Name: 闪烁表面增强拉曼散射的观测与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 了解闪烁表面增强拉曼散射技术，用于研究银纳米颗粒表面单分子的随机行走行为。该方法可同时观察多个闪烁位点，为固液界面分子动力学提供宝贵数据。

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作者感谢关西学院大学的 Y. Ozaki 教授和日本产业技术综合研究所的 T. Itoh 博士对本工作的有益讨论。本工作得到了日本文部科学省科学研究费补助金（科学研究C类，编号16K05671）的资助。

1. 样品制备
<ol>
	<li>银胶体纳米颗粒的制备20
	<ol>
		<li>为制备银胶体纳米颗粒，将0.030 g硝酸银和0.030 g二水合柠檬酸三钠溶解于200 mL圆底烧瓶中的150 mL水中。</li>
		<li>将烧瓶与回流（Dimroth）冷凝器连接。</li>
		<li>使用磁力搅拌器和搅拌子搅拌烧瓶中的溶液，然后将烧瓶置于油浴中，在150 °C下加热搅拌60分钟。 
		注意：溶液颜色将先变为黄色，随后变为乳灰色。</li>
		<li>将悬浮液在室温下冷却，并用铝箔覆盖烧瓶后置于冰箱中保存。 
		注意：本实验步骤可在此处暂停。胶体纳米颗粒在冰箱中储存后，需在一个月内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多色闪烁发射样品的制备11
	<ol>
		<li>为准备显微镜载玻片，用手以肥皂清洗玻璃片，并用水冲洗干净。</li>
		<li>向玻璃片上加入0.1%聚-L-赖氨酸水溶液，然后用吹风机吹去溶液。</li>
		<li>向玻璃片上加入银胶体悬浮液，然后用吹风机吹去悬浮液。</li>
		<li>使用液体阻断笔在玻璃片上圈出液滴区域。</li>
		<li>在玻璃片上滴加蒸馏水，并用另一片玻璃片覆盖，形成显微镜载玻片，以防止水分蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单色闪烁SERS样品的制备7,8,9,10
	<ol>
		<li>为准备显微镜载玻片，用手以肥皂清洗玻璃片，并用水冲洗干净。</li>
		<li>按体积比2:1:1混合银胶体悬浮液、噻菁或硫羰菁染料（浓度分别为25或4 µM）以及NaCl（10 mM）水溶液。</li>
		<li>将样品悬浮液滴加到玻璃片上，然后用吹风机吹去悬浮液。</li>
		<li>使用液体阻断笔在玻璃片上圈出液滴区域。</li>
		<li>在玻璃片上滴加NaCl（1 M）水溶液，以固定银纳米颗粒，并用另一片玻璃片覆盖，形成显微镜载玻片，防止溶液蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 观察闪烁的银纳米颗粒
<ol>
	<li>样品照明
	<ol>
		<li>将使用方案1.2或1.3制备的样品玻片放置在倒置显微镜的载物台上。</li>
		<li>通过暗场聚光镜使用白光照射样品玻片，并使用物镜（60倍）聚焦玻片上不同颜色的斑点（蓝色、绿色、黄色和红色）。</li>
		<li>通过干涉滤光片，将二极管泵浦固态（DPSS）连续波（cw）激光器发出的衰减光束以相对于样品表面30°的角度照射到样品玻片上。</li>
		<li>为利用激光照明观察银纳米聚集体在同色背景中呈现为单一颜色斑点的现象，将激光照射区域移至视野中心，并通过调节载物台的z方向对准玻片上的斑点进行聚焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>闪烁现象的观察
	<ol>
		<li>在物镜后插入一个长通滤光片，并通过干涉滤光片将二极管泵浦固态（DPSS）连续波（cw）激光束以相对于样品表面30°的角度照射样品玻片。</li>
		<li>通过在x和y方向移动载物台，找到如图1所示的闪烁斑点（另见补充材料中的图S1）。</li>
		<li>使用与冷却式数字电荷耦合器件（CCD）相机连接的倒置显微镜记录闪烁斑点的视频，该相机的时间分辨率为61–120 ms，记录时长为20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 闪烁SERS分析
<ol>
	<li>从视频中提取时间曲线
	<ol>
		<li>在控制CCD相机的软件中，打开视频文件。</li>
		<li>选择闪烁的斑点和暗区时，拖动视频图像中的区域，分别覆盖有斑点和无斑点的区域。</li>
		<li>为了从视频中的闪烁斑点和暗区提取信号强度随时间变化的曲线，选择 时间分析 在 分析，然后单击 计算 在 时间分析 窗口</li>
		<li>将数据保存为文本文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>时间过程分析
	<ol>
		<li>通过减去暗区的时间曲线和/或使用多项式函数拟合来平展时间曲线的基线，如图所示 图2A 和 2B.</li>
		<li>评估由约 2000 个点组成的平均基线强度， I基部以及基线强度的标准差， &#963;,&#160;如图所示 图2C 和 二维.</li>
		<li>通过设定高于阈值的强度来区分亮事件与暗事件 I基底 + 3&#963;,&#160;并记录每个事件的持续时间。在 图3，例如，将 0 到 3.5476 秒的时间段记录为暗事件（持续时间为 t = 3.5476 秒），并记录从 3.5476 到 4.0981 秒的事件为亮事件（持续时间为 t = 0.5505 s）。重复上述操作步骤，如图所示。 表1.</li>
		<li>统计每种持续时间的明亮事件和暗事件的数量，如第一行和第二行所示 表 2.</li>
		<li>将每个持续时间的事件数相加，但持续时间短于该时长的事件除外 t如第二行和第三行所示 表2，例如，对每个持续时间（除特定事件外）的事件数量进行求和 t = 0.0612 秒）作为 41 + 18 + 9 + &#8230;；结果等于以下各项的总和 t = 0.1223 s, 即 103.</li>
		<li>将各总和除以相应的持续时间，并进行归一化处理。如式中所示 表2，例如，按持续时间划分求和 t 将 0.0612 s 除以持续时间 0.0612 s，结果为 3,351.5791。然后，将该结果除以第四行中所有结果的总和 表2概率分布被推导为0.64494。</li>
		<li>绘制亮事件的概率分布图 P在(t）与其持续时间的关系 t 在对数-对数图中，拟合 Log10P在(t) 由 Log10(<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg" />) 以推导幂律指数 &#945;在 针对特定的闪烁点。如果 P在(t）通过拟合得到 <img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg" />，拟合直线在较小数值处偏离了散点图 P开启(t，如虚线所示 图4A.</li>
		<li>绘制暗事件的概率分布 P关闭(t）与其持续时间的关系 t 在对数-对数图中，拟合 Log10P关闭(t) 由 Log10(<img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg" /> 推导幂律指数 &#945;关闭 和截断时间 &#964;&#160;来自同一闪烁点。&#160;如果 P关闭(t）通过拟合得到 <img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg" />，拟合曲线在较小值处偏离了数据点 P关闭(t).</li>
		<li>对视频中的其他闪烁点重复步骤 3.2.1 至 3.2.8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Qian, X. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS%3A+from+fundamental+mechanisms+to+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).</li>
<li>Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+by+surfaced-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).</li>
<li>Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+-a+single-molecule+and+nanoscale+tool+for+bioanalytics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).</li>
<li>Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKitahama%2C+Y+%22Frontiers+of+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%3A+Single-Nanoparticles+and+Single+Cells%22">Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells</a>. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).</li>
