Name: 从前期到中期二期小鼠卵母细胞进展的染色质传播制剂分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学习小鼠卵母细胞染色质传播制剂技术，用于可视化染色质结合蛋白动态定位与染色体形态变化。该方法结合免疫标记技术，可评估卵母细胞倍性并揭示减数分裂染色体分离机制，为研究生殖生物学和女性不育症提供重要工具。

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本工作获得了NIGMS（R01GM11755）向P.W.J.提供的资助，以及美国国家癌症研究所（NIH）（CA009110）向G.H.和J.H.提供的培训项目博士后奖学金支持。

本文所述所有方法均经约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验在野生型 C57BL/6J 小鼠上进行。
1. 胎儿或新生卵巢的采集及前期染色质铺片的制备
<ol>
	<li>根据IACUC指南，通过颈椎脱位或CO2窒息法处死交配后14.5–19.5天（dpc）的怀孕雌鼠以获取胚胎。 
	注意：对于出生后第1–5天的卵巢，跳至步骤1.3。图1总结了在不同胚胎期和出生后阶段富集的减数分裂前期各阶段。</li>
	<li>使用无菌剪刀打开腹盆腔，形成V形切口。分离母体子宫角，将胚胎与胎盘分开，并将胚胎转移至含有3 mL预热至37 °C的1×磷酸盐缓冲液（PBS）的35 mm培养皿中。 
	注意：可使用设定为37 °C的翻盖式培养箱维持温度。此外，也可使用温控玻璃载物台在卵巢操作过程中保持温度。</li>
	<li>根据IACUC指南，使用3.5英寸外科剪刀通过断头法处死胚胎或仔鼠。将断头后的胚胎或仔鼠置于预热的PBS中，以备进一步解剖。</li>
	<li>每次在一个含有3 mL预热至37 °C的PBS的独立35 mm培养皿中解剖一个胚胎或仔鼠。沿胚胎后半部分的腹侧中线、前肢下方的前半部分以及后肢和尾部正上方进行剪切，如图2A–B所示。</li>
	<li>使用3.5英寸外科剪刀打开腹腔。用尖头镊子移开或去除肝脏和肠袢，在含有3 mL预热至37 °C的PBS的新35 mm培养皿中暴露卵巢（见图2B中的示意图）。卵巢位于肾脏下方和后方，靠近腹膜腔后壁（图2B–C）。图2D提供了区分雄性和雌性性腺的参考指南。 
	注意：为获得最佳条件，应在处死怀孕雌鼠后迅速解剖取出卵巢。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用一对尖头镊子从每只雌性胎儿中取出双侧卵巢，并将其置于表面皿或含0.5至1.0 mL预热PBS的多孔板的独立孔中，于37 °C维持。</li>
	<li>将每对卵巢放入0.5 mL低渗提取缓冲液（17 mM 柠檬酸三钠二水合物、50 mM 蔗糖、5 mM EDTA、0.5 mM DTT、30 mM Tris-HCl、蛋白酶抑制剂，pH 8.2）中，置于洁净的表面皿或9孔板的小孔内，确保卵巢完全浸没。孵育至少15分钟，但不超过30分钟。 
	注意：低渗提取缓冲液需新鲜配制，并在加入DTT后2小时内使用。</li>
	<li>在孵育期间，使用疏水屏障PAP笔在洁净的25 × 75 mm2、厚1 mm的玻璃载玻片上绘制两个22 × 22 mm2的方格，如图3A所示。 
	注意：载玻片可提前准备。</li>
	<li>用移液器将45–50 µL 100 mM蔗糖溶液滴加到洁净的载玻片上，并将一对卵巢转移至液滴中。</li>
	<li>使用两根27 G针头的尖端将卵巢轻轻撕开，使细胞释放到蔗糖溶液中。用镊子去除较大的卵巢组织碎片，并小心吹打蔗糖溶液以分散细胞。</li>
	<li>将40 µL固定液（1%多聚甲醛（PFA）、0.2%去垢剂（见材料表），pH 9.2）加入已准备好的载玻片上的每个方格中。使用200 µL移液器吸头将固定液均匀铺展在载玻片表面。</li>
	<li>将蔗糖混合液20 µL滴加到含固定液的载玻片每个方格中。 
	注意：相当于每张载玻片使用一对卵巢。</li>
	<li>将载玻片置于密闭湿盒中，在室温下过夜孵育。 
	注意：过夜孵育时间可在室温下维持约12–15小时。</li>
	<li>打开湿盒盖子，让载玻片完全自然干燥。</li>
	<li>将载玻片在含有50 mL 0.4%润湿剂-PBS溶液（见材料表）的考普林染色缸中洗涤2分钟，晾干后进入免疫标记实验流程（步骤6）。 
	注意：载玻片可能可在-80 °C保存以备后续使用，但保存效果因目标蛋白而异。为获得最佳结果，建议立即进行免疫标记实验流程（步骤6）。</li>
</ol>
2. 中期I卵母细胞的收集
<ol>
	<li>为了最大化从小鼠中分离的窦状卵泡数量，对性成熟但未交配的雌性小鼠腹腔注射5 IU的孕马血清促性腺激素（PMSG，也称为马绒毛膜促性腺激素eCG）。 
	注意：为获得最佳卵母细胞产量，应使用1至3月龄的小鼠，因为随着年龄增长，收获的卵母细胞数量会减少。配制PMSG时，将5,000 IU的PMSG溶于100 mL无菌PBS中（浓度为5 U/0.1 mL），分装成每份600 µL的单次使用 aliquot，于-20 °C保存。</li>
