提高通量的基因枪轰击大麦糊粉层基因表达检测

本实验的总体目标是通过基因枪法将报告基因载体导入大麦糊粉细胞后，检测其基因表达水平。该方法有助于解答植物激素调控基因表达领域中的关键问题，例如特定信号分子如何作用于脱落酸，进而调控大麦中相关基因的表达。该技术的主要优势在于通量高于以往方法，可同时检测大量基因载体及不同培养条件下的表达情况。

演示该实验方案的是我实验室的学生Grace。首先，将几粒去胚的谷粒放入一个90毫米塑料培养皿的皿盖中，培养皿内含有20毫升浸润溶液和20微升氯霉素溶液。使用无菌镊子轻轻去除每粒谷粒的透明种皮。

剥离大麦籽粒的种皮是一个关键步骤。如果种皮未完全去除，金微载体将无法进入糊粉层细胞；但如果剥离操作过于剧烈，则可能导致糊粉层细胞受损。

剥去所有谷粒的种皮后，将其从培养皿转移到蛭石板上。然后，将去胚的谷粒置于24摄氏度的培养箱中孵育16至20小时。现在，为将要用于轰击实验的每种处理分别标记一个1.5毫升的离心管。

向每个离心管中加入2.5微克UBI荧光素酶内参对照质粒、2.5微克GUS报告基因质粒以及所需量的效应质粒。向每个离心管中加入超纯水，使总体积达到5微升。对于每种处理，向含有质粒DNA的1.5毫升离心管中加入50微升悬浮于50%甘油中的微载体颗粒。

在微载体编码程序的最后一步，将八微升悬浮微载体分别移液至五个大载体上，并使其自然风干。通过打开真空泵、开启氦气阀门，然后启动粒子递送系统，来设置粒子轰击装置。将一个1550 psi的破裂盘放入固定帽中，并将其安装到粒子递送系统上。

将含有目标质粒组合并带有阻断筛的宏载体放入微载体发射装置中。将该装置插入轰击室顶部的插槽内。接着，将八粒去胚乳的谷粒以紧密的放射状排列，细端朝内，固定在已用胶带平铺于90毫米培养皿盖内的滤纸圆片上。

将盛有颗粒的培养皿放入轰击室中，置于距阻断屏六厘米处。关闭舱门，按下真空开关，使轰击室抽真空至95千帕。迅速将真空开关转至保持位置。

然后按住点火开关以轰击样品。释放真空后，将轰击过的颗粒转移至已标记的、含有4毫升浸润溶液（含1毫克/毫升氯霉素）的60毫米培养皿中。重复上述步骤，直至完成全部轰击处理。

然后，将轰击后的谷粒置于摇床上，在24摄氏度、100 rpm条件下孵育24小时。用镊子将8个轰击后的谷粒从60毫米培养皿中取出，并在纸巾上吸干。将谷粒分装至两个已标记的2毫升离心管中，每管含有800微升研磨缓冲液和一颗5毫米不锈钢研磨珠。

对所有轰击过的颗粒重复上一步骤后，将最多48个2毫升离心管放入珠磨匀浆仪的两个管架中。然后将管架安装到匀浆仪上，以30赫兹振荡样品3分钟。完成后，从匀浆仪上取下管架，并将其置于冰上5分钟，使样品重新冷却。

现在，将样品架以相反方向安装到均质器上。再次以30赫兹频率振荡样品3分钟。从均质器上取下样品架后，将其置于冰上5分钟，使样品重新冷却。

随后，将谷物提取物在 4°C 条件下以 16,000 G 离心 10 分钟。离心后立即把澄清的上清液倒入另一组微量离心管中。每管短暂涡旋振荡后置于冰上保存。

转移上清液后，从沉淀中回收不锈钢珠，以便清洗并重复使用。现在向96孔板的每个孔中加入200 µL GUS检测缓冲液。将每种谷物提取物各50 µL加入其中一个孔中，并用移液器枪头混匀。

然后，用封板膜密封板的顶部。将96孔板置于37摄氏度的黑暗环境中孵育20小时。孵育结束后，在4摄氏度条件下以4,000 G离心10分钟。

实验结束后，将酶标板置于冰上。随后，向黑色96孔板的每个孔中加入250 µL浓度为0.2 mol的碳酸钠溶液。再向黑色板的每个孔中加入6.25 µL经离心的GUS检测反应混合物，并用移液枪头充分混匀。

加入含有6.25 µL 100 µM 10-40以及4-甲基伞形酮作为标准品的孔。将黑色酶标板放入酶标仪中。读取4-甲基伞形酮的荧光值，并调节仪器的增益，使含有6.25 µL 40 µM 4-甲基伞形酮和250 µL 0.2 M碳酸钠的孔的荧光读数为100荧光单位。

在本实验中，将 HVA1 GUS 报告基因载体与 UBI TaABF1 效应子载体共同导入糊粉层细胞。即使在无外源脱落酸（absyssic acid）或 ABA 的情况下，TaABF1 与 HVA1 的比例低至 0.01 即可引起 HVA1 报告基因三倍的诱导表达。随着 TaABF1 载体含量的增加，HVA1 的表达水平随之呈剂量依赖性地逐步增强。

外源ABA和TaABF1均能强烈诱导HVA1 GUS报告基因构建体的表达。在这两种情况下，正丁醇的存在均显著抑制了HVA1的诱导表达，这表明磷脂酶D可能在ABA通过TaABF1激活HVA1基因表达过程中发挥重要作用。ABA被证实可强烈抑制赤霉素诱导的Amy32b GUS报告基因构建体的表达。

尽管过氧化氢和硝普钠均未引起显著降低，因此这些结果不支持一氧化氮和过氧化氢在糊粉细胞ABA反应中发挥作用。一旦掌握该技术，便可在相对较短的时间内对大量不同样品进行基因表达检测。

例如，两名研究人员可在数小时内完成对200个不同谷物样品的轰击处理。随后在第二天，单名研究人员可在两小时内完成所有蛋白质提取物的制备。在96孔板中进行的改良GUS检测，相较于其他使用试管检测的方案，所需的人工操作显著减少。