Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

这种染色质扩散准备的总体目标是按时间顺序可视化整个哺乳动物卵子发生过程中染色质结合蛋白的动态定位模式和卵母细胞的染色体形态。这种方法可以帮助回答女性生殖生物学领域的关键问题，例如同源染色体配对、突触、DNA 修复和减数分裂染色体分离。该技术的主要优点是它允许对与染色体相关的蛋白质进行清晰的免疫标记和可视化，并评估卵母细胞倍性。

卵子发生容易出错，染色体错误分离通常会导致遗传病。这种方法可用于提高我们对非整倍体和不孕症的母体原因的理解。在后 14 至 19 天对雌性小鼠实施安乐死后，在腹盆腔中开一个 V 形开口。

然后去除母体子宫角。接下来将胚胎与胎盘分离，并通过斩首处死胚胎。然后将它们转移到含有 3 毫升 PBS 的 35 毫米培养皿中，温度为 37 摄氏度。

然后将一只幼崽移到一个同样装有温热 PBS 的单独培养皿中。对胎儿实施安乐死后，沿着后半部的腹侧中线、前肢下方的前半部以及后肢和尾巴的正上方进行切割。接下来用 3.5 英寸的剪刀打开胚胎的腹部。

使用细尖镊子，移位或切除肝脏和肠袢，露出性腺。现在确定性腺是男性还是女性性腺。卵巢位于肾脏的正下方和后面，朝向腹膜腔的后壁。

使用一对细尖镊子取出两个卵巢，并将它们转移到一个装有 PBS 的小容器中，该容器保持在 37 摄氏度。快速收集所有胎儿的卵巢。接下来，在一个新的小容器中，将每组单独的卵巢完全浸入半毫升新鲜制备的次提取缓冲液中。

让它们在 25 摄氏度下孵育至少 15 分钟，但不要超过 30 分钟。在孵育过程中，使用疏水屏障 PAP 笔在干净的载玻片上绘制两个 22 x 22 毫米的正方形。为每组卵巢准备一张载玻片。

孵育完成后，将 50 μL 的 100 毫摩尔蔗糖滴到干净的玻片中，并将一对卵巢转移到液滴中。现在用两根 27 号针头挑逗卵巢并释放其中的细胞。用镊子取出并丢弃大块卵巢。

然后小心地移液蔗糖溶液以分散释放的细胞。接下来，将每个方块加载到载玻片上，加入 40 微升 1% PFA 和 0.2%Triton X-100。使用移液器吸头或来回摇动载玻片，将溶液涂抹在正方形周围。

然后，对于每个带有细胞的蔗糖溶液池，用 20 微升悬浮细胞加载两个固定液坑，以便每张载玻片都有来自一组卵巢的细胞。对于 MI 或 MII 卵母细胞收集，首先准备供体小鼠并对其实施安乐死。然后在腹盆腔做一个大的 V 形开口，用镊子移位肠道，找到每个子宫角。

找到肋骨近端的卵巢。用细镊子固定输卵管，用解剖剪刀剪下卵巢上方的脂肪。在仍然握住输卵管的同时，使用细镊子将卵巢从滑囊中释放出来，并将卵巢转移到含有维持在 37 摄氏度的培养基的收集皿中。

要收集 GV 期卵母细胞，请使用带有 27 号针头的 1 毫升注射器，通过手动穿刺大的窦卵泡来释放卵丘-卵母细胞复合物。要收集 MII 期卵母细胞，请在输卵管壶腹撕开一个孔以释放它们，而不是简单地穿刺。现在使用口作的玻璃移液器或毛细管，或使用手动千分尺注射器收集卵母细胞。

一些卵母细胞可能被卵丘细胞包围，而另一些则没有。对于 MI 卵母细胞，在 MEM-alpha/BSA 中制备新鲜的透明质酸酶，以去除周围卵丘细胞的卵母细胞。对于每个卵母细胞集合，在装有 2.5 毫升准备好的透明质酸酶的培养箱中处理它们 3 分钟。

然后将 MI 卵母细胞转移到新鲜制备的温热 MEM-alpha/BSA 培养基中。在那里，使用口作玻璃移液器提供完全分离卵丘细胞所需的剪切力。通常，该程序的成功需要掌握卵母细胞的收集和使用口作玻璃移液器或毛细管的作。

让卵母细胞在培养箱中恢复。同时，将 300 微升温热的 Tyrode 溶液加入加热的 9 孔玻璃板中。用 300 微升温热的 MEM-alpha/BSA 加载两个孔，并在一个孔中加载 300 微升温的 Waymouth 培养基。

要去除透明带，请将 5 至 10 MI 或 MII 期卵母细胞转移到 Tyrode 溶液的浴中 30 至 45 秒，同时在解剖显微镜下观察它们。当透明带明显溶解时，立即使用预先用 MEM-alpha/BSA 培养基润湿的移液器将卵母细胞转移到培养基中。然后将卵母细胞转移到第二个加热培养基浴中。

第二次沐浴后，将卵母细胞转移到温热的 Waymouth 培养基中，让它们在培养箱中恢复 30 分钟。要准备染色质扩散，请使用 PAP 笔在载玻片上绘制一个 11 x 44 毫米的矩形。接下来，在载玻片上涂上一层薄薄的 1% PFA 和 0.2%Triton X-100 的水中，然后来回摇动载玻片以铺展溶液。

然后点击幻灯片以去除多余的部分。现在用最少量的培养基吸取 5 到 10 个卵母细胞。然后，通过同时将移液管尖端拖过固定液并将卵母细胞从上方约 1 厘米处放到载玻片上，将卵母细胞转移到准备好的载玻片上。

卵母细胞应立即破裂，将染色质散布在载玻片上。现在在密闭加湿室中在室温下孵育载玻片。让它们静置一夜，使染色质粘附在载玻片上。

所描述的胚胎染色质收集用于定量分析从 C57 黑色/6J 胚胎收获的卵母细胞中的交叉形成。对前期染色质扩散制剂进行免疫标记以检测 SYCP3 、 SYCP1 和 MLH1，并用 DAPI 染色。厚纤期染色体有 27 个 MLH1 病灶，分布在 20 个完全组装的 SC 结构上。

当扩散制备不理想且单个染色体无法区分时，该制备不包括在评估中。在良好的制备中，SMC6 在着丝粒周围异染色质区域和沿染色体臂富集，MLH1 病灶在厚纤期沿 SC 分布。来自 15 种良好野生型制剂的 MLH1 阳叉数量约为 24 种。

卵母细胞收集法用于评估减数分裂恢复后卵母细胞的染色质形态。蛋白质定位以及倍性很容易评估，揭示了染色体分离错误的潜在原因。拓扑异构酶 II-α 可以沿着染色体臂和着丝粒周围异染色质看到。

在 MII 卵母细胞中，配对的姐妹染色单体可以通过染色体和着丝粒形态来区分。一旦掌握，这些技术可以在每只小鼠的一两个小时内完成，无需培养或之后。在此程序之后，可以执行其他补充方法，如全细胞卵母细胞免疫标记和活细胞成像，以评估细胞环境中的同源染色体和姐妹染色单体。

总的来说，此处描述的染色质传播方法可以很容易地应用于评估哺乳动物的卵子发生以及减数分裂过程中染色体和蛋白质动力学的性二态特征。