	<li>44–48小时后，准备收集培养基，即添加了5%胎牛血清（FBS）和3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的最低必需培养基α（MEMα）（MEMα/BSA/FBS）。使用0.2 µm孔径滤器对培养基进行灭菌。将2.5 mL MEMα/BSA/FBS培养基分装至每只小鼠对应的玻璃培养皿中，并在5% CO2培养箱中预热至37 °C。 
	注意：其他 commercially available 的收集和培养基（如M2和M16）也常被使用。 
	警告：建议每次仅从5% CO2培养箱中取出一个培养皿，并尽量缩短操作时间，以减少环境空气暴露。</li>
	<li>根据IACUC指南，通过颈椎脱位或CO2窒息法处死小鼠。</li>
	<li>使用无菌剪刀打开腹盆腔，做一个较大的V形切口。用镊子将肠道推向小鼠头部方向。找到每侧子宫角；卵巢位于靠近肋骨的位置。用精细镊子夹住输卵管，用解剖剪剪除卵巢上方的脂肪组织（图4）。继续夹住输卵管，用另一把精细镊子将卵巢从包膜中分离，并放入含有MEMα/BSA/FBS培养基的收集皿中。 
	注意：与步骤1相同，必须将卵巢保持在37 °C，并维持5% CO2环境。可使用连接5% CO2混合气体的翻盖式培养箱，以最佳维持温度和CO2水平。此外，在操作卵母细胞期间，还应使用温度可控的玻璃载物台以维持温度。</li>
	<li>使用带有27号针头（或类似尺寸）的1 mL注射器，手动穿刺大窦状卵泡，释放卵丘-卵母细胞复合体。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察，使用口控玻璃移液管或毛细管，或手动操作的微米级注射器收集GV期卵母细胞（图5）。仅收集从窦状卵泡中释放出的卵母细胞。GV期卵母细胞直径约为90 µm，可能被2–3层颗粒细胞包围，总直径约为200 µm。</li>
	<li>将卵母细胞置于含有MEMα/BSA/FBS培养基的洁净培养皿或9孔板中，在37 °C、5% CO2培养箱中培养6小时，使其发育至第一次减数分裂中期（MI期）。</li>
	<li>继续进行步骤4。</li>
</ol>
3. 中期II（MII）卵母细胞的收集
<ol>
	<li>为最大化每只小鼠分离的卵母细胞数量，对性成熟未交配的雌性小鼠腹腔注射 5 IU 的 PMSG。44–48 小时后，再腹腔注射 5 IU 的人绒毛膜促性腺激素（hCG）。 
	注意：为获得最佳卵母细胞产量，小鼠年龄应为 1 至 3 个月，因为随着年龄增长，所收获卵母细胞的数量会减少。配制 hCG 时，将一瓶 10,000 U 的 hCG 溶解于 200 mL PBS 中（5 U/0.1 mL），分装为 600 µL 单次使用量，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>12–14 小时后，按上述步骤 2.2 所述方法配制 MEMα/BSA/FBS 收集培养基。</li>
	<li>根据 IACUC 指南，通过颈椎脱位或 CO2 窒息法处死小鼠。</li>
	<li>使用无菌剪刀打开腹盆腔，形成一个较大的 V 形切口。用镊子将肠道推向小鼠头部方向，找到每侧子宫角，卵巢位于靠近肋骨笼的近端位置。用精细镊子夹住输卵管，用解剖剪剪除卵巢上方的脂肪组织（图 4）。随后将卵巢和输卵管取出，放入含有 MEMα/BSA/FBS 培养基的收集皿中。 
	注意：与步骤 1 和 2 相同，必须将卵巢保持在 37 °C，并维持 5% CO2 环境。可使用连接 5% CO2 混合气体的翻盖式培养箱，以最佳维持温度和 CO2 水平。此外，在操作卵母细胞过程中，还应使用温度可控的玻璃载物台以维持温度。</li>
	<li>使用带有 27 G（或类似规格）针头的 1 mL 注射器或锋利镊子，在输卵管壶腹部撕开一个小孔，以释放 MII 期卵母细胞。 
	注意：操作时需小心，避免损伤壶腹部内的卵母细胞。壶腹部外观呈肿胀且半透明状，卵母细胞可见（图 4）。</li>
	<li>使用口控玻璃移液管、毛细管或手动微量注射器，将输卵管壶腹部中的 MII 期卵母细胞收集至含有收集培养基的新培养皿中（图 5）。</li>
	<li>继续进行步骤 4。</li>
</ol>
4. 卵母细胞去丘和透明带去除
<ol>
	<li>在表面皿中配制含3 mg/mL BSA的MEMα培养基，并加入透明质酸酶至终浓度为300 IU/mL，用于去除卵母细胞周围的卵丘细胞（每只小鼠2.5 mL），置于37 °C、5% CO2条件下保存。 
	注意：透明质酸酶在配制1小时后活性显著下降。对于MII期卵母细胞，无需进行透明质酸酶处理。</li>
	<li>将卵母细胞-卵丘细胞复合体暴露于含300 IU/mL透明质酸酶的MEMα/BSA培养基中3分钟，以去除卵母细胞周围的卵丘细胞。 
	警告：透明质酸酶处理时间不得超过3分钟，否则会损伤卵母细胞。</li>
	<li>洗涤卵母细胞时，将其转移至新鲜预热的MEMα/BSA培养基培养皿中。使用口径略大于卵母细胞直径（约90 µm）的口控玻璃移液管或毛细管，轻轻吹打复合体数次，彻底分离卵丘细胞。将卵母细胞置于培养箱中恢复，同时准备下一步操作。</li>
