一种有效的体外转位方法由转录调节的睡眠美容系统封装到一个集成缺陷的慢向量
2018年1月12日
该协议描述了一种方法, 以实现稳定的基因的兴趣进入人类基因组由转录调控的睡美人系统。本文报道了有缺陷的慢载体的合成、人体细胞的体外转导和转细胞的分子检测。
该方法的总体目标是通过包装到整合缺陷慢病毒载体中的转录调节 Sleeping Beauty 系统，实现目标基因稳定整合到原代细胞的人类基因组中。这种方法可以帮助回答基因治疗领域的关键问题，例如使用 Sleeping Beauty 系统将目标基因整合到原代细胞中。该技术的主要优点是诱导型过度活跃的 Sleeping Beauty 系统可有效递送对多种转染方法具有抗性的原代细胞。
演示该程序的是我实验室的博士后 Daniela Benati。在转导日之前，按照文本方案中的描述生长人原代角质形成细胞。要分离培养物中的亚汇合角质形成细胞，请去除培养基，用 1X PBS 洗涤细胞，并向每个孔中加入 1 mL 预热胰蛋白酶工作溶液。
在 37 摄氏度下在细胞培养箱中孵育 15 分钟。彻底重悬孔中的细胞，并将细胞悬液转移到含有 2 毫升含血清培养基的离心管中。用 3 mL 1X PBS 冲洗孔一次，然后将冲洗后的溶液加入含有细胞悬液的离心管中。
以 580 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 5 mL 1X PBS 洗涤细胞，以 580 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。在 15 mL 聚丙烯管中，在 1 mL CFAD 培养基中稀释 1.6 乘以 10 至第五个角质形成细胞。
为每个条件准备一种稀释液。三种整合缺陷慢病毒或 IDLV 载体按照文本实验步骤中的说明提前制备。IDLVTKSB 携带 TET 调节的高活性 SB100X 转座。
IDLVrtTA 编码调节剂，IDLVT2 携带目标基因。在本例中，GFP 两侧是转座子反向重复序列。如下表所示，在 20 μL 聚凝胺存在下，在 1 mL CFAD 培养基中稀释慢病毒载体。
1、2 和 3 是没有载体的阴性对照。4 和 5 包含 IDLVTKSB 和 IDLVrtTA。6、7、8 和 9 包含所有三种慢病毒载体。
通过将每种慢病毒载体稀释液添加到相应的角质形成细胞悬液中来转导悬浮液中的细胞。从一天前消退的致命照射 3T3-J2 饲养层细胞中取出培养基，并将转导的角质形成细胞接种到它们上面。转导一口井后，继续进行下一口井。
在 25 度下孵育 30 分钟。然后将细胞转移至 37 度 6 小时。6 小时后，向每个孔中加入 1 mL CFAD 培养基。
将 1 微摩尔多西环素加入 5、8 和 9 孔中。将电池恢复到 37 摄氏度。随后，按照文本协议中的说明处理每个孔中的细胞。
对于细胞荧光分析，必须通过用小鼠单克隆 APC 偶联的抗饲养层抗体标记细胞，将第 3 天和第 6 天分离的转导原代角质形成细胞与 3T3-J2 饲养层区分开来。通过混合 5% FBS、500 毫摩尔 EDTA 和 1X PBS，为每个样品制备 4 mL 染色缓冲液。用 1 毫升染色缓冲液洗涤分离的细胞。
以 580 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。在用于流式细胞术采集的试管中，在 100 微升染色缓冲液中重悬 5 乘以 10 至第四个细胞。加入 2 μL 稀释度为 1 至 50 的抗饲养层抗体，并充分混合。
在黑暗中在冰上孵育 30 分钟。30 分钟后，用 2 mL 染色缓冲液洗涤。以 580 倍 g 离心 5 分钟。
弃去上清液并重悬于 200 μL 染色缓冲液中。使用配置了蓝色激光器、红色激光器和滤光片的流式细胞仪检测 GFP 和 APC 荧光，以获取 APC 和 GFP 信号。APC 阴性细胞群的 GFP 阳性细胞分数表明转导的角质形成细胞。
要进行实时荧光定量 PCR，请在 96 孔板中一式三份设置反应，最终反应体积为 25 μL。每个反应物含有 1 μL cDNA、12.5 μL 2X 预混液、1.25 μL 20X 探针混合物中的引物和 10.25 μL 无菌水。根据此 PCR 程序运行实时 PCR，一个周期在 95 摄氏度下持续 10 分钟，然后 40 个 95 摄氏度周期持续 15 秒，在 60 摄氏度下持续 1 分钟，并保持在 4 摄氏度。
最后，按照文本协议中的说明分析实时 PCR 数据。在调节剂载体加或减多西环素中增加转座剂量转导的 HeLa 细胞的表达分析表明，强烈诱导 SB100X 表达需要高剂量的两种 IDLV。在存在或不存在调节载体的情况下，对用转座载体转导的 HeLa 细胞上的 SB100X 表达进行定量分析，结果显示，在多西环素存在下，SB100X 的激活在背景上增加了 8 倍。
转录调控的睡美人系统也可用于原代细胞。用转座和调节剂载体转导的角质形成细胞上的 SB100X 表达在关闭状态下显示出 15 倍的激活。在用三种 IDLV 载体加或少多西环素转导的角质形成细胞中进行的转座实验表明，12% 的用多西环素处理的细胞在其基因组中稳定地整合了至少一个 GFP 拷贝。
一旦掌握，如果作得当，原代细胞中的活体转导可以在 8 小时内完成，细胞荧光分析可以在 2 小时内完成，表达分析可以在 3 小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住优化用于转导原代细胞的载体剂量组合，并达到诱导型睡美人转座的更高表达水平。在此程序之后，可以执行其他方法，例如定量 PCR 和接头介导的 PCR，以回答其他问题，例如每个细胞的转座子拷贝数和用于归档基因组的整合。
该技术开发后，为基因治疗领域的研究人员探索睡美人系统在工程临床相关细胞中的应用铺平了道路。观看视频后，您应该对如何首先使用 IDLV 载体转导原代角质形成细胞有很好的了解。其次，在多西环素条件下测量多活性转座的表达，最后通过流式细胞术跟踪转座。
不要忘记，使用病毒载体可能非常危险，因此在执行这些程序时应始终随身携带预防措施，例如 BCL 以控制病毒载体水平和一次性用品。
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概述
本协议描述了一种使用转录调节的Sleeping Beauty系统将目标基因稳定整合到人类基因组中的方法。该过程包括制备整合缺陷型慢病毒载体、人类细胞的体外转导以及对转导细胞的分子检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因治疗
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- Sleeping Beauty系统是一种基于转座子的基因递送方法。
- 基因整合到人类基因组中对于稳定表达至关重要。
- 原代细胞通常对传统的转染方法有抵抗力。
- 该方法旨在提高原代细胞中的基因整合效率。
研究目的
- 实现在人类原代细胞中稳定的基因整合。
- 利用Sleeping Beauty系统进行高效的基因递送。
- 解决与原代细胞转染相关的基因治疗挑战。
使用的方法
- 制备整合缺陷型慢病毒载体。
- 人类原代角质细胞的体外转导。
- 用于评估基因整合的分子检测。
- 在转导前使用胰蛋白酶进行细胞脱离。
主要结果
- 在原代细胞中展示稳定的基因整合。
- 使用Sleeping Beauty系统高效递送基因。
- 成功转导人类原代角质细胞。
- 验证评估整合的分子检测。
结论
- Sleeping Beauty系统对于原代细胞的基因整合有效。
- 该方法为基因治疗应用提供了可靠的方法。
