Name: 一种有效的体外转位方法由转录调节的睡眠美容系统封装到一个集成缺陷的慢向量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习利用转录调控的Sleeping Beauty系统，通过整合缺陷型慢病毒载体将目的基因稳定整合到原代人角质形成细胞基因组中。该方法为基因治疗研究提供了高效可靠的基因递送方案。

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我们感谢意大利摩德纳和雷焦艾米利亚大学摩德纳分校的 Zappavigna 教授为我们提供 pCCL-PGKrtTA2S-M2 质粒。同时感谢德国兰根保罗·埃尔利希研究所的 Z. Ivics 教授和德国柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的 Z. Izvak 教授提供 pCMVSB100X 和 pT2/BH 质粒。本工作由 DEBRA 国际组织和意大利大学与研究部资助。

1. 使用的质粒
注意：质粒 pCCL-PGKrtTA2S-M2 由意大利摩德纳和雷焦艾米利亚大学（摩德纳）的 Zappavigna 教授惠赠。携带高活性转座酶编码序列&#160;的 pCMVSB100X 质粒和 pT2/BH 转座子质粒分别由德国朗根保罗·埃尔利希研究所的 Ivics Z. 教授和德国柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的 Izvak Z. 教授惠赠。
<ol>
	<li>在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中进行所有克隆操作时，应遵循所选的克隆策略，并采用限制性内切酶方法或对需克隆的片段进行PCR扩增。 
	注意：表1汇总了本实验方案中使用的所有质粒，每个质粒均提供了相应的描述和参考文献。</li>
</ol>
2. 病毒载体生产
注意：根据机构的规章制度，所有病毒载体均在生物安全二级（BSL2）防护级别的生物危害通风柜中制备。
<ol>
	<li>在添加了10% HyClone血清、100 U/mL青霉素-链霉素和2 mM谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中培养贴壁的HEK293T细胞。</li>
	<li>第0天：为每种病毒制备准备五个15 cm培养皿，并在30 mL培养基中接种5.5×106个细胞。</li>
	<li>第1天：转染
	<ol>
		<li>开始转染前，配制100 mL 2× HEPES缓冲盐水（HBS）： 
		NaCl (5 M)                                    5.6 mL 
		HEPES (1 M)                              10.0 mL 
		Na2HPO4 (0.5 M)                           0.3 mL 
		无菌水                                84.1 mL 
		用37% HCl调节pH至7.1。 
		注意：2× HBS可在4 °C保存。精确的pH值对高效转染极为重要，最佳pH范围为7.10至7.12。</li>
		<li>在转染前4小时，吸除培养基，并为每块培养皿加入22.5 mL新鲜培养基。</li>
		<li>按照以下每皿用量，使用转移质粒、pMD.Lg/pRRE.D64VInt包装质粒、pMD2.G包膜编码质粒以及pRSV-Rev（表1）对HEK293T细胞进行转染： 
		转移质粒                  25.00 µg 
		pMD.Lg/pRRE.D64VInt        16.25 µg 
		pMD2.G                               8.75 µg 
		pRSV-Rev                            6.25 µg 
		注意：质粒DNA可按照Maniatis22所述的CsCl方法制备，或使用无内毒素质粒纯化试剂盒制备。
		<ol>
			<li>将56.25 µg DNA（四种质粒的混合物）重悬于1.125 mL无菌水中，加入125 µL 2.5 M CaCl2（溶液A）。</li>
			<li>将1.250 mL 2× HBS加入无菌的15 mL圆锥形离心管中（溶液B）。</li>
			<li>在用1或2 mL移液器吹入气泡的同时，将溶液A（1.250 mL）逐滴加入溶液B（1.250 mL）中（转染液，总体积2.500 mL）。</li>
			<li>室温下孵育20分钟。</li>
			<li>使用P1000微量移液器将全部转染液（2.500 mL）逐滴均匀加入细胞单层中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：吸除培养基，并为每皿加入15 mL新鲜培养基（见步骤2.1）。</li>
	<li>第3天：收集并浓缩含有慢病毒颗粒的上清液。
	<ol>
