提高吞吐量的轰击大麦糊粉层层中基因表达的测定
2018年3月30日
提出了一种改进的协议, 用于测量粒子轰击后大麦糊粉层细胞中的瞬时基因表达。采用全自动谷物研磨与96井板酶检测相结合, 为该过程提供了较高的吞吐量。
该程序的总体目标是在通过粒子轰击将报告基因构建体引入大麦糊粉细胞后测量它们的基因表达。该方法可以帮助回答植物激素调控基因表达中的关键问题，例如特定信号分子如何调节脱落酸进入大麦诱导基因。该技术的主要优点是它提供比以前方法更高的通量，允许测试大量基因构建体和孵育条件。
演示该协议的是我实验室的学生 Grace。首先，将一些无胚颗粒放入装有 20 毫升吸收溶液和 20 微升氯霉素的 90 毫米塑料培养皿的盖子中。使用无菌镊子，轻轻地从每粒谷物上去除透明种皮。
从大麦粒上剥去种皮是一个关键步骤。如果种皮没有完全去除，金微载体将被阻止进入糊粉细胞。但是，如果脱皮太粗暴，糊粉细胞可能会受损。
从所有谷物上剥去种皮后，将它们从培养皿转移到蛭石板上。然后，将去皮的无胚谷物放入 24 摄氏度的培养箱中 16-20 小时。现在，从将包含在轰炸实验中的每个处理中标记一个 1 点 5 毫升的试管。
向每个试管中加入 2 点 5 μg UBI 荧光素酶内部对照质粒、2 点 5 μg GUS 报告质粒和所需量的效应质粒。向每根试管中加入超纯水，使总体积达到 5 微升。对于每次处理，将 50 微升悬浮在 50% 甘油中的微载体添加到每个含有质粒 DNA 的 1 点 5 毫升试管中。
在微载体编码程序的最后一步，将 8 微升悬浮的微载体移液到五个大载体中的每一个上，并让它们风干。通过打开真空泵，打开氦气阀，然后打开粒子输送系统来设置粒子轰击装置。将 1550 psi 爆破片放入固定盖中，并将其安装在颗粒输送系统上。
将含有所需质粒组合的大载体和终止筛选放入微载体启动组件中。将组件插入轰击室的顶部插槽中。接下来，将八个无胚颗粒排列成紧密的放射状图案，较细的一端指向内侧，放在一个压纸圆圈上，该滤纸圆圈用胶带平贴在 90 毫升培养皿的盖子上。
将装有谷物的培养皿放入距离挡风玻璃 6 厘米的轰击室中。关上门并按下真空开关，将轰炸室排空至 95 千帕。快速将真空开关转到保持位置。
然后按住 fire 开关轰击样品。释放真空后，将轰击的颗粒转移到一个标记的 60 毫米培养皿中，该培养皿中含有 4 毫升吸收溶液，每毫升氯霉素 1 毫克。重复此作，直到完成所有轰炸。
然后，将轰炸的谷物在摇动平台上以 100 rpm 的速度在 24 摄氏度下孵育 24 小时。使用镊子从 60 毫米培养皿中取出 8 个轰炸的颗粒，然后在纸巾上吸干。将颗粒分成两个标记的两毫升管，每个管子含有 800 微升研磨缓冲液和一个 5 毫米不锈钢珠。
对所有轰击的谷物重复上一步后，将最多 48 个 2 毫升试管放入珠子均质器的两个机架中。然后将支架安装在均质器上，以 30 赫兹的频率摇动样品 3 分钟。完成后，从均质器中取出样品架，将其放在冰上 5 分钟以重新冷却样品。
现在，将架子以相反的方向安装在均质器上。在 30 赫兹频率下再次摇晃样品 3 分钟。从均质器中取出样品架后，将它们放在冰上 5 分钟以重新冷却样品。
然后，将谷物提取物在 16， 000 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。离心后，立即将澄清的上清液倒入第二组微量离心管中。短暂涡旋每个试管并储存在冰上。
转移上清液后，从沉淀中回收不锈钢珠，以便清洗和重复使用。现在向 96 孔板的每个孔中加入 200 微升 GUS 测定缓冲液。将 50 微升每种谷物提取物放入其中一个孔中，并与移液器吸头混合。
然后，用密封膜密封板的顶部。将 96 孔板置于 37 摄氏度的避光培养箱中 20 小时。孵育后，将 96 孔板在 4， 000 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。
完成后，将盘子放在冰上。现在，将 250 微升零点 2 摩尔碳酸钠添加到黑色 96 孔板的每个孔中。将 6 点、2 5 微升每种离心的 GUS 测定混合物加入黑色板的每个孔中，并与移液器吸头混合。
包括具有 6 点 2 5 微升 10-40 的 100 微摩尔、4 甲基伞形酮作为标准的孔。将黑色板放入板荧光计中。读取甲基伞形酮的荧光设置仪器的增益，使得含有 6 点 2 5 微升 40 微摩尔、4 个甲基伞形酮和 250 微升零点 2 摩尔碳酸钠的孔给出 100 个荧光单位的读数。
在本实验中，将 HVA1 GUS 报告基因构建体与 UBI TaABF1 效应子构建体一起引入糊粉细胞。虽然 TaABF1 HVA1 比率仅为 0 点 0 1 就足以在不存在外源性 absyssic acid 或 ABA 的情况下导致 HVA1 报告基因的三倍诱导。更高水平的 TaABF1 构建体导致 HVA1 表达以剂量依赖性方式逐渐增加。
外源 ABA 和 TaABF1 均可强烈诱导 HVA1 GUS 报告基因构建体的表达。在任何一种情况下，一种丁醇的存在都强烈抑制了 HVA1 诱导，这表明磷脂酶 D 可以在 ABA 通过 TaABF1 激活 HVA1 基因表达中发挥重要作用。ABA 被证明强烈抑制赤霉素诱导的 Amy32b GUS 报告基因构建体的表达。
虽然过氧化氢和硝普钠均未引起任何显着减少。因此，这些结果不支持一氧化氮和过氧化氢在糊粉细胞 ABA 反应中的作用。一旦掌握，该技术就可以在相对较短的时间内测量许多不同的样品的基因表达。
例如，两名调查员可以在几个小时内完成对 200 个不同谷物样本的轰炸。然后，在第二天，一名研究人员可以在两个小时内制备所有蛋白质提取物。在 96 孔板中进行的改良 GUS 测定也比未来试管测定中使用的其他方案需要更少的劳动力。
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概述
本文介绍了一种改进的协议，用于通过粒子轰击测量大麦胚乳细胞中来自报告基因构建体的瞬时基因表达。该方法通过将自动化谷物研磨与96孔板酶测定相结合，提高了通量。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 基因表达
- 生物技术
背景
- 了解基因表达对于研究植物对激素的反应至关重要。
- 大麦胚乳细胞作为研究基因调控的模型。
- 粒子轰击是一种用于将DNA引入植物细胞的技术。
- 需要高通量方法来高效测试多个基因构建体。
研究目的
- 开发一种用于测量大麦胚乳细胞中基因表达的协议。
- 促进脱落酸调控基因的研究。
- 提高测试各种基因构建体和条件的效率。
使用的方法
- 粒子轰击以将报告基因构建体引入细胞。
- 自动化谷物研磨用于样品制备。
- 96孔板酶测定用于高通量分析。
- 使用氯霉素在测定过程中抑制蛋白质合成。
主要结果
- 该协议允许同时测试多个基因构建体。
- 与传统方法相比，实现了更高的通量。
- 成功测量了大麦胚乳细胞中的基因表达水平。
- 获得了对脱落酸诱导基因调控的见解。
结论
- 改进的协议对于研究大麦胚乳细胞中的基因表达是有效的。
- 这种方法可以推进植物激素信号传导的研究。
- 未来的应用可能包括在不同条件下测试各种遗传构建体。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enhances throughput for measuring transient gene expression in plant model systems, supporting early-stage target validation in agricultural biotechnology. By enabling rapid screening of hormone-responsive gene constructs, it aids in mechanistic de-risking of signaling pathways relevant to crop trait development. The scalable approach improves predictive confidence when prioritizing genetic targets for further investigation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hormone-regulated gene expression to validate transcriptional targets like HVA1 in ABA signaling.
