从前期到第二次减数分裂中期的小鼠卵母细胞发育分析用染色质铺展制备方法

本染色质铺展制备方法的总体目标是，对哺乳动物卵子发生过程中卵母细胞的染色体形态以及染色质结合蛋白的动态定位模式进行时间序列上的可视化观察。该方法有助于解答雌性生殖生物学领域中的若干关键问题，例如同源染色体配对、联会、DNA修复以及减数分裂过程中染色体的分离。该技术的主要优势在于，能够实现染色体相关蛋白的清晰免疫标记与可视化，并可用于评估卵母细胞的倍性。

卵子发生过程容易出错，染色体错误分离常导致遗传性疾病。该方法可用于增进对非整倍体和不孕症母源性原因的理解。在处死交配后14至19天的雌性小鼠后，于腹盆腔做V形切口。

然后移除母体的子宫角。接着将胚胎与胎盘分离，并通过断头法处死胚胎。然后将胚胎转移至含有3毫升37摄氏度PBS的35毫米培养皿中。

然后将一只仔鼠转移至另一含有温热 PBS 的培养皿中。处死胚胎后，沿后半身的腹侧正中线、前半身前肢下方以及后肢和尾部正上方进行剪切。接下来，使用 3.5 英寸剪刀打开胚胎的腹腔。

使用尖头镊子移开或去除肝脏和肠袢，暴露性腺。现在确定性腺是雄性还是雌性性腺。卵巢位于肾脏下方和后方，靠近腹膜腔的后壁。

使用一对尖头镊子摘除双侧卵巢，并将其转移至一个盛有 PBS 的小容器中，PBS 需维持在 37 摄氏度。迅速操作，完成所有胎鼠卵巢的收集。接着，在另一个新的小容器中，将每组单独的卵巢完全浸入 0.5 毫升新配制的低渗提取缓冲液中。

在25摄氏度下孵育至少15分钟，但不超过30分钟。孵育期间，使用疏水性屏障PAP笔在洁净的玻璃载片上画出两个22 × 22毫米的方格。每组卵巢准备一张载片。

孵育完成后，在干净的载玻片上加入一滴50微升、100毫摩尔的蔗糖溶液，并将一对卵巢转移至液滴中。现在使用两根27号针头轻轻分离卵巢组织，释放其中的细胞。用镊子移除并丢弃较大的卵巢组织碎片。

然后小心地用移液器吹打蔗糖溶液以分散释放的细胞。接着，向载玻片上的每个方格中加入40微升含0.2%Triton X-100的1%PFA固定液。使用移液器吸头或通过前后轻轻摇动载玻片，使溶液均匀覆盖整个方格区域。

然后，对于每份含有细胞的蔗糖溶液，取20微升悬浮细胞加入两个固定液滴中，使每张载玻片上的细胞来自同一对卵巢。无论是收集MI还是MII期卵母细胞，首先准备并处死供体小鼠。接着在腹盆腔区域做一个大的V形切口，用镊子移开肠道以暴露每侧子宫角。

在肋骨附近找到卵巢。用精细镊子夹住输卵管，用解剖剪剪除卵巢上方的脂肪组织。在继续夹住输卵管的同时，用精细镊子将卵巢从卵巢囊中分离，并将卵巢转移至含有维持在37摄氏度培养基的收集皿中。

为收集GV期卵母细胞，使用带有27号针头的1毫升注射器，通过手动穿刺大窦状卵泡来释放卵丘-卵母细胞复合体。为收集MII期卵母细胞，应撕开输卵管壶腹部形成一个开口以释放卵母细胞，而不是简单地进行穿刺。随后使用口控玻璃移液管或毛细管，或使用手动微量注射器收集卵母细胞。

一些卵母细胞周围可能有颗粒细胞包裹，而另一些则没有。对于MI期卵母细胞，需在MEM-α/BSA中配制新鲜的透明质酸酶，以去除卵母细胞周围的颗粒细胞。每次收集的卵母细胞，均用2.5毫升配制好的透明质酸酶在培养箱中处理3分钟。

然后将MI期卵母细胞转移至新配制的温热MEM-alpha/BSA培养基中。在此过程中，使用口控玻璃移液管提供必要的剪切力，以完全去除卵丘细胞。通常，该操作的成功需要熟练掌握使用口控玻璃移液管或毛细管进行卵母细胞采集和操作的技术。

将卵母细胞置于培养箱中孵育恢复。同时，在一个预热的九孔玻璃培养板中，加入300微升温热的Tyrode's溶液；在另外两个孔中各加入300微升温热的MEM-alpha/BSA溶液，在另一个孔中加入300微升温热的Waymouth's培养基。

为去除透明带，将5至10个MI或MII期卵母细胞转移至Tyrode溶液中，仅处理30至45秒，并在解剖显微镜下观察。当透明带明显溶解后，立即使用预先润湿MEM-alpha/BSA培养基的移液管将卵母细胞转移至培养基中。随后将卵母细胞转移至第二份预温的培养基中。

第二次洗涤后，将卵母细胞转移至预热的Waymouth培养基中，并在培养箱中恢复30分钟。为制备染色质铺展样本，使用PAP笔在玻璃载玻片上画一个11 × 44 毫米的矩形区域。接着，用含有0.2%Triton X-100的1%PFA水溶液在载玻片上覆盖一层薄液，然后前后轻轻摇动载玻片以使溶液均匀铺展。

然后轻敲载玻片以去除多余的液体。现在用移液管吸取5到10个卵母细胞，并尽量减少携带的培养基量。接着，将移液管尖同时穿过固定液并从约一厘米高处将卵母细胞滴加到已准备好的载玻片上，完成转移。

卵母细胞应立即破裂，使染色质在载玻片上散开。现在将载玻片置于室温下的密闭加湿孵育盒中，静置过夜，使染色质充分附着于载玻片上。

利用所述的胚胎染色质收集方法，对从C57 black/6J胚胎中分离的卵母细胞进行交叉形成情况的定量分析。前期染色质铺展样本通过免疫标记检测SYCP3、SYCP1和MLH1，并用DAPI染色。在偶线期阶段的染色体上，共观察到27个MLH1信号点，分布于20条完整组装的联会复合体结构上。

当染色体制片效果不理想且无法区分单个染色体时，该制片不纳入评估。在质量良好的制片中，SMC6 富集于着丝粒周围异染色质区域以及染色体臂上，而 MLH1 焦点在粗线期沿联会复合体分布。来自 15 个良好野生型制片的 MLH1 阳性交叉事件数量约为 24 个。

采用卵母细胞采集方法，在减数分裂恢复后评估卵母细胞中染色质的形态。可轻松检测蛋白质定位以及倍性，揭示染色体分离错误的潜在原因。拓扑异构酶II-α可见于染色体臂及着丝粒周围异染色质区域。

在MII期卵母细胞中，可通过染色体和着丝粒的形态来区分成对的姐妹染色单体。掌握这些技术后，每只小鼠的实验操作（无论是否进行培养）可在一至两小时内完成。按照本方案操作后，还可进行其他互补方法，如全细胞卵母细胞免疫标记和活细胞成像，以在细胞整体背景下评估同源染色体和姐妹染色单体。

综上所述，本文所述的染色质铺展方法可简便地用于评估哺乳动物卵子发生过程，以及减数分裂过程中染色体和蛋白质动态的性别二态性特征。