		<li>从所有（n=5）转染细胞培养皿中收集上清液（约70 mL），经0.45 µm PESS滤器过滤后，分装至2个聚碳酸酯离心管（1英寸×3.5英寸）中，用于病毒制备。</li>
		<li>在15 °C条件下，以106,000 × g离心2.5小时（开启刹车）以浓缩病毒载体颗粒。</li>
		<li>超速离心停止后立即操作（以避免管中沉淀重新悬浮），小心倾去上清液至含有10%次氯酸钠的容器中，并将两个几乎不可见的沉淀物轻轻重悬于100 µL 1× PBS（含1% BSA）中。此现象正常，因沉淀透明且极小。浓缩后的病毒载体应新鲜使用，或分装后于-80 °C保存。 
		注意：上清液中含有慢病毒颗粒，丢弃前必须用次氯酸钠彻底灭活，并按生物危害废物处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为测定病毒载体滴度，按照制造商说明书使用HIV-1 Gag p24免疫捕获试剂盒。 
	注意：为标准化病毒载体生产，可采用基于脂质体的转染试剂。然而，病毒载体滴度高度依赖于转染效率和质粒DNA的纯度。</li>
</ol>
3. 人类细胞系（例如 HeLa 细胞）的转导
注意：HeLa 细胞在添加了 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素-链霉素和 2 mM 谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium）中培养。表 1 总结了本实验方案中使用的所有载体，并提供了每个载体的说明。通过转导 HeLa 细胞，可在两种 IDLV 载体的最佳剂量组合下验证 SB 转座酶的转录调控。IDLV 剂量的变化可能与载体颗粒滴度及靶细胞类型相关。
<ol>
	<li>第0天：在6孔板的每个孔中接种2×105个细胞，加入3 mL培养基。准备4个孔。</li>
	<li>第1天：转导HeLa细胞。
	<ol>
		<li>针对每种条件，将慢病毒载体用含10 μL聚凝胺（终浓度为8 μg/mL）的培养基稀释至终体积1 mL（见上述注释）： 
		第1孔稀释液：模拟转导细胞（阴性对照）。 
		第2孔稀释液：IDLVTKSB载体（p24为2,600 ng）。 
		第3、4孔稀释液：IDLVTKSB载体（p24为2,600 ng）+ IDLVrtTA2s-M2载体（p24为9,600 ng）。</li>
		<li>吸去第0天接种HeLa细胞各孔中的培养基，将相应的慢病毒载体稀释液加入对应孔中。</li>
		<li>在20–25 °C下以754 × g离心6孔板45分钟，随后将6孔板转移至37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。</li>
		<li>6小时后，吸去含病毒载体的培养基，更换为新鲜培养基，并在第4孔中加入多西环素至终浓度1 μM。将培养板置于37 °C细胞培养箱中继续培养48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：制备用于RNA提取的细胞沉淀。
	<ol>
		<li>在消化细胞前，配制胰蛋白酶工作液（1×）： 
		2.5%胰蛋白酶（10×）                                              5.0 mL 
		500 mM EDTA（终浓度 = 5 mM）                         0.5 mL 
		1× PBS                                                               44.5 mL</li>
		<li>使用前将胰蛋白酶工作液预热至37 °C。工作液储存于4 °C。</li>
		<li>吸去培养基，用1× PBS洗涤细胞。每孔加入0.5 mL预热至37 °C的胰蛋白酶工作液，于37 °C孵育7分钟（在细胞培养箱中进行）。</li>
		<li>孵育结束后，每孔加入0.5 mL含血清的培养基以终止胰蛋白酶反应，并将细胞收集至离心管中。用3 mL 1× PBS冲洗每个孔一次，然后将细胞悬液在240 × g下离心5分钟。</li>
		<li>用5 mL 1× PBS重悬细胞并洗涤，240 × g离心5分钟，弃上清。使用新鲜制备的细胞沉淀，或于-80 °C保存。从细胞沉淀中提取总RNA，用于半定量RT-PCR分析（见步骤6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 人类原代细胞（例如角质形成细胞）的转导
注意：将人原代角质形成细胞接种于致死性照射的3T3-J2细胞（饲养层）上23，该细胞系由Yan Barrandon（瑞士洛桑联邦理工学院，EPFL）惠赠。
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清、50 U/mL青霉素-链霉素和4 mM谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（3T3培养基）中培养瑞士小鼠3T3-J2细胞。</li>
