Name: 提高吞吐量的轰击大麦糊粉层层中基因表达的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 了解利用基因枪轰击大麦糊粉层细胞测定基因表达的高通量方法。本方案结合自动化研磨与96孔板酶活检测，可高效研究脱落酸调控基因及植物激素信号通路。

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作者感谢Greyson Butler和Margaret Barrett在实验实施过程中提供的帮助，感谢Judy Stone对谷物均质化的建议，以及感谢Lynn Hannum对荧光测定法的建议。本工作由美国国家科学基金会（IOB 0443676）资助，由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所的机构发展奖（IDeA）在资助号P20GM0103423下资助，并由科尔比学院自然科学部的资助支持。

1. 效应基因和报告基因载体的构建
<ol>
	<li>构建效应子表达载体，使用组成型启动子（例如玉米泛素启动子 UBI）驱动目标开放阅读框的表达。例如，构建含有 UBI::TaABF1 的质粒，以实现 TaABF1 的强组成型表达5。</li>
	<li>构建报告基因表达载体，将待检测活性的启动子置于报告基因开放阅读框上游，例如 GUS。例如，构建含有 HVA1::GUS 的质粒，用于检测 HVA1 启动子的表达活性2,5。</li>
	<li>构建内参对照表达载体（例如 UBI::luciferase）。</li>
	<li>采用硅胶结合柱法（参见材料表），制备高质量的各所需基因构建质粒。利用紫外分光光度法（参见材料表），精确测定每种质粒制备物的浓度。</li>
</ol>
2. 准备受轰击的大麦籽粒
<ol>
	<li>建立一个电子表格（示例见图1），列出将要进行基因枪轰击的质粒、相应的激素处理以及其他与实验中各处理组相关的必要信息。</li>
	<li>使用砧板和无菌剃刀片，从喜马拉雅大麦籽粒中切下胚（每个处理组准备40粒）。剔除颜色异常或明显小于平均大小的籽粒。</li>
	<li>将所有去胚的籽粒放入一个50 mL离心管中，加入40 mL水，轻轻摇动10分钟。</li>
	<li>小心倒出水分（避免损失籽粒），加入40 mL 10%次氯酸钠溶液，摇动20分钟进行表面消毒。</li>
	<li>倒出次氯酸钠溶液，加入40 mL无菌水，摇动5分钟。重复此无菌水洗涤步骤共五次。</li>
	<li>加入40 mL吸胀液（20 mM琥珀酸钠，20 mM氯化钙，pH 5.0）和40 μL氯霉素储备液（10 mg/mL）。</li>
	<li>将大部分含氯霉素的吸胀液从离心管转移至蛭石板中（见材料表），然后将籽粒转移至蛭石板内湿润滤纸表面，均匀铺开。加入适量吸胀液，使籽粒部分（而非完全）浸没。盖上蛭石板盖子。</li>
	<li>将去胚籽粒在24 °C条件下，于荧光灯照射下孵育约48小时。根据需要补充吸胀液。</li>
	<li>打开一个90 mm塑料培养皿，向皿底加入20 mL吸胀液，向倒置的皿盖中也加入20 mL吸胀液，并分别加入20 μL氯霉素溶液（10 mg/mL）。将两对精细尖头镊子浸入酒精中进行灭菌处理。</li>
	<li>将少量去胚籽粒放入培养皿盖中，用镊子轻轻去除每粒籽粒的（透明）种皮。在剥离籽粒光滑面种皮时，注意不要损伤下方的（糊粉层）细胞。将去皮后的籽粒转移至含有吸胀液的培养皿中。</li>
	<li>完成所有籽粒的种皮剥离后，将其重新放回蛭石板中，在24 °C条件下继续孵育16–20小时。</li>
	<li>在进行基因枪轰击前，将籽粒置于培养皿中的滤纸间轻轻震荡，以去除表面多余水分。</li>
</ol>
3. 基因枪轰击用质粒DNA的制备
<ol>
	<li>为基因枪实验中包含的每种处理标记一个1.5 mL离心管。向每根离心管中加入2.5 µg的UBI::luciferase内参对照质粒、2.5 µg的GUS报告基因质粒，以及所需量（通常为0.025 µg至2.5 µg）的效应质粒。加入水使总体积达到5 µL。</li>
	<li>按照已发表的实验方案6制备1.6 µm金微载体（见材料表）。</li>
	<li>对于每种处理，将50 µL悬浮的微载体加入含有质粒DNA的1.5 mL离心管中。根据生产商的说明书6，使微载体与质粒DNA进行包被。</li>
	<li>在最后一步，当质粒包被的微载体悬浮于48 µL 100%乙醇中时，用移液器将8 μL悬浮液转移至五个宏载体中的每一个上，并使其自然风干。</li>
</ol>
4. 胚乳缺失大麦籽粒的微粒轰击
<ol>
	<li>安装基因枪装置（参见材料表）6。</li>
	<li>将1550 psi的破裂盘放入固定帽中，并将其安装到仪器上。</li>
	<li>将含有目标质粒组合的宏载体（连同阻挡筛）放入微载体发射组件中，再将该组件插入轰击室顶部的插槽。将破裂盘固定帽与宏载体盖之间的距离设为标准距离（6 mm），并将阻挡筛支架置于（标准）中间位置，使宏载体的运动距离为11 mm（图2A）。</li>
	<li>将8粒去胚籽粒紧密地呈放射状排列在滤纸圆片上（较细的一端朝内），并将滤纸用胶带平整固定于90 mm培养皿盖上（参见图2B）。</li>
	<li>将装有籽粒的培养皿放入轰击室中，使其距离阻挡筛6 cm。</li>
	<li>将轰击室抽真空至95 kPa，然后对样品进行轰击。</li>