<li>Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2016-1245.ot001">Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245)</a>. , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).</li>
<li>Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L%C3%A9vy+Statistics+of+Vibrational+Mode+Fluctuations+of+Single+Molecules+from+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 94, 068303(2005).</li>
<li>Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+analysis+of+surface-plasmon-enhanced+electromagnetic+field+dependence+of+blinking+SERS+of+thiacyanine+or+thiacarbocyanine+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).</li>
<li>Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitation+laser+intensity+dependence+of+blinking+SERRS+of+thiacarbocyanine+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates+by+using+a+power+law+with+an+exponential+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function.</a> Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).</li>
<li>Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp312530j">Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths.</a> J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).</li>
<li>Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+behaviour+of+molecules+in+dark+SERS+state+on+colloidal+Ag+nanoparticles+estimated+by+truncated+power+law+analysis+of+blinking+SERS%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).</li>
<li>Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.5079/abstract">Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law.</a> J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Surface+Enhanced+Resonance+Raman+Spectroscopy+of+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).</li>
<li>Weiss, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp0126863">Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics.</a> J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).</li>
<li>Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examining+the+origins+of+spectral+blinking+in+single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS.</a> Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).</li>
<li>Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+blinking+in+surface+enhanced+resonance+Raman+scattering+and+fluorescence+by+electromagnetic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism.</a> J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).</li>
<li>Willets, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+SERS+hot+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of SERS hot spots.</a> Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).</li>
<li>Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Frequency+Domain+Existence+Proof+of+Single-Molecule+Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).</li>
<li>Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029407000726">Power-law intermittency of single emitters.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).</li>
<li>Tang, J., Marcus, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fluorescence+blinking+in+semiconductor+nanocrystal+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots.</a> J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).</li>
<li>Lee, P. C., Meisel, D. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100214a025?src=recsys">Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols.</a> J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).</li>
<li>Krichevsky, O., Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0034-4885/65/2/203/meta">Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications.</a> Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).</li>
<li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+Chemical+Applications+of+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review.</a> Biochemistry. 41, 697-705 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