- Operational Value: Supports dose-dependent analysis of effector constructs such as TaABF1 to establish transcriptional activation thresholds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative GUS activity readouts via 96-well plate assays for comparative analysis of gene expression across conditions.
- Operational Value: Automated homogenization and plate-based assays increase sample processing capacity, reducing hands-on time per data point.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links phospholipase D activity to ABA-induced gene expression through inhibition studies, offering mechanistic insight into stress response pathways.
- Operational Value: Facilitates cross-condition comparison (e.g., ABA vs. GA) to assess signaling specificity in a reproducible model system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where gene construct screening and pathway validation precede lead identification in trait development pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of transcription factor and hormone interactions in aleurone cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative enzyme assay outputs compatible with multi-condition screening.
- Analytics: Generates fluorescence-based readouts that allow normalization and comparison across samples and treatments.
- Translational Research: Supports continuity from gene expression observation to mechanistic follow-up in plant signaling.
- Enterprise Reuse: Automated grinding and plate-based detection allow reuse across multiple construct libraries and incubation variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target validation through reproducible, dose-responsive gene expression measurements.
- Operational Value: Reduces time per sample via automation and parallel processing, enabling higher experimental density.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by rapidly evaluating construct performance under hormone treatment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic constructs based on expression robustness and pathway specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in particle bombardment and sterile grain handling for successful aleurone cell transformation.
- Depends on access to automated tissue homogenizers and plate-reading fluorometers for standardized assay execution.
- Necessitates cross-team protocol adherence to ensure consistent incubation, extraction, and assay conditions across batches.
- Involves adaptation considerations when extending to other grain species or reporter systems beyond GUS/luciferase.
- Practical limitations include dependency on effective microcarrier delivery and intact aleurone layer viability post-bombardment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Preparation of Barley Grains and Plasmid DNA for Bombardment
2:42
Particle Bombardment of Embryoless Barley Grains
4:42
Extraction of Soluble Protein from the Bombarded Grains
6:24
Measurement of GUS Activity from Grain Extracts
8:15
Results: Measurement of Gene Expression in Barley Aleurone Cells after Particle Bombardment
9:50
Conclusion