	<li>将酸性Tyrode's溶液、MEMα/BSA及Waymouth's培养基预热至37 °C（每只小鼠500 µL），并在小型9孔玻璃培养板的每孔中加入300 µL。</li>
	<li>为去除透明带（ZP），将5–10个卵母细胞转移至Tyrode's溶液中，仅暴露30–45秒。 
	注意：处理时间过短将无法完全去除透明带，导致卵母细胞无法破裂及染色体无法展开；处理时间过长则会损伤甚至杀死卵母细胞。在解剖显微镜下观察透明带溶解过程有助于优化处理时间。 
	警告：必须使用新鲜配制的Tyrode's溶液，因其活性随存放时间延长而下降。每处理一批卵母细胞均应使用新的Tyrode's溶液孔，以确保透明带消化的均一性。</li>
	<li>去除透明带后，立即将卵母细胞转移至预热的MEMα/BSA/FBS培养基中进行洗涤，重复该洗涤步骤一次。 
	注意：转移时需格外小心，因去除透明带后卵母细胞极易相互粘连或粘附于玻璃移液管或毛细管。预先用Waymouth's培养基润湿玻璃移液管或毛细管可有效减少卵母细胞粘连。</li>
	<li>将卵母细胞转移至Waymouth's培养基中，在37 °C、5% CO2培养箱中恢复30分钟。</li>
	<li>继续进行第5步操作。</li>
</ol>
5. MI 和 MII 期卵母细胞染色质铺展
<ol>
	<li>使用PAP笔在载玻片上绘制一个11 × 44 mm2的矩形，如图6A所示。</li>
	<li>用移液器将100 µL固定液（1%多聚甲醛，0.2% Triton-X 100溶于H2O中，pH 9.2）滴加到载玻片上，前后轻轻摇动载玻片，使固定液均匀覆盖表面，形成一层薄层。轻敲载玻片以去除多余固定液。</li>
	<li>用细口移液器针头尽可能少地吸取5–10个卵母细胞，将针头在已涂有固定液的载玻片上沿直线拖动，同时从距载玻片约1 cm的高度将卵母细胞释放至固定液中。此步骤需在解剖显微镜下操作，以确保卵母细胞已成功沉积并破裂。 
	注意：卵母细胞应在接触载玻片后立即破裂。卵母细胞释放高度会影响染色质的铺展程度。详见图6中的代表性结果。</li>
	<li>将载玻片置于密闭湿润的室温环境中，孵育过夜，使染色质充分附着于载玻片表面。</li>
	<li>让载玻片完全自然干燥，随后将其浸入盛有50 mL润湿剂溶液（0.4%润湿剂-H2O，pH 8.0）的考普林瓶中进行冲洗。</li>
	<li>继续进行第6步。</li>
</ol>
6. 免疫标记
<ol>
	<li>配制如表1所述的抗体稀释缓冲液（ADB）。</li>
	<li>准备两个 Coplin 染色缸，各加入 50 mL 洗涤缓冲液（WB）溶液（将 10% ADB 用 PBS 稀释而成），另准备一个 Coplin 染色缸，加入 50 mL WB 溶液和 0.05% 去垢剂溶液（例如，向 50 mL WB 中加入 250 µL 10% 去垢剂）。</li>
	<li>将本实验方案第 1 和第 5 节制备的载玻片放入含有 50 mL WB 的 Coplin 染色缸中，洗涤 10 分钟。 
	注意：免疫标记过程中切勿让载玻片干燥。</li>
	<li>将载玻片在含有 50 mL WB 和 0.05% 去垢剂溶液的 Coplin 染色缸中洗涤 10 分钟，然后在另一个含有 50 mL WB 溶液的 Coplin 染色缸中再洗涤 10 分钟。</li>
	<li>轻拍去除多余液体，每张载玻片上加 100 µL 用 ADB 稀释的选定一抗。在密闭湿盒中 4 °C 过夜孵育。 
	注：也可在 37 °C 孵育 2 至 3 小时以缩短时间。可通过加盖盖玻片或封口膜使用较小体积的抗体（例如，50 µL）。</li>
	<li>将载玻片在含有 50 mL 0.2% 润湿剂-PBS 溶液（pH 8.0）的 Coplin 染色缸中漂洗。</li>
	<li>重复步骤 6.2 至 6.5。</li>
	<li>轻拍去除多余液体，每张载玻片上加 100 µL 用 ADB 稀释的选定二抗。在密闭湿盒中 37 °C 孵育 1 至 2 小时。</li>
	<li>将载玻片在含有 50 mL 0.2% 润湿剂-PBS 溶液（pH 8.0）的 Coplin 染色缸中洗涤 2 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>将载玻片在含有 50 mL 0.2% 润湿剂-H2O 溶液（pH 8.0）的 Coplin 染色缸中洗涤 2 次，每次 5 分钟。</li>
</ol>
7. 装片
<ol>
	<li>对于在步骤2中制备的前期染色质铺片，加入100 µL含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1.5 µg/mL）的封片剂。对于在步骤5中制备的MI和MII期染色质铺片，加入50 µL含DAPI（1.5 µg/mL）的封片剂。轻轻吸去多余液体。</li>
	<li>将一块22 mm × 60 mm的盖玻片覆盖在样品上，并用透明指甲油封固。置于载玻片盒中，在4 °C或-20 °C保存，待荧光显微镜观察时使用。 
	注意：在用指甲油密封前，应轻敲盖玻片以去除多余的封片剂。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