表面增强拉曼散射（SERS）来自银纳米聚集体的连接处。因此，我们需要制备纳米聚集体，而非被柠檬酸根阴离子覆盖的胶体纳米颗粒。银聚集体是通过添加聚-L-赖氨酸所引起的盐析效应形成的，聚-L-赖氨酸带有-NH3+，是SERS信号的来源；或者也可通过NaCl提供的Na+阳离子诱导形成，如补充材料中的图S2所示。此外，为了照亮大范围内的多个位点，激光束以相对于样品表面30°的角度，通过一个未连接至显微镜的透镜进行非聚焦照射。这种方法可能导致观察区域未被充分照亮。我们通过调节并移动激光照射区域，以高倍率照亮目标观察区域。经过此优化后，可在同色背景中观察到颜色单一的亮点。这些步骤对于实现SERS闪烁现象的观察至关重要。
此处将讨论幂律分析中需注意的事项。首先，用于定义亮态与暗态事件的阈值会影响闪烁分析。当阈值提高时，幂律指数与截断时间往往也随之增加。4,5,...

表面增强拉曼散射（SERS）是一种基于贵金属表面的高灵敏度拉曼光谱技术。由于拉曼光谱能够根据分子中官能团振动模式产生的尖锐峰位提供详细的分子结构信息，因此可通过SERS研究吸附在金属表面上的单个分子的信息1,2,3。在单分子水平下，当吸附质位于银纳米聚集体上时，可观察到闪烁信号1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16，同时光谱也会发生波动1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。这种闪烁现象可能是由于单个分子在纳米尺度的银纳米聚集体结点处随机进出增强的电磁（EM）场而引起的。因此，与利用SERS强度的泊松分布或双分析物方法相比，闪烁被视为单分子检测的更直接证据2,3,17。然而，关于闪烁及光谱波动的详细机制——这些机制可能强烈依赖于分子在Ag表面的行为——目前仍存在争议。
在以往的研究中，人们利用自相关函数分析闪烁表面增强拉曼散射（SERS）现象，该函数可计算分子在增强电磁场中进出运动的扩散系数和浓度12,13,14。此外，还从信号的时间轮廓中推导出一种归一化的标准差评分，用于表征总强度的不稳定性15。然而，这些分析方法可能仅基于少数分子的行为。相比之下，在闪烁SERS的超分辨率成像中，可以识别单个分子在增强电磁场中的行为16。但这些技术仅能在增强电磁场内获取相关参数。单个分子在较大范围内的随机行为（例如在闪烁SERS中）可用幂律而非平均值来描述4,5,6,7,8,9,10,11，这类似于单个半导体量子点（QD）产生的闪烁荧光现象18,19。通过采用幂律分析方法4,5,6,7,8,9,10,11，可估算分子在亮态（即处于增强电磁场中）和暗态下的行为10；也就是说，可以估算分子在整个银表面的行为特征。
该技术使用银胶体纳米聚集体4,5,6,7,8,9,10,11。这些纳米聚集体表现出多种局域表面等离子体共振（LSPR）谱带，当在特定波长激发时，会显著影响增强的电磁场。因此，具有表面增强拉曼散射（SERS）活性的银纳米粒子以胶体悬浮液形式存在，可立即获得部分数据。对于具有特定尺寸、形状和排列的简单纳米结构，SERS闪烁现象对LSPR的依赖性可能掩盖其他依赖关系7；即，若所用纳米结构对LSPR响应良好或不良，则相关参数保持恒定，从而导致其他依赖性被掩盖。已有研究采用幂律分析方法，揭示了银胶体纳米聚集体SERS闪烁现象的多种依赖关系4,5,6,7,8,9,10,11。