	<li>将角质形成细胞接种至经致死性照射的3T3-J2细胞上，并在cFAD培养基中培养。cFAD培养基为杜氏改良伊格尔培养基与Ham's F12培养基的混合液（3:1），其中含有胎牛血清（10%）、青霉素-链霉素（1%）、谷氨酰胺（2%）、胰岛素（5 µg/mL）、腺嘌呤（0.18 mM）、氢化可的松（0.4 µg/mL）、霍乱毒素（0.1 nM）和三碘甲腺原氨酸（2 nM）。</li>
	<li>第0天：将先前用3T3培养基稀释至终浓度为1×105 个细胞/mL的致死性照射3T3-J2细胞，以每孔3×105 个细胞接种于6孔板的每个孔中。准备9个孔。</li>
	<li>第1天：原代角质形成细胞的转导 
	注意：对角质形成细胞进行转导可定量分析SB转座酶在两种IDLV载体最佳剂量组合下的转录调控（通过qRT-PCR），并验证目的基因（GFP）在靶细胞中的整合情况（通过流式细胞荧光分析）。
	<ol>
		<li>在消化细胞前，配制胰蛋白酶工作液： 
		0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10倍浓缩液）                                         5.0 mL 
		500 mM EDTA（终浓度 = 5 mM）                 0.5 mL 
		1× PBS                                                                  44.5 mL</li>
		<li>使用前将胰蛋白酶工作液预热至37 °C。胰蛋白酶工作液储存于4 °C。</li>
		<li>为消化培养中处于亚融合状态的角质形成细胞，吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞，然后每孔加入1 mL预热的胰蛋白酶工作液。在细胞培养箱中37 °C孵育15分钟。</li>
		<li>孵育结束后，充分重悬单个孔中的细胞，并将细胞悬液转移至含有2 mL含血清培养基的离心管中（若仍有大量细胞贴壁，可在37 °C额外孵育1分钟）。用3 mL 1× PBS或新鲜培养基冲洗每个孔一次，并将冲洗液加入含有细胞悬液的离心管中。</li>
		<li>以580 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用5 mL 1× PBS洗涤细胞，以580 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>在15 mL聚丙烯管中，将1.6×105 个角质形成细胞用1 mL cFAD培养基稀释，每种实验条件配制一份稀释液。</li>
		<li>在1 mL cFAD培养基中稀释慢病毒载体，并加入20 μL聚凝胺（终体积为2 mL时终浓度为8 µg/mL）： 
		第#1、#2、#3孔的稀释液：模拟转导细胞（无载体的阴性对照）。 
		第#4、#5孔的稀释液：IDLVTKSB载体（p24为13,000 ng）+ IDLVrtTA2s-M2载体（p24为48,000 ng）。 
		第#6、#7、#8、#9孔的稀释液：IDLVTKSB载体（p24为13,000 ng）+ IDLVrtTA2s-M2载体（p24为48,000 ng）+ IDLVT2载体（p24为9,160 ng）。</li>
		<li>将每种慢病毒载体稀释液（1 mL）加入对应的角质形成细胞悬液（1.6×105 个角质形成细胞溶于1 mL）中，对悬浮细胞进行转导。</li>
		<li>吸除第0天接种的致死性照射3T3-J2细胞的培养基，将转导后的角质形成细胞（1.6×105 个细胞溶于2 mL）接种至其上。完成一个孔的转导后，立即进行下一个孔的操作。</li>
		<li>在25 °C孵育30分钟，然后将细胞转移至细胞培养箱中37 °C继续孵育6小时。 
		注意：请勿对原代角质形成细胞进行离心感染（spinoculation），否则细胞活力和增殖将受到严重影响。</li>
		<li>6小时后，向每孔加入1 mL cFAD培养基。向第#5、#8和#9孔中加入1 μM多西环素（终浓度）。将细胞放回37 °C继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：将cFAD培养基更换为含10 ng/mL EGF的3 mL KC培养基。</li>
	<li>第3天：按照前述方法（参见步骤4.4.1至4.4.6）对第#1、#4和#5孔的细胞进行胰蛋白酶消化和洗涤。将细胞沉淀在-80 °C冻存，用于后续总RNA提取及qRT-PCR分析（参见步骤7）。</li>
	<li>按照步骤4.4.1至4.4.5所述方法对第#2、#6和#8孔的细胞进行胰蛋白酶消化，并进行GFP表达的流式细胞荧光分析（参见步骤5）。</li>
	<li>继续培养第#3、#7和#9孔的细胞至少3-4次倍增周期，以充分稀释未整合的IDLVT2载体（对于接种在饲养层上的原代人角质形成细胞，约需5天）。</li>
	<li>第6天：转导后约5天，对第#3、#7和#9孔的细胞进行胰蛋白酶消化（参见步骤4.4.1至4.4.5），并进行GFP表达的流式细胞荧光分析（参见步骤5）。 
	注意：实验时间安排和转导效率受原代细胞类型及样本个体差异的显著影响。</li>