染色质铺展制备技术使研究人员能够按时间顺序研究雌性哺乳动物的减数分裂过程以及相关蛋白的动态定位。胚胎期和新生期的染色质铺展样本可用于对减数分裂前期各个事件进行细致分析。中期I和中期II的染色质铺展可用于区分单条姐妹染色单体与成对的姐妹染色单体，以及成对的同源染色体，同时可用于评估倍性。相比之下，本文所述方案相较于完整的卵母细胞免疫标记技术具有优势，后者常产生较高的背景信号，从而降低染色质结合蛋白的分辨率。此外，染色质铺展技术也是活细胞成像的一种理想替代方法，后者需要投入大量时间并配备专门的仪器设备。
胚胎和新生卵巢可能难以定位和取出。我们建议在寻找卵巢之前，先在含有 PBS 的另一个培养皿中仔细移除除肾脏以外的所有其他器官和组织，并为每只胚胎/仔鼠使用新鲜的 PBS 培养皿（图 2B）。如果胚胎/仔鼠为雄性，可通过曲细精管的形成以及性腺的位置来区分睾丸（图 2D）。随着雄性胚胎的发育，睾丸会向阴茎方向下降，体积增大并呈椭圆形。
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在精子发生过程中，自青春期开始并持续至成年期，睾丸中会快速且持续地补充大量半同步的减数分裂生殖细胞波1。与雄性不同，雌性中的减数分裂仅在胎儿发育期间启动。出生后，卵母细胞停滞在前期I的长期网状期（dictyate期），生发泡（GV；核膜）保持完整，直至青春期。青春期开始后，部分卵母细胞被周期性地选择进入生长和成熟阶段，标志着减数分裂恢复的启动。在充分生长的卵母细胞中，减数分裂的恢复表现为生发泡的消失，该过程称为生发泡破裂（GVBD）。随后，卵母细胞发生染色体凝集和分离，并伴随极体排出。卵母细胞在进入MII期后再次停滞，只有在受精后才被刺激完成第二次也是最后一次减数分裂。
女性生育能力高度依赖于减数分裂前期 I 的顺利进行。这一过程的关键在于同源染色体之间形成一种称为交叉结（chiasmata）的物理连接，该连接通过DNA双链断裂（DSBs）的修复经由交叉重组实现2。这一过程发生在一个富含蛋白质的动态支架结构——联会复合体（synaptonemal complex, SC）的背景下，该结构在同源染色体之间形成，以促进其联会3。联会复合体是一种类似拉链的三部分结构，由两个平行的侧向元件通过中心区域蛋白连接而成，这些蛋白在整个DNA修复过程中将同源染色体保持在一起。在联会之前，侧向元件的前体——轴向元件——在姐妹染色单体之间形成。联会复合体蛋白如SYCP2和SYCP3构成轴向元件，并在前期I早期与姐妹染色单体的黏连轴共定位。这些轴向元件随后作为横向纤维蛋白SYCP1的结合位点，促进中心元件的组装以及配对同源染色体之间的联会4。在小鼠卵母细胞中，完全联会的标志是出现20对完全重叠的SYCP3与SYCP1信号条带，可通过染色质铺展制片技术进行观察。联会过程在进入粗线期亚阶段时完成，此时注定形成同源染色体间交叉结的成熟交叉位点会被mutL同源物（MLH1/3）二聚体标记，以促进其精确加工5,6,7。染色体结构维持（SMC）复合物，包括黏连蛋白（cohesin）、凝缩蛋白（condensin）以及SMC5/6复合物，在整个减数分裂过程中对染色体动态行为和结构调控具有重要作用8,9,10,11,12。这些事件共同确保在联会复合体解聚后，同源染色体能够正确地定向至纺锤体的相对两极。
减数分裂细胞周期是研究多种蛋白质在基因组维持中作用的有力模型，因为该过程涉及程序性诱导DNA双链断裂（DSBs）及其后续修复。此外，哺乳动物的减数分裂也是研究表观遗传修饰和基因组印记的相关模型13。然而，由于雌性减数分裂发生在哺乳动物的胎儿期和新生期卵巢中（图1），在技术上难以对此过程中的事件进行检测。减数分裂前期I可分为5个亚阶段：细线期、偶线期、粗线期、双线期和网线期。本文描述了如何分离并区分胎儿期和新生期的卵巢与睾丸（图2）。在先前方法的基础上，本论文还提供了一种制备雌性减数分裂前期I染色质铺展样本的实验方案（步骤1），并配有视频演示14,15,16,17。结合步骤6–7所述的免疫标记技术，该方案可实现对卵母细胞中前期I事件的详细显微分析。
卵子发生过程容易出错，减数第一次分裂期间的染色体错误分离是子代遗传性疾病最常见的来源18,19。在本论文（实验步骤2）中，我们描述了一种从成年雌性小鼠经激素预处理的卵巢中提取成熟GV期卵母细胞的实验方案。在适宜的培养条件下，完全成熟的卵母细胞在分离后可不依赖黄体生成素而自发恢复减数分裂20。减数分裂恢复后，卵母细胞完成减数第一次分裂，随后停滞于减数第二次分裂中期（MII期）。卵母细胞将一直维持在MII期停滞状态，直至受精。 在步骤2–5中，我们在已有报道的实验方案基础上，结合视频演示，详细说明如何收集、培养并制备MI期和MII期卵母细胞，以进行染色质铺展制样21。该染色质铺展技术可实现对染色体相关蛋白的清晰免疫标记。此外，本方案还可用于区分二价染色体与单价染色体，并能进一步分辨单条姐妹染色单体，从而便于评估卵母细胞的倍性。因此，该实验方案不仅可用于揭示减数分裂相关蛋白的定位模式，还可作为阐明MI期和MII期染色体错误分离潜在机制的重要工具。