- 未来的研究可以在此协议的基础上探索其他目标基因。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in gene therapy: achieving stable transgene integration in primary human cells resistant to conventional transfection. By combining a transcriptionally regulated hyperactive Sleeping Beauty transposase with integration-defective lentiviral delivery, it enables tunable, efficient genomic modification in therapeutically relevant cell types. The approach supports preclinical de-risking by providing a reproducible platform for functional validation before clinical translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise interrogation of gene function through stable, inducible genomic integration in primary cells.
- Operational Value: Overcomes transfection limitations in hard-to-transduce primary cells, expanding target validation scope.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isogenic cell populations with defined transgene copy number for consistent phenotypic screening.
- Operational Value: Provides quantitative GFP-based readout via flow cytometry to assess integration efficiency across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports dose-dependent transgene expression tuning via doxycycline, enabling mechanistic de-risking of therapeutic constructs.
- Operational Value: Demonstrated 12% stable integration in primary keratinocytes, establishing a benchmark for preclinical efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling stable cell line generation for target validation and lead optimization studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing controlled, long-term transgene expression in disease-relevant primary cells.
- Screening: Enables assay-ready cell populations with reproducible integration for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantifiable endpoints (GFP+ fraction, qPCR validation) to compare transduction conditions and optimize vector dosing.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by validating transgene performance in primary cells prior to in vivo studies.
- Enterprise Reuse: The IDLV-based delivery system can be adapted across multiple genes of interest and cell types, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in transgene behavior through stable, inducible integration reducing epigenetic silencing risks.
- Operational Value: Standardized workflow using lentiviral transduction and doxycycline induction ensures reproducibility across labs and cell types.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by confirming functional integration before investing in downstream development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of gene therapy candidates based on demonstrable primary cell engineering efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral vector production, primary cell culture, and inducible expression systems.
- Dependent on access to HEK293T packaging cells, flow cytometry, and qPCR instrumentation for validation.
- Necessitates standardization of vector dosing and doxycycline concentration across cell types to ensure consistent transposition efficiency.
- Adaptation to diverse primary cell models may require optimization of transduction conditions and selection markers.
- Practical limitation: Efficiency depends on achieving sufficient co-delivery of transposase, modulator, and transposon vectors, necessitating titer optimization.