</ol>
5. 转导原代角质形成细胞的流式细胞荧光分析
注意：使用配备蓝色激光器（488 nm）、红色激光器（633 nm）以及用于检测 GFP 和 APC 荧光的滤光片的流式细胞仪（参见材料表）。
<ol>
	<li>为了区分角质形成细胞与3T3-J2饲养层，使用小鼠单克隆APC标记的抗饲养层抗体对第3天和第6天解离的转导角质形成细胞进行标记（见步骤4.7和4.9）。
	<ol>
		<li>为每个样本准备 4 mL 染色缓冲液： 
		5% FBS                                                                 200 μL 
		500 mM EDTA（终浓度 = 2.5 mM）         20 μL 
		PBS 1x 3780 μL</li>
		<li>用1 mL染色缓冲液重悬离心管中的细胞，580 × g离心5分钟，弃上清液。</li>
		<li>在用于流式细胞术检测的试管中，重悬 5x104 在100 μL染色缓冲液中重悬细胞，加入2 μL Anti-Feeder抗体（1:50）。充分混匀，冰上避光孵育30分钟。</li>
		<li>孵育30分钟后，加入2 mL染色缓冲液洗涤。在580 × g离心5分钟，弃去上清液。用200 μL染色缓冲液重悬细胞。</li>
		<li>通过流式细胞术分析获取 APC 和 GFP 信号18GFP+ APC 的细胞组分-&#160; 细胞群体表明已转导的角质形成细胞。 
		注意：如需要，可用含1× PBS的2%多聚甲醛固定染色后的样本，并在4 °C避光保存至上机检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过绘制GFP阳性细胞百分比的比值来分析流式细胞术数据+ 终点时（5 天）的细胞及 GFP 阳性细胞百分比+ 转导后2天的细胞，以IDLVT2转导细胞的残留水平为基准进行归一化。</li>
</ol>
6. 半定量 RT-PCR
注意：使用 PCR 梯度热循环仪。
<ol>
	<li>根据试剂盒制造商的说明书，使用RNA纯化试剂盒从转导细胞或对照细胞中提取总RNA。 
	注意：总RNA可在-80 °C下保存。</li>
	<li>使用100 ng总RNA和逆转录试剂盒，按照制造商说明书在20 µL反应体系中合成cDNA。 
	注意：cDNA可在-20 °C下保存。</li>
	<li>设计针对SB100X、rtTA2s-M2和GAPDH（一个看家基因）的特异性引物。 
	建议的引物设计如下： 
	SB正向引物：5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3' 
	SB反向引物：5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3' 
	rtTAM2正向引物：5'-GACGACAAGGAAACTCGCTC-3' 
	rtTAM2反向引物：5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3' 
	GAPDH正向引物：5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 
	GAPDH反向引物：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'</li>
	<li>在最终反应体积为50 µL的体系中进行PCR。具体而言，在每个PCR管中加入以下组分： 
	cDNA（1:5稀释，来自步骤6.2）                      1.00 µL 
	正向引物（10 µM母液）                             1.00 µL 
	反向引物（10 µM母液）                            1.00 µL 
	dNTPs（10 µM母液）                                 1.00 µL 
	缓冲液（含MgCl2，10x母液）                      5.00 µL 
	Taq DNA聚合酶（5 U/µL母液）                    0.25 µL 
	无菌水                                                    40.75 µL</li>
	<li>使用以下PCR仪程序：95 °C预变性5分钟（1个循环），随后进行34个循环的SB100X扩增（95 °C变性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸30秒）；rtTA2s-M2扩增进行32个循环（条件同上）；GAPDH扩增进行25个循环（条件同上）。</li>
	<li>制备1%琼脂糖凝胶。将1 g琼脂糖溶于100 mL 1x TBE缓冲液（由10x母液用无菌水稀释而成）中，置于烧杯或锥形瓶内。微波炉加热溶解，每隔一分钟摇匀一次，直至琼脂糖完全溶解。待熔化的琼脂糖冷却至约50 °C时，加入5 µL溴化乙锭（10 mg/mL母液）。将熔化的琼脂糖倒入已安装梳子的凝胶模具中，进行凝胶制备。</li>