<table><tbody><tr><td>10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.4</td><td>优质生物材料</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm × 15 mm 培养皿</td><td>丹维尔</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35 mm × 12 mm 培养皿</td><td>丹维尔</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>解剖&amp;nbsp;剪刀，尖头，41/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>方形表面皿 1 5/8</td><td>卡罗来纳生物供应公司</td><td>742300</td><td>每次使用前进行高压灭菌</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>使用前立即加入低渗缓冲液</td></tr><tr><td>50x 蛋白酶抑制剂</td><td>罗氏</td><td>11873580001</td><td>使用前立即加入低渗缓冲液</td></tr><tr><td>结核菌素注射器（带针头，1毫升，27 G × 1/2 英寸）</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>金封超霜玻璃载玻片（25×75 mm，1 mm 厚）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>超大号PAP笔（液体阻断笔）</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences, EMS）</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences, EMS）</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>稿件中的去垢剂</td></tr><tr><td>免疫染色湿盒</td><td>常绿</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>考普林罐</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences, EMS）</td><td>74257</td><td>手稿中的润湿剂</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素（PMSG）</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>将分装样品于 -20°C 保存</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素（HCG）</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>将分装样品于 -20°C 保存</td></tr><tr><td>PYREX 九孔凹穴培养板</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>每次使用前进行高压灭菌</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>品牌 Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>乳胶橡胶管（3.2 mm 内径 × 6.4 mm 外径）</td><td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>乳胶橡胶管（6.4 mm 内径 × 11.1 mm 外径）</td><td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>柔软的硅胶鼻夹、硬塑料口含器和15英寸乳胶管</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>Mitutoyo 千分表头</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD 生物科学</td><td>309646</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>0.45 微米注射器滤器 &amp;mu;m 滤膜</td><td>康宁</td><td>431220</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>5 3/4 英寸巴斯德玻璃吸管&quot;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>83 x 0.5 mm 吸头</td><td>丹维尔</td><td>P3080</td><td>用于制作卵母细胞采集针</td></tr><tr><td>&amp;alpha;- MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth's 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11220035</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>用于卵母细胞培养的培养基</td></tr><tr><td>500 ml 滤器装置，0.22 μm</td><td>丹维尔</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>将分装样品于 -20°C 保存</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>用于 ADB/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>用于 ADB/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片（22 mm × 60 mm）</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>亚马逊</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>观察者 Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>稀释倍数 - 1:100</td></tr><tr><td>兔抗 SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>稀释倍数 - 1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗SCP3</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-20845</td><td>稀释倍数 - 1:50</td></tr><tr><td>人抗着丝粒蛋白</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>稀释倍数 - 1:100</td></tr><tr><td>兔抗 TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>稀释倍数 - 1:100</td></tr><tr><td>小鼠抗组蛋白 H4（二甲基化 K20，三甲基化 K20）</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>稀释倍数 - 1:500</td></tr><tr><td>兔抗 Rec8 抗体</td><td>承蒙凯伦·辛德勒博士提供</td><td>N/A</td><td>稀释倍数 - 1:10,000</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（H+L）Alexa Fluor 568标记物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11057</td><td>稀释倍数 - 1:500</td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488偶联物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21202</td><td>稀释倍数 - 1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 647偶联物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-31573</td><td>稀释倍数 - 1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 568 标记物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11004</td><td>稀释倍数 - 1:500</td></tr><tr><td>山羊抗人IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11013</td><td>稀释倍数 - 1:500</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 568 标记物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11011</td><td>稀释倍数 - 1:500</td></tr></tbody></table>