	<li>释放真空后，将轰击过的籽粒转移至已标记的60 mm培养皿中，其中含有4 mL含1 mg/mL氯霉素的吸胀溶液。</li>
	<li>重复上述步骤，直至完成全部轰击。在24 °C下于摇床（100 rpm）中孵育24小时。</li>
</ol>
5. 从轰击后的谷粒中提取可溶性蛋白
<ol>
	<li>用镊子从60 mm培养皿中取出8个轰击过的籽粒，并用纸巾吸干。将籽粒分成两份，分别放入两个已标记的2.0 mL离心管中（每管4个籽粒），每管中加入800 μL研磨缓冲液（100 mM Na磷酸盐缓冲液，pH 7.2，5 mM DTT，10 µg/mL亮抑蛋白酶肽，20%甘油）和一个5 mm不锈钢研磨珠。对所有轰击过的籽粒重复此操作。</li>
	<li>将最多48个2.0 mL离心管放入珠磨匀浆器的两个支架中（参见材料表）。将支架安装到匀浆器上。</li>
	<li>以30 Hz频率震荡样品3分钟。</li>
	<li>从匀浆器上取下支架，置于冰上（5分钟），使样品重新冷却。</li>
	<li>将支架以相反方向重新装回匀浆器。再次以30 Hz频率震荡样品3分钟。</li>
	<li>将支架放回冰上冷却，然后重复步骤5.3至5.5。总震荡时间累计达到12分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以16,000 x g离心籽粒提取物10分钟。</li>
	<li>离心后立即将澄清的上清液转移至另一组微量离心管中。每管短暂涡旋混匀。将离心管置于冰上保存。</li>
	<li>转移上清液后，从沉淀中回收钢珠，以便清洗后重复使用。</li>
</ol>
6. 从谷物提取物中检测荧光素酶活性
<ol>
	<li>针对每个待检测的谷物提取物样品，准备一支12 mm × 75 mm的玻璃试管，其中含有200 μL荧光素酶检测混合液（45 mM 硫酸Tris，pH 7.7，15 mM MgCl2，20 mM DTT，1.5 mM EDTA，1 mM 荧光素，1 mM ATP）。</li>
	<li>向第一支检测试管中加入100 μL第一个谷物提取物样品，迅速涡旋混匀。立即将试管放入化学发光仪的试管架中并关闭仪器门。当测量完成后，从化学发光仪中取出试管——保持仪器门打开，以便放入下一支试管。</li>
	<li>重复此过程，直至所有样品均完成检测。</li>
</ol>
7. 从籽粒提取物中测定GUS活性
<ol>
	<li>向96孔板的每个孔中加入200 μL GUS检测缓冲液（50 mM Na磷酸盐，pH 7.2，2.5 mM 4-甲基伞形基-β-D-葡萄糖醛酸苷，10 mM DTT，2 mM EDTA，10 µg/mL亮抑蛋白酶肽，20%甲醇，0.02%叠氮化钠）。</li>
	<li>将每种谷物提取物各50 μL加入对应的孔中。加样后用枪头混匀，并用封板膜密封板孔。</li>
	<li>将96孔板在黑暗条件下于37 °C孵育20小时。</li>
	<li>将96孔板在4 °C下以4,000 × g离心10分钟，然后置于冰上。</li>
	<li>向黑色96孔板的每个孔中加入250 μL 0.2 M Na2CO3。</li>
	<li>将每种离心后的GUS检测反应混合物各6.25 μL加入黑色96孔板中对应的孔（含0.2 M Na2CO3）中。加样后用枪头混匀。同时设置标准品孔，分别加入6.25 μL的10 μM、40 μM和100 μM 4-甲基伞形酮溶液。</li>
	<li>将黑色96孔板放入酶标仪中检测甲基伞形酮的荧光强度。激发波长设为360 nm，发射波长设为460 nm。调节仪器增益，使含有6.25 μL 40 μM 4-甲基伞形酮和250 μL 0.2 M Na2CO3的孔荧光读数为1000荧光单位。</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>将荧光素酶和GUS检测的数值输入电子表格中。排除荧光素酶读数低于20,000 相对光单位 s-1 的任何样品，因为这表明基因构建物未能成功递送至糊粉层细胞。</li>
	<li>对于每个成功进行基因枪轰击的谷粒提取物（代表四粒去胚谷粒的组合），根据原始GUS和荧光素酶数据计算标准化的GUS表达量，公式如下：标准化GUS = [(GUS表达量 - GUS空白值) × (2,000,000)] / (荧光素酶表达量 - 荧光素酶空白值)。 
	注：此步骤将GUS活性标准化至相当于荧光素酶读数为2,000,000时的水平。</li>
	<li>通过比较在存在待测效应因子构建物或激素处理条件下与不存在效应因子或激素时特定报告基因构建物的表达水平，报告其相对表达水平。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过粒子轰击法导入效应基因构建体，随后进行报告基因构建体的瞬时表达，是解析特定因子在GA/ABA信号转导及其介导的激素调控基因表达中作用的有效策略。 
然而，目前在大麦糊粉细胞中开展此类实验的已有方案2,3,4,5,6 极为耗时费力。每组轰击后的大麦籽粒均需手工在研钵中研磨匀浆，所得提取物须分别检测GUS和荧光素酶活性。因此，现有方案限制了单次实验中可包含的独立处理组数量，也限制了每种处理所能合理设置的生物学重复次数。这些限制使得在多个处理间进行系统且同步的比较变得更加困难。若不同处理间的基因表达差异较小，则需要相对更多的生物学重复以达到统计学显著性，此类比较将尤为困难。
本文介绍了一种简化的实验流程，该流程部分实现了谷物提取物制备和GUS检测的自动...