	<li>将样品（每样10 µL）上样至琼脂糖凝胶，并进行电泳。</li>
	<li>如需要，可拍摄凝胶图像并对PCR条带进行密度分析。</li>
</ol>
7. 定量反转录PCR（qRT-PCR）
注意：使用商用序列检测系统。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的PCR引物和6-羧基荧光素（FAM）探针均购自商业供应商。
<ol>
	<li>关于逆转录，请参见步骤 6.2。</li>
	<li>使用软件设计针对 SB100X 的特异性引物和探针。 
	建议设计如下： 
	SB.2 正向引物：5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3'， 
	SB.2 反向引物：5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3' 
	探针 SB FAM：5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'</li>
	<li>在 96 孔板中使用 PCR 主混合液及引物 + 探针混合液进行实时 PCR，最终反应体积为 25 µL。具体每孔反应体系如下： 
	cDNA（用无菌水 1:10 稀释）            1.00 µL 
	2x 主混合液                                        12.50 µL 
	引物 + 20x 探针混合液                           1.25 µL 
	无菌水                                           10.25 µL 
	注意：所有反应均需设置三个重复。为避免移液误差，应至少配制 n+3 个反应的混合液（不含 cDNA），并使用多通道移液器分装。</li>
	<li>采用以下程序运行实时 PCR：95 °C 预变性 10 分钟 1 个循环，随后进行 40 个循环：95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟，最后 4 °C 保存。</li>
	<li>采用 2-ΔΔCT 定量法，通过典型数据分析软件将 SB100X 的相对表达量（RQ 值）归一化至同一 cDNA 样本中 GAPDH 的表达水平，进行 qRT-PCR 数据分析。</li>
</ol>

<ol><li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
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<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种通过Sleeping Beauty介导的转座技术，将目的基因（GOI）稳定整合到靶细胞基因组中的广泛应用方法。尽管SB系统最初旨在提供一种非病毒的基因组编辑手段，但高效递送整合工具（转座酶和T2转座子）仍是必要前提。因此，近年来为在难以转染的原代细胞中应用SB系统，研究者采用了病毒载体递送SB组分10,12,15。然而，迄今为止所使用的病毒载体均未解决转座酶持续表达的问题，而持续表达可能导致转座子不可控地再次跳跃，带来潜在风险。
为了转录调控转座酶的表达，我们采用了改良的Tet-ON系统16。在多西环素（dox）存在的情况下，rtTA2s-M2调节因子与融合了TetO元件的最小TK启动子结合，可在背景水平之上实现对转座酶激活的精细调控（无dox时为关闭状态）。该调控效果依赖于适当的IDLVs（IDL...

超活性SB100X转座酶与基于T2的转座子联用已应用于临床前基因治疗1,2,3、基因组修饰4,5以及诱导性多能干细胞（iPSC）重编程6,7。通常，SB组分通过质粒转染瞬时提供，并由强组成型启动子驱动转座酶的表达。然而，尽管转染技术已有改进，该双组分系统的递送在许多应用中仍具挑战性，因此开发新的递送方案日益受到关注。除质粒8和mRNA9的转染方法外，过去还提出了基于腺病毒10,11、腺相关病毒（AAV）12、杆状病毒13、γ-逆转录病毒14和慢病毒载体15的病毒递送方法。值得注意的是，所选系统必须确保SB组分的瞬时递送，且病毒载体本身不发生整合。然而，转座酶的持续表达因存在转座子不可控再跳跃的风险而引发安全性担忧。
因此，通过优化的Tet-ON系统对SB100X进行转录调控是首要挑战。该系统采用一种改良的Tet响应型启动子，其通过将原先开发的最小巨细胞病毒（CMV）启动子替换为单纯疱疹病毒-1型（HSV-1）胸苷激酶（TK）基因的最小启动子（-81）而获得16，克隆至 SB100X cDNA 上游（pTetOTKSB100X）。突变型反向四环素转录激活因子 rtTA2s-M217 在另一个质粒（pCCL-PGKrtTA2）中克隆的强组成型启动子（磷酸甘油酸激酶启动子，PGK）的调控下表达S-M2)。当加入培养基时，多西环素（dox）会结合rtTA2s-M2调节剂并锚定四环素启动子复合物，从而实现对SB100X表达的严格调控18.
