职业环境中空气样本的采集与真菌DNA提取分析

本空气采样与DNA提取方法的总体目标是获得可扩增、测序并进行分类学定位的真菌基因组DNA，以识别职业环境中潜在的真菌危害。该方法有助于回答职业暴露评估领域中的关键问题，例如，工作人员所接触的哪些真菌危害可能导致不良健康效应。该技术的主要优势在于，利用培养或显微镜检测方法难以发现的真菌种类，可通过基于测序的方法得以明确鉴定。

组装空气采样滤膜盒时，先将一个纤维素滤膜支撑垫放置在底座网格面上，然后借助滤膜镊子将滤膜置于支撑垫上方，确保采集面朝上。组装完成后，插入延伸护罩，并使用手动或气动压机将其均匀而紧密地压紧，以密封滤膜盒。随后，将组装好的滤膜盒安装到 NIOSH 气溶胶采样器顶部，并尽可能向下按压。

使用一段19毫米宽的胶带缠绕滤膜盒外部，并将滤膜盒固定在采样器上，作为备用密封措施以防止泄漏。将收集管紧密且完全地旋入采样器中，直至完全旋紧，并用密封胶带缠绕管口，作为防止泄漏的第二道密封。进行个体气溶胶采样时，应将采样器置于人员的呼吸区域内。

将采样器固定在受试者的翻领、肩部或胸部，同时将采样泵置于腰部或背在背包中。启动采样泵，并在一分钟后检查其是否正常运行。完成空气采样后，从受试者身上取回空气采样器。

取下密封胶带，拧开管子，然后盖上盖子。将第三片滤膜盒放在滤膜上。首先，用70%乙醇擦拭采样盒，然后在II级生物安全柜内操作，使用滤膜盒开启工具打开采样盒。

接着，使用滤膜提举器将支撑垫和滤膜向上提起。然后用滤膜镊子取出滤膜，放入无菌培养皿中。用灭菌的手术刀将滤膜切成六个相等的部分，随后放入含有300毫克200至500微米玻璃珠的2毫升加强管中。

将含有滤膜的离心管浸入液氮中30秒，然后迅速放入珠磨式均质仪中，以每秒4.5米的速度处理30秒。向含有剩余完整滤膜小片的离心管中加入0.5毫升裂解缓冲液，再向15毫升和1.5毫升空气采样收集管中各加入0.3毫升裂解缓冲液，分别在直立和倒置位置涡旋震荡10至15秒。将每个收集管中的裂解缓冲液转移至含有300毫克玻璃珠的2毫升加强型离心管中。

将离心管放入珠磨机均质器中处理30秒，然后在22摄氏度下以20,000 ×g离心1分钟。离心后，将上清液转移至无菌的1.5毫升微量离心管中，再次在22摄氏度下以20,000 ×g离心1分钟。加入30微升裂解试剂后，将离心管在37摄氏度下孵育15分钟。

然后，向离心管中加入 0.2 毫升结合缓冲液和终浓度为 100 微克/毫升的蛋白酶 K，将离心管置于 70 摄氏度的金属浴中孵育 10 分钟。最后，向每个离心管中加入 100 微升异丙醇。接着，将容量为 700 微升的玻璃纤维滤膜离心管放入 2 毫升收集管中，并将提取液转移至其中。

转移后，在22摄氏度下以20,000 × g离心收集管30秒。离心结束后，将玻璃纤维滤膜插入新的收集管中，并弃去原收集管。向每根收集管中加入0.5 mL抑制剂去除缓冲液，在22摄氏度下以20,000 × g再次离心30秒。

离心后弃去收集管，将滤管放入新的收集管中。然后，向每个管中加入0.5毫升洗涤缓冲液，并在22摄氏度下以20,000 × g离心30秒。离心后弃去收集管，更换为新的收集管。

再次向每个离心管中加入 0.5 毫升洗涤缓冲液，在 22 摄氏度下以 20,000 ×g 离心 30 秒。为去除残留的洗涤缓冲液，最后将收集管在 22 摄氏度下以 20,000 ×g 离心 1 分钟，弃去收集管并更换为新的收集管。加入 100 微升预热的洗脱缓冲液后，将离心管置于实验台室温下孵育 1 至 2 分钟，然后在 22 摄氏度下以 20,000 ×g 离心 30 秒。

将滤管放入无菌的1.5毫升微量离心管中，并将洗脱液再次进行一轮离心。使用0.5毫升PCR管，每管加入5微升已提取的DNA，设置50微升反应体系，每个样本设三个重复，然后设定PCR仪程序并开始扩增循环。将三个PCR反应产物全部混合至无菌的1.5毫升微量离心管中。

加入750 µL结合缓冲液，通过上下吹打10次充分混匀。将混合液总量的450 µL加入置于收集管中的离心柱，于17,900 × g离心30秒，随后弃去滤液，再将剩余的450 µL混合液加入，进行第二轮离心。再次弃去滤液，向离心柱中加入750 µL洗涤缓冲液，于22 °C下以17,900 × g离心30秒。

最后，弃去滤液，将空的层析柱在22°C下以17,900 × g离心1分钟。将离心柱转移至1.5毫升无菌微量离心管中，加入45 µL洗脱缓冲液，在室温下于实验台孵育5分钟。然后，在22°C下以17,900 × g离心1分钟。

将1%琼脂糖凝胶浸入电泳槽中的一倍TAE缓冲液中，然后将2微升五倍上样缓冲液与8微升扩增的DNA混合。最后，将全部10微升样品连同DNA Marker一起上样到凝胶中。以75伏电压电泳约90分钟。

一个典型的琼脂糖凝胶电泳图显示了从职业空气样本中提取的真菌基因组DNA的内转录间隔区的扩增结果。最左侧的泳道为DNA标记物泳道。右侧的条带代表从不同职业空气样本中扩增出的内转录间隔区，其大小范围为750至1,000个碱基对。

一个典型的Krona图表展示了室内环境中多种分类学上的真菌物种的存在情况。在家庭环境中，使用NIOSH生物气溶胶旋风采样器采集生物气溶胶一小时，以确定存在的真菌物种。表格数据表示室内环境中真菌物种的多样性与丰富度指数。

数据显示，空调环境和蒸发式冷却器环境中的Chao-1丰富度指数、Shannon多样性指数以及Bray-Curtis相异性系数更高。观看本视频后，您应能够充分了解如何采集室内和职业环境中的空气样本，并提取基因组DNA以分析微生物群落。在进行该操作时，重要的是务必采用最佳的无菌技术，以防止样本受到微生物污染。