大麦糊粉层是研究植物激素调控基因表达的成熟模型系统1。特别是，一些萌发或早期幼苗发育所必需的基因由赤霉素（GA）激活，而与应激反应相关的基因则由脱落酸（ABA）激活。GA和ABA信号通路相互交织，因为某些GA激活的基因的表达可被ABA抑制，反之亦然1。
理解特定因子在GA/ABA信号通路中作用的一个有效策略是通过粒子轰击法导入效应基因构建体，随后瞬时表达报告基因构建体，从而确定其对下游基因表达的影响。使用诸如GUS&#160;（β-葡萄糖醛酸酶）或Luciferase（荧光素酶）等报告基因，可在接收到效应构建体的细胞内实现对基因表达的高灵敏度和定量检测。例如，导入编码转录因子TaABF15,6的效应构建体后发现，TaABF1能够诱导ABA诱导型基因（如HVA1），同时抑制GA诱导型基因（如Amy32b）的表达。作为一种实验策略，粒子轰击法已被多个实验室用于研究GA/ABA信号通路的多个方面。相关研究已鉴定了对GA诱导基因2和ABA诱导基因3激活均具有重要作用的启动子元件，并发现了调控这些基因表达的蛋白激酶4和转录因子5。
现有的关于基因枪轰击及后续瞬时基因表达检测的方案2,3,4,5,6工作量较大，因为每组轰击后的裸麦颗粒需手工在研钵中研磨匀浆，且酶活性测定需逐个进行。本文报道了一种改进的方案，部分实现了匀浆步骤和GUS活性检测的自动化与流程化，显著提高了通量，使得在同一实验中可检测更多处理条件，和/或为每个处理增加更多重复，从而获得更具统计学意义的结果。文中展示了在转录因子TaABF1以及赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）和其他调控分子调控下，HVA1 和 Amy32b 报告基因构建体表达的代表性结果。