<table><tbody><tr><td>硝酸银，99.8%</td><td>Wako</td><td>194-00832</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠二水合物，99.%</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸水溶液，0.1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二磺丙基硫菁三乙胺盐</td><td>林原生物化学研究所</td><td>NK-2703</td><td>一种硫菁染料</td></tr><tr><td>3,3'-二乙基-5,5'-二氯-9-甲基硫碳菁碘化物</td><td>林原生物化学研究所</td><td>SMP-9</td><td>一种硫碳菁染料</td></tr><tr><td>氯化钠，99.5%</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Dimroth 冷凝管</td><td>Iwaki</td><td>61-9722-22</td><td>购自 AS ONE</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Corning</td><td>DC-420D</td><td></td></tr><tr><td>油浴锅</td><td>Advantech</td><td>OS-220</td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片</td><td>Matsunami</td><td>S-1112</td><td>显微镜载玻片</td></tr><tr><td>吹气器</td><td>Hozan</td><td>Z-288</td><td>空气除尘器</td></tr><tr><td>液体阻断笔</td><td>大同产业</td><td></td><td>LIQUID BLOCKER（Super Pap Pen）。即用型疏水屏障笔，专为免疫组织化学应用设计</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX-70</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>LCPlanFl 60&amp;times;</td><td>NA 0.7</td></tr><tr><td>暗场聚光镜</td><td>Olympus</td><td>U-DCD</td><td>NA 0.8&amp;ndash;0.92</td></tr><tr><td>制冷数字CCD相机</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-AG</td><td>由Aqua Cosmos软件控制</td></tr><tr><td>制冷数字CCD相机配套软件</td><td>Hamamatsu</td><td>AquaCosmos</td><td>也用于从视频中闪烁斑点提取时间轨迹&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>彩色CCD相机</td><td>ELMO</td><td>TNC-C920</td><td>不用于分析</td></tr><tr><td>DPSS激光器</td><td>RGB激光系统</td><td>NovaPro532-75</td><td>&amp;lambda; = 532 nm;&lt;br/&gt; 60 mW（对应功率密度为600 W/cm²）</td></tr><tr><td>干涉滤光片</td><td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td></td></tr><tr><td>长通滤光片</td><td>Semrock</td><td>BLP01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>用于区分和计数亮/暗事件的软件</td><td>自制</td><td></td><td>使用C++编程开发</td></tr><tr><td>用于幂律拟合的软件</td><td>LightStone</td><td>Origin6.1</td><td></td></tr></tbody></table>

表面增强拉曼散射闪烁现象的观察与分析

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

在银纳米团簇的结点处，从单个分子观测到闪烁的表面增强拉曼散射（SERS）。本文介绍了一种制备具有SERS活性的银纳米团簇、记录显微图像中特定闪烁点的视频以及分析闪烁统计特性的实验方案。在该分析中，亮态事件持续时间的概率分布可用幂律函数拟合。暗态事件的概率分布则通过幂律与指数函数的组合进行拟合。幂律参数反映了分子在亮态和暗态下的行为特征。此外，可据此估算分子的随机行走模型及其在整块银表面的运动速度。然而，即使采用平均值、自相关函数以及超分辨SERS成像方法，准确估算仍具有挑战性。未来应将幂律分析与光谱成像相结合，因为仅靠该分析方法尚无法确认闪烁现象的起源。

由1.2方案制备的聚-L-赖氨酸修饰的银纳米聚集体中，可观察到表面增强拉曼散射（SERS）和表面增强荧光产生的多色闪烁斑点，如图111所示。相比之下，由1.3方案制备的含染料分子的银纳米聚集体仅观察到单一颜色的SERS闪烁斑点7,8,9,10。存在两类“阴性”结果：连续发光的结果，或未观察到SERS的结果。前者和后者可能分别由胶体银表面分子浓度过高或过低所致。
单个银纳米聚集体在不同时刻显示出不同的信号强度，如图2B<...

