菌素连续筛选细胞九天，直至所有未感染的细胞死亡。然后，将抗性细胞转移至含有每毫升一微克杀稻瘟菌素的培养基中。通过慢病毒感染，将pXPR-011报告构建体转导至亲本细胞以及稳定表达Cas9的细胞中。

在感染后48小时，使用每毫升2微克的嘌呤霉素继续筛选细胞，持续三天。利用慢病毒将表达Cas9的细胞与单导向核糖核酸酸（sgRNA）进行感染。随后，在离心感染后48小时，使用每毫升2微克的嘌呤霉素对细胞进行三天的筛选。

收集表达外源 Cas9 和目的单链向导核糖核酸的指数生长期 Ba/F3 细胞。吸除上清液，并用 5 毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞。离心沉淀细胞，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次。

然后，使用细胞活力分析仪计数细胞数量。随后，在六孔培养板中，每孔加入两毫升不含白细胞介素3的新鲜培养基，将细胞以每组三个重复孔接种。从接种开始，每两天监测并计数细胞一次，持续八天。

此处展示的是代表性的流式细胞术数据，表明在亲代Ba/F3细胞和过表达Cas9的Ba/F3细胞中Cas9的活性。在过表达Cas9的Ba/F3细胞中，绿色荧光蛋白信号降低了76%，表明Cas9具有较强的活性；而在亲代Ba/F3细胞中，绿色荧光蛋白信号仍保持在100%。此处还展示了显示钙网蛋白致癌活性的代表性细胞生长曲线。利用m1和m2单导向RNA酶，在钙网蛋白的第9号外显子位点引入了CRISPR/Cas9介导的插入一个碱基对的移码突变。

钙网蛋白靶向的Ba/F3血小板生成素受体Cas9细胞的生长曲线显示其可在无小鼠白细胞介素3的条件下独立生长。然而，其他细胞类型的生长曲线均未显示任何细胞因子非依赖性生长。测序结果证实，使用m1和m2单导向RNase对钙网蛋白靶向的Ba/F3血小板生成素受体Cas9细胞中的内源性钙网蛋白第九外显子实现了靶向编辑。

插入一个碱基对的移码突变以黑色标示。若操作得当，掌握此技术后可在两周内完成。在尝试该实验流程时，重要的是要理解目的基因中可能引起目标表型的突变类型。

完成此操作后，可进一步采用其他方法对突变进行表征，例如研究其在细胞信号传导或蛋白质-蛋白质相互作用中的作用，以更深入地理解该突变导致疾病的具体机制。该技术建立后，为血液学领域的研究人员探索功能获得性突变在生理水平上对Ba/F3造血细胞转化的影响铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在细胞因子依赖性造血细胞中研究功能获得性突变的致癌活性。

请注意，使用慢病毒可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，务必采取相应预防措施，例如在生物安全二级及以上（BL2 plus）实验室中操作。