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP 质粒大提试剂盒</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>喜马拉雅青稞籽粒</td><td>/</td><td>/</td><td>一种裸粒大麦品种（于4&amp;deg;C避光保存）</td></tr><tr><td>琥珀酸钠</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>吸胀液试剂</td></tr><tr><td>氯化钙（二水合物）</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>吸胀液试剂</td></tr><tr><td>吸胀液</td><td>自制</td><td>/</td><td>20 mM 琥珀酸钠，20 mM 氯化钙，pH 5.0。使用前高压灭菌。</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>用70%乙醇配制10 mg/mL的储存液。</td></tr><tr><td>蛭石</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>用于蛭石平板。</td></tr><tr><td>滤纸圆片（90 mm）</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>用于蛭石平板及轰击前籽粒处理</td></tr><tr><td>蛭石平板</td><td>自制</td><td>/</td><td>将50 mL蛭石加入玻璃培养皿中，在蛭石上放置一张90 mm滤纸圆片，高压灭菌。</td></tr><tr><td>镊子（尖头）</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>用于去除青稞籽粒的种皮。</td></tr><tr><td>镊子（超细尖）</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>用于去除青稞籽粒的种皮。</td></tr><tr><td>金微载体（1.6 &amp;mu;m）</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>宏载体</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（二水合物）</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>配制2.5 M储存液，分装1 mL至离心管中，于-20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>配制100 mM储存液，分装500 &amp;mu;L至离心管中，于-20&amp;deg;C保存（2个月内使用）。</td></tr><tr><td>破裂盘（1550 psi）</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>阻挡筛网</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>宏载体支架</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>基因枪粒子递送系统</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>1M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2 的试剂</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>1M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2 的试剂</td></tr><tr><td>1M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2</td><td>自制</td><td>/</td><td>将6.9 g一水合磷酸二氢钠与7.1 g磷酸氢二钠混合，加水至100 mL，用NaOH调节pH至7.2。</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>溶于水配成1 M溶液，分装1 mL至离心管中，于-20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>溶于水配成10 mg/mL溶液，于-20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>用水配制成50%溶液。</td></tr><tr><td>研磨缓冲液</td><td>自制</td><td>/</td><td>取10 mL 1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，500 &amp;mu;L 1 M DTT，100 &amp;mu;L 10 mg/mL 亮抑蛋白酶肽，40 mL 50%甘油，加水至100 mL。</td></tr><tr><td>不锈钢珠（5 mm）</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>推荐使用此特定型号离心管与均质器配合使用。</td></tr><tr><td>珠磨均质器（TissueLyser）</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12 mm × 75 mm 玻璃试管</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>配制25 mM储存液，分装1 mL至离心管中，于-20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>配制100 mM储存液，分装250 &amp;mu;L至离心管中，于-20&amp;deg;&amp;nbsp;C保存。</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>1M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7 的试剂。</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>1M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7 的试剂。</td></tr><tr><td>1M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7</td><td>自制</td><td>/</td><td>将12.1 g Tris碱溶于100 mL水中，用硫酸调节pH至7.7。</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>溶于水配成2 M溶液。</td></tr><tr><td>荧光素酶检测缓冲液（LAB）</td><td>自制</td><td>/</td><td>取3 mL 1 M Tris硫酸盐缓冲液 pH 7.7，500 &amp;mu;L 2 M 氯化镁，1 mL 1 M DTT，200 &amp;mu;L 0.5 M EDTA，加水至50&amp;nbsp;mL。</td></tr><tr><td>荧光素酶检测混合液</td><td>自制</td><td>/</td><td>取15 mL LAB，800 &amp;mu;L 25 mM 荧光素，200 &amp;mu;L 100 mM ATP，4 mL 水。此配方可制备20&amp;nbsp;mL检测混合液，足够进行100次荧光素酶检测。</td></tr><tr><td>发光仪（Sirius）</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-甲基伞形基-&amp;beta;-D-葡萄糖苷酸（MUG）</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>溶于DMSO配成100 mM溶液。</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>用水配制2%储存液，分装1 mL至离心管中，于-20&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>96孔板（标准）</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS检测缓冲液</td><td>自制</td><td>/</td><td>取2.5 mL MUG，5 mL 1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，400 &amp;mu;L 0.5 M EDTA，1 mL 1 M DTT，100 &amp;mu;L 10 mg/mL 亮抑蛋白酶肽，20 mL 甲醇，1 mL 2% 叠氮化钠，加水至100 mL。</td></tr><tr><td>TempPlate 密封膜</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96孔板（黑色）</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>用水配制成200 mM溶液。</td></tr><tr><td>4-甲基伞形酮</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>用水配制成100 &amp;mu;M溶液，分装1 mL至离心管中，于-20&amp;deg;&amp;nbsp;C冷冻保存。</td></tr><tr><td>微孔板荧光读数仪</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