从前期到第二次减数分裂中期的小鼠卵母细胞发育分析用染色质铺展制备方法

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

染色质铺展技术已广泛用于评估配子发生过程中各种蛋白质的动态定位，特别是在精子发生过程中的应用。这些技术能够可视化蛋白质和DNA在减数分裂事件（如同源染色体配对、联会和DNA修复）中的定位模式。尽管文献中已有少数相关方案报道，但利用哺乳动物前期卵母细胞进行染色质铺展的通用技术仍较为有限且操作困难，主要原因在于胎儿卵巢中减数分裂启动的时间难以把握。相比之下，前期精母细胞可从幼年雄性小鼠中获得，产量较高，且无需显微解剖。然而，由于幼年和成年睾丸中减数分裂及减数分裂后生殖细胞群体具有异质性，因此很难获得处于特定阶段的纯合且同步的细胞群体。对于减数分裂的后期阶段，研究经历减数分裂I期（MI）或减数分裂II期（MII）的卵母细胞更具优势，因为可从成年雌性小鼠中收集到成批的成熟卵母细胞，并通过体外培养诱导其恢复减数分裂。本文描述了利用从胎儿、新生期及成年卵巢中分离的卵母细胞进行减数分裂染色质铺展制备的方法，并配有视频演示。哺乳动物卵母细胞中染色体错误分离现象较为频繁，尤其在MI期更为显著。这些技术可用于评估和表征不同基因突变或环境暴露在卵子发生各个阶段所产生的影响。鉴于卵子发生与精子发生在生物学过程上存在明显差异，本文所述技术对于深入理解哺乳动物卵子发生机制以及减数分裂过程中染色体和蛋白质动态的性别二态性特征具有重要价值。

我们描述了两种用于可视化和评估卵母细胞减数分裂染色体的技术。第一种技术主要用于评估胚胎期和新生卵巢中减数分裂前期的进程。前期染色质铺展制备法对于观察减数分裂期间的多种动态过程极为有价值，包括染色体配对、联会与去联会、同源重组以及表观遗传水平的染色体重塑。在此，我们展示了该方法在对来自C57BL/6J胚胎的卵母细胞中交叉事件形成进行可靠可视化和定量分析方面的应用（图3B 和 3C）。为了富集处于粗线期亚阶段的细胞，小鼠胚胎在妊娠18.5天（dpc）时取出（图1）。减数第一次分裂前期粗线期的两个主要特征是同源染色体之间联会的完成，以及每对同源染色体上至少形成一个MLH1/3阳性的交叉。同源染色体间完全联会的表现为存在20段重叠的SYCP3与SYCP1信号。为了表征野生型卵母细胞中的交叉形成，我们使用识别SYCP3、SYCP1和MLH1的抗体对前期染色质铺展样本进行免疫荧光标记，并用DAPI染...