本方案描述了利用幂律分析单个分子在银表面上随机移动所导致的闪烁表面增强拉曼散射现象。

在单个银纳米团簇结处的单分子上，观察到闪烁的表面增强拉曼散射（SERS）。本文介绍了一种……的实验方案。

本研究中闪烁表面增强拉曼散射分析的总体目标是探究单个分子在金属纳米颗粒表面的行为。该方法有助于回答界面科学和胶体科学中关于固-液界面工作行为的关键问题。该技术的主要优势在于能够收集大量数据，因为在单个视频中可同时观测到约十几个闪烁位点。开始此实验步骤时，先用液体洗涤剂和自来水清洗两片玻璃显微镜载玻片。用蒸馏水冲洗载玻片，并使其自然晾干。接着，将0.1%的聚-L-赖氨酸水溶液滴加到一张干燥的载玻片上。让溶液在载玻片上静置2至3秒。然后，使用压缩空气吹风机去除多余的溶液并干燥载玻片。接着，将胶体银纳米颗粒悬浮液滴加到载玻片上。让悬浮液静置两到三秒钟。用压缩空气吹干载玻片。然后使用疏水屏障笔在载玻片上完全圈出一个26毫米×26毫米的区域。待屏障干燥。将蒸馏水滴加到载玻片上，以充满封闭区域。用第二块洁净干燥的玻璃盖玻片覆盖载玻片，防止水分蒸发。将载玻片组件放置在倒置显微镜的样品台上。使用暗场聚光镜通过白光照射载玻片。通过从2倍物镜切换至60倍物镜，聚焦于不同颜色的光点。接下来，使用二极管泵浦固态连续波532纳米激光器、带通干涉滤光片和透镜，以相对于样品表面30度的角度，用衰减后的光束照射样品。将激光照明移至视野中心，并轻微调整样品台的 z 方向，以优化对斑点的聚焦。在均匀背景上观察聚集体，表现为单色斑点。接着，关闭激光，并在物镜后插入长波通边缘滤光片。通过干涉滤光片和外部透镜，以相对于样品表面30度的角度用激光照射样品。在x和y方向上移动载物台以寻找闪烁的斑点。然后，使用帧时为61至120毫秒的深度冷却数字CCD相机，采集持续20分钟的斑点视频。开始分析时，在CCD相机软件中打开已获取的视频。单击并拖动以选择含有闪烁点和不含闪烁点的区域。进行时间分析，以获得这些点和暗区的信号强度随时间变化的曲线。以这种方式获取所有闪烁点和感兴趣的暗区的轮廓。然后，根据亮态和暗态事件的持续时间生成其概率分布。在使用聚-L-赖氨酸包被载玻片制备的银纳米聚集体的表面增强拉曼散射（SERS）中，观察到多色闪烁点。闪烁信号归因于银纳米聚集体连接处单个分子的随机运动。单个纳米聚集体的信号在时间上表现出强度变化，这与量子点的闪烁荧光不同。明亮事件的阈值设定为基线强度以上三个标准差，每个位点的明亮和暗淡事件持续时间均被确定。将亮态事件的概率分布对事件持续时间作图，分别以直线和双对数图表示；而暗态事件的概率分布则对持续时间以曲线形式作图。由于暗态事件的持续时间通常长于亮态事件，亮态事件的幂律指数往往小于暗态事件。暗态事件较短的截断时间表明分子随机运动更快，或从非发射态到发射态的能量势垒更高，或二者兼而有之。观看本视频后，您应能充分理解如何观察和分析闪烁表面增强拉曼散射（SERS）现象。

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闪烁表面增强拉曼散射的观测与分析

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共振与自发拉曼显微光谱中荧光背景的抑制

来源： Espinoza, R., et al．利用实时双色受激拉曼散射成像技术对小鼠脑组织进行组织学诊断． J. Vis. Exp. (2022)．...

双色受激拉曼散射成像小鼠脑组织

我们描述了纳米生物系统的制备与表征，该系统将纳米结构基底与固定化的蛋白质和适配体进行界面结合。文中报道了涉及纳米结构基底的光刻制备、生物功能化以及表面增强拉曼光谱（SERS）表征等相关实验步骤。展示了对表面固定化蛋白质的SERS检测，以及对蛋白质-配体和适配体-配体结合相互作用的探测。...

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我们描述了一种快速连续波受激布里渊散射（CW-SBS）光谱仪的构建方法。该光谱仪采用单频二极管激光器和原子蒸气陷波滤光片，能够以比现有CW-SBS光谱仪快达100倍的速度，对浑浊或非浑浊样品进行高光谱分辨率的透射光谱测量。这一改进实现了高速布里渊材料分析。<br...

用于材料分析的高速连续波受激布里渊散射光谱仪

本文描述了一种通过将受激拉曼散射（SRS）实验装置与激光扫描显微镜集成而实现的受激拉曼散射显微镜。该SRS显微镜基于两束飞秒（fs）激光光源，分别为钛宝石（Ti:Sa）激光器和同步的光学参量振荡器（OPO）。...

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受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

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基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

基于紧凑且超稳定的双折射干涉仪的宽场傅里叶变换显微镜，可对二维探测器的所有像素并行采集光谱。该时域方法能够分离光致发光信号与拉曼信号，并实现快速拉曼成像（约5毫秒/像素），空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23...

一种多模态宽场傅里叶变换拉曼显微镜

本文介绍了一种利用无标记表面增强拉曼光谱法（SERS）分析单个小细胞外囊泡（sEVs）的实验方案，该方法可实现疾病无创诊断，并评估sEVs作为治疗递送载体的应用潜力。...

探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

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表面增强拉曼散射闪烁现象的观察与分析

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