提高通量的基因枪轰击大麦糊粉层基因表达检测

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

大麦籽粒的糊粉层是研究植物激素调控基因表达的重要模型系统。在糊粉细胞中，赤霉素（GA）可激活萌发或早期幼苗发育所需的基因，而脱落酸（ABA）则激活与应激反应相关的基因。通过粒子轰击法将报告基因构建体导入糊粉细胞，并利用酶活性检测分析瞬时表达水平，可深入探究GA与ABA信号转导机制。本文报道了一种改进的实验方案，部分实现了籽粒匀浆步骤和酶活性检测的自动化与流程化，显著提高了通量，优于现有方法。籽粒样品的匀浆采用自动组织匀浆仪完成，GUS（β-葡萄糖醛酸苷酶）检测则使用96孔板系统进行。采用该方案获得的代表性结果表明，磷脂酶D活性可能通过转录因子TaABF1，在ABA激活HVA1基因表达过程中发挥重要作用。

此处所述技术可用于将任何测试基因构建体导入大麦籽粒的糊粉层细胞中。随后可方便地测定测试基因的表达水平（图2）。本文所述的高通量实验流程显著提高了种子研磨和酶活性检测步骤的效率。该方法已被用于评估转录因子TaABF15,6激活ABA诱导基因HVA17表达的能力。在本研究展示的代表性结果中，将HVA1::GUS报告基因构建体与UBI::TaABF1效应子构建体共同导入糊粉层细胞（图3A）。在无外源ABA存在的情况下，仅需0.01的TaABF1/HVA1比例即可使HVA1报告基因的表达升高3倍；而随着TaABF1构建体用量的增加，HVA1的表达水平进一步逐...

本文介绍了一种改进的实验方案，用于在基因枪轰击后测定大麦糊粉层细胞中报告基因构建体的瞬时表达。通过将自动化谷物研磨与96孔板酶活性检测相结合，显著提高了该方法的通量。