已知哺乳动物的卵子发生过程容易出错，尤其是由于染色体错误分离所致。本文描述了小鼠减数分裂前期、中期I和中期II阶段卵母细胞的染色质铺展制备方法。这些基础技术可用于研究哺乳动物卵子发生过程中染色质结合蛋白及染色体形态的变化。

染色质铺展技术已广泛用于评估各种蛋白质在配子发生过程中的动态定位，特别是用于……

本染色质铺展制备方法的总体目标是，对哺乳动物卵子发生过程中卵母细胞的染色体形态以及染色质结合蛋白的动态定位模式进行时间序列上的可视化观察。该方法有助于解答雌性生殖生物学领域中的若干关键问题，例如同源染色体配对、联会、DNA修复以及减数分裂过程中染色体的分离。该技术的主要优势在于，能够实现染色体相关蛋白的清晰免疫标记与可视化，并可用于评估卵母细胞的倍性。卵子发生过程容易出错，染色体错误分离常导致遗传性疾病。该方法可用于增进对非整倍体和不孕症母源性原因的理解。在处死交配后14至19天的雌性小鼠后，于腹盆腔做V形切口。然后移除母体的子宫角。接着将胚胎与胎盘分离，并通过断头法处死胚胎。然后将胚胎转移至含有3毫升37摄氏度PBS的35毫米培养皿中。然后将一只仔鼠转移至另一含有温热 PBS 的培养皿中。处死胚胎后，沿后半身的腹侧正中线、前半身前肢下方以及后肢和尾部正上方进行剪切。接下来，使用 3.5 英寸剪刀打开胚胎的腹腔。使用尖头镊子移开或去除肝脏和肠袢，暴露性腺。现在确定性腺是雄性还是雌性性腺。卵巢位于肾脏下方和后方，靠近腹膜腔的后壁。使用一对尖头镊子摘除双侧卵巢，并将其转移至一个盛有 PBS 的小容器中，PBS 需维持在 37 摄氏度。迅速操作，完成所有胎鼠卵巢的收集。接着，在另一个新的小容器中，将每组单独的卵巢完全浸入 0.5 毫升新配制的低渗提取缓冲液中。在25摄氏度下孵育至少15分钟，但不超过30分钟。孵育期间，使用疏水性屏障PAP笔在洁净的玻璃载片上画出两个22 × 22毫米的方格。每组卵巢准备一张载片。孵育完成后，在干净的载玻片上加入一滴50微升、100毫摩尔的蔗糖溶液，并将一对卵巢转移至液滴中。现在使用两根27号针头轻轻分离卵巢组织，释放其中的细胞。用镊子移除并丢弃较大的卵巢组织碎片。然后小心地用移液器吹打蔗糖溶液以分散释放的细胞。接着，向载玻片上的每个方格中加入40微升含0.2%Triton X-100的1%PFA固定液。使用移液器吸头或通过前后轻轻摇动载玻片，使溶液均匀覆盖整个方格区域。然后，对于每份含有细胞的蔗糖溶液，取20微升悬浮细胞加入两个固定液滴中，使每张载玻片上的细胞来自同一对卵巢。无论是收集MI还是MII期卵母细胞，首先准备并处死供体小鼠。接着在腹盆腔区域做一个大的V形切口，用镊子移开肠道以暴露每侧子宫角。在肋骨附近找到卵巢。用精细镊子夹住输卵管，用解剖剪剪除卵巢上方的脂肪组织。在继续夹住输卵管的同时，用精细镊子将卵巢从卵巢囊中分离，并将卵巢转移至含有维持在37摄氏度培养基的收集皿中。为收集GV期卵母细胞，使用带有27号针头的1毫升注射器，通过手动穿刺大窦状卵泡来释放卵丘-卵母细胞复合体。为收集MII期卵母细胞，应撕开输卵管壶腹部形成一个开口以释放卵母细胞，而不是简单地进行穿刺。随后使用口控玻璃移液管或毛细管，或使用手动微量注射器收集卵母细胞。一些卵母细胞周围可能有颗粒细胞包裹，而另一些则没有。对于MI期卵母细胞，需在MEM-α/BSA中配制新鲜的透明质酸酶，以去除卵母细胞周围的颗粒细胞。每次收集的卵母细胞，均用2.5毫升配制好的透明质酸酶在培养箱中处理3分钟。然后将MI期卵母细胞转移至新配制的温热MEM-alpha/BSA培养基中。在此过程中，使用口控玻璃移液管提供必要的剪切力，以完全去除卵丘细胞。通常，该操作的成功需要熟练掌握使用口控玻璃移液管或毛细管进行卵母细胞采集和操作的技术。将卵母细胞置于培养箱中孵育恢复。同时，在一个预热的九孔玻璃培养板中，加入300微升温热的Tyrode's溶液；在另外两个孔中各加入300微升温热的MEM-alpha/BSA溶液，在另一个孔中加入300微升温热的Waymouth's培养基。为去除透明带，将5至10个MI或MII期卵母细胞转移至Tyrode溶液中，仅处理30至45秒，并在解剖显微镜下观察。当透明带明显溶解后，立即使用预先润湿MEM-alpha/BSA培养基的移液管将卵母细胞转移至培养基中。随后将卵母细胞转移至第二份预温的培养基中。第二次洗涤后，将卵母细胞转移至预热的Waymouth培养基中，并在培养箱中恢复30分钟。为制备染色质铺展样本，使用PAP笔在玻璃载玻片上画一个11 × 44 毫米的矩形区域。接着，用含有0.2%Triton X-100的1%PFA水溶液在载玻片上覆盖一层薄液，然后前后轻轻摇动载玻片以使溶液均匀铺展。然后轻敲载玻片以去除多余的液体。现在用移液管吸取5到10个卵母细胞，并尽量减少携带的培养基量。接着，将移液管尖同时穿过固定液并从约一厘米高处将卵母细胞滴加到已准备好的载玻片上，完成转移。卵母细胞应立即破裂，使染色质在载玻片上散开。现在将载玻片置于室温下的密闭加湿孵育盒中，静置过夜，使染色质充分附着于载玻片上。利用所述的胚胎染色质收集方法，对从C57 black/6J胚胎中分离的卵母细胞进行交叉形成情况的定量分析。前期染色质铺展样本通过免疫标记检测SYCP3、SYCP1和MLH1，并用DAPI染色。在偶线期阶段的染色体上，共观察到27个MLH1信号点，分布于20条完整组装的联会复合体结构上。当染色体制片效果不理想且无法区分单个染色体时，该制片不纳入评估。在质量良好的制片中，SMC6 富集于着丝粒周围异染色质区域以及染色体臂上，而 MLH1 焦点在粗线期沿联会复合体分布。来自 15 个良好野生型制片的 MLH1 阳性交叉事件数量约为 24 个。采用卵母细胞采集方法，在减数分裂恢复后评估卵母细胞中染色质的形态。可轻松检测蛋白质定位以及倍性，揭示染色体分离错误的潜在原因。拓扑异构酶II-α可见于染色体臂及着丝粒周围异染色质区域。在MII期卵母细胞中，可通过染色体和着丝粒的形态来区分成对的姐妹染色单体。掌握这些技术后，每只小鼠的实验操作（无论是否进行培养）可在一至两小时内完成。按照本方案操作后，还可进行其他互补方法，如全细胞卵母细胞免疫标记和活细胞成像，以在细胞整体背景下评估同源染色体和姐妹染色单体。综上所述，本文所述的染色质铺展方法可简便地用于评估哺乳动物卵子发生过程，以及减数分裂过程中染色体和蛋白质动态的性别二态性特征。