大麦籽粒的糊粉层是研究植物激素调控基因表达的重要模式系统。在糊粉细胞中，某些基因的表达对于……是必需的。

本实验的总体目标是通过基因枪法将报告基因载体导入大麦糊粉细胞后，检测其基因表达水平。该方法有助于解答植物激素调控基因表达领域中的关键问题，例如特定信号分子如何作用于脱落酸，进而调控大麦中相关基因的表达。该技术的主要优势在于通量高于以往方法，可同时检测大量基因载体及不同培养条件下的表达情况。演示该实验方案的是我实验室的学生Grace。首先，将几粒去胚的谷粒放入一个90毫米塑料培养皿的皿盖中，培养皿内含有20毫升浸润溶液和20微升氯霉素溶液。使用无菌镊子轻轻去除每粒谷粒的透明种皮。剥离大麦籽粒的种皮是一个关键步骤。如果种皮未完全去除，金微载体将无法进入糊粉层细胞；但如果剥离操作过于剧烈，则可能导致糊粉层细胞受损。剥去所有谷粒的种皮后，将其从培养皿转移到蛭石板上。然后，将去胚的谷粒置于24摄氏度的培养箱中孵育16至20小时。现在，为将要用于轰击实验的每种处理分别标记一个1.5毫升的离心管。向每个离心管中加入2.5微克UBI荧光素酶内参对照质粒、2.5微克GUS报告基因质粒以及所需量的效应质粒。向每个离心管中加入超纯水，使总体积达到5微升。对于每种处理，向含有质粒DNA的1.5毫升离心管中加入50微升悬浮于50%甘油中的微载体颗粒。在微载体编码程序的最后一步，将八微升悬浮微载体分别移液至五个大载体上，并使其自然风干。通过打开真空泵、开启氦气阀门，然后启动粒子递送系统，来设置粒子轰击装置。将一个1550 psi的破裂盘放入固定帽中，并将其安装到粒子递送系统上。将含有目标质粒组合并带有阻断筛的宏载体放入微载体发射装置中。将该装置插入轰击室顶部的插槽内。接着，将八粒去胚乳的谷粒以紧密的放射状排列，细端朝内，固定在已用胶带平铺于90毫米培养皿盖内的滤纸圆片上。将盛有颗粒的培养皿放入轰击室中，置于距阻断屏六厘米处。关闭舱门，按下真空开关，使轰击室抽真空至95千帕。迅速将真空开关转至保持位置。然后按住点火开关以轰击样品。释放真空后，将轰击过的颗粒转移至已标记的、含有4毫升浸润溶液（含1毫克/毫升氯霉素）的60毫米培养皿中。重复上述步骤，直至完成全部轰击处理。然后，将轰击后的谷粒置于摇床上，在24摄氏度、100 rpm条件下孵育24小时。用镊子将8个轰击后的谷粒从60毫米培养皿中取出，并在纸巾上吸干。将谷粒分装至两个已标记的2毫升离心管中，每管含有800微升研磨缓冲液和一颗5毫米不锈钢研磨珠。对所有轰击过的颗粒重复上一步骤后，将最多48个2毫升离心管放入珠磨匀浆仪的两个管架中。然后将管架安装到匀浆仪上，以30赫兹振荡样品3分钟。完成后，从匀浆仪上取下管架，并将其置于冰上5分钟，使样品重新冷却。现在，将样品架以相反方向安装到均质器上。再次以30赫兹频率振荡样品3分钟。从均质器上取下样品架后，将其置于冰上5分钟，使样品重新冷却。随后，将谷物提取物在 4°C 条件下以 16,000 G 离心 10 分钟。离心后立即把澄清的上清液倒入另一组微量离心管中。每管短暂涡旋振荡后置于冰上保存。转移上清液后，从沉淀中回收不锈钢珠，以便清洗并重复使用。现在向96孔板的每个孔中加入200 µL GUS检测缓冲液。将每种谷物提取物各50 µL加入其中一个孔中，并用移液器枪头混匀。然后，用封板膜密封板的顶部。将96孔板置于37摄氏度的黑暗环境中孵育20小时。孵育结束后，在4摄氏度条件下以4,000 G离心10分钟。实验结束后，将酶标板置于冰上。随后，向黑色96孔板的每个孔中加入250 µL浓度为0.2 mol的碳酸钠溶液。再向黑色板的每个孔中加入6.25 µL经离心的GUS检测反应混合物，并用移液枪头充分混匀。加入含有6.25 µL 100 µM 10-40以及4-甲基伞形酮作为标准品的孔。将黑色酶标板放入酶标仪中。读取4-甲基伞形酮的荧光值，并调节仪器的增益，使含有6.25 µL 40 µM 4-甲基伞形酮和250 µL 0.2 M碳酸钠的孔的荧光读数为100荧光单位。在本实验中，将 HVA1 GUS 报告基因载体与 UBI TaABF1 效应子载体共同导入糊粉层细胞。即使在无外源脱落酸（absyssic acid）或 ABA 的情况下，TaABF1 与 HVA1 的比例低至 0.01 即可引起 HVA1 报告基因三倍的诱导表达。随着 TaABF1 载体含量的增加，HVA1 的表达水平随之呈剂量依赖性地逐步增强。外源ABA和TaABF1均能强烈诱导HVA1 GUS报告基因构建体的表达。在这两种情况下，正丁醇的存在均显著抑制了HVA1的诱导表达，这表明磷脂酶D可能在ABA通过TaABF1激活HVA1基因表达过程中发挥重要作用。ABA被证实可强烈抑制赤霉素诱导的Amy32b GUS报告基因构建体的表达。尽管过氧化氢和硝普钠均未引起显著降低，因此这些结果不支持一氧化氮和过氧化氢在糊粉细胞ABA反应中发挥作用。一旦掌握该技术，便可在相对较短的时间内对大量不同样品进行基因表达检测。例如，两名研究人员可在数小时内完成对200个不同谷物样品的轰击处理。随后在第二天，单名研究人员可在两小时内完成所有蛋白质提取物的制备。在96孔板中进行的改良GUS检测，相较于其他使用试管检测的方案，所需的人工操作显著减少。

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Genetics

遗传学

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