chromatin-spread-preparations-for-analysis-mouse-oocyte-progression

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

从前期到中期二期小鼠卵母细胞进展的染色质传播制剂分析

卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。...

小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

本文介绍了一种基于核仁组织对小鼠窦状卵泡卵母细胞进行表征的实验方案。...

基于核仁染色质结构的小鼠窦卵泡卵母细胞的分离与鉴定

固定样品中减数分裂I期前中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞

本文描述了一种从形态学和生物化学角度对马卵母细胞进行表征的实验方法。具体而言，本研究展示了如何通过超声引导下的卵母细胞采集术（OPU）获取未成熟和成熟的马卵母细胞，并阐述了如何研究染色体分离、纺锤体形态、组蛋白整体乙酰化水平以及mRNA表达。...

马卵母细胞中染色体分离、组蛋白乙酰化及纺锤体形态的分析

减数分裂是一种发育过程，通过一轮DNA复制和两轮染色体分离，形成配子。可通过制备减数分裂染色体铺展的技术来研究哺乳动物的减数分裂。本文演示了一种从小鼠精母细胞制备表面铺展细胞核的方法。...

小鼠精母细胞减数分裂染色体铺片的制备

随着与人类疾病相关的遗传变异逐渐被揭示，开发能够快速评估这些已鉴定变异生物学意义的系统变得日益重要。本方案描述了利用小鼠卵母细胞评估人类基因在女性减数分裂Ⅰ期中功能的方法。...

利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。...

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

本方案提供了一个实验框架，用于记录细胞骨架对小鼠卵母细胞系统中细胞核形态以及内部无膜细胞器的物理影响。该框架可适用于其他细胞类型和研究背景。...

跨空间尺度捕捉小鼠卵母细胞核由细胞骨架介导的扰动

小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

染色质结合蛋白的连续盐提取是一种用于确定大型蛋白质复合物结合特性的有效工具。该方法可用于评估蛋白质复合物中各个亚基或结构域在整体上与大量染色质结合亲和力中的作用。...

用于分析染色质修饰复合物整体染色质结合特性的连续盐抽提法

学习小鼠卵母细胞染色质传播制剂技术，用于可视化染色质结合蛋白动态定位与染色体形态变化。该方法结合免疫标记技术，可评估卵母细胞倍性并揭示减数分裂染色体分离机制，为研究生殖生物学和女性不育症提供重要工具。

从前期到第二次减数分裂中期的小鼠卵母细胞发育分析用染色质铺展制备方法

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