第二个主要挑战源于多种物理和化学方法在人类原代细胞中的转染效率较低。为了高效地将转座酶递送至对转染具有抗性的细胞，将SB100X和rtTA2s-M2表达盒分别包装到两种整合缺陷型慢病毒载体（IDLVs）19中：IDLVTKSB和IDLVrtTA2s-M2。这些病毒载体在HEK293T细胞中以第三代载体形式瞬时产生20，并使用水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus, VSV-G）的糖蛋白G进行假型化，从而赋予其广泛的感染谱。病毒颗粒通过超速离心浓缩，并通过HIV-1 Gag p24免疫捕获法测定滴度。在转导细胞系和原代细胞时，将病毒颗粒与polybrene形成复合物，并在有或无多西环素（dox）的情况下与靶细胞共孵育。通过定量RT-PCR（qRT-PCR）18检测转导细胞中SB100X表达的药物依赖性激活情况。
一旦证实了Tet调控的SB100X表达，目的基因（例如绿色荧光蛋白，GFP）向靶细胞基因组的转座过程将遵循Bak和Mikkelsen所清晰图示的分子事件21。需要构建第三种携带目的基因表达盒的IDLV载体，该表达盒克隆于T2转座子IR序列之间（IDLVT2），并如上所述进行包装。最后，这三种IDLV载体可高效转导人细胞（例如原代角质形成细胞）in vitro，并在多西环素存在条件下实现目的基因的整合18。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;含4.5 g/L葡萄糖、不含L-谷氨酰胺的s培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>HyClone 胎牛血清（美国），已鉴定</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td>用于生产慢病毒颗粒的血清采用 HEK293T 细胞培养。</td></tr><tr><td>青霉素 10,000 UI/ml，链霉素 10,000 UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>细胞培养基试剂</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>细胞培养基试剂</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液，生理盐水中1M储备液</td><td>Lonza</td><td>BE17-737E</td><td>HBS 2X 配制用试剂。</td></tr><tr><td>Na₂HPO₄·2H₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O），99.5%</td><td>默克</td><td>106580</td><td>用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。</td></tr><tr><td>盐酸 - ACS 级试剂 37% (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。</td></tr><tr><td>注射用无菌水</td><td>Fresenius Kabi</td><td>-</td><td>用于制备2倍浓度HBS缓冲液的试剂。</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m PESS 滤膜</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td>用于去除病毒上清液中细胞碎片的滤器。</td></tr><tr><td>Polyallomer Beckman 离心管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>326823</td><td>用于通过超速离心浓缩IDLV载体的离心管</td></tr><tr><td>不含 Ca、Mg 的 1× PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>用于细胞洗涤和慢病毒颗粒重悬的缓冲液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>（可选）用于慢病毒颗粒重悬的缓冲液</td></tr><tr><td>HIV-1 Gag p24 免疫捕获试剂盒</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK50001KT</td><td>用于IDLV颗粒滴定的试剂盒</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>提高转导效率的试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（10倍浓度）2.5%（溶于不含钙、镁的HBSS中）</td><td>GIBCO</td><td>BE17-160E</td><td>用于解离HeLa细胞的试剂（储存液，需稀释）。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）</td><td>100938B</td><td>AnalaR BDH</td><td>用于配制胰蛋白酶工作液的试剂。</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA，无酚红（10倍浓缩液）</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>用于解离角质形成细胞的试剂（储存液，需稀释）。</td></tr><tr><td>新西兰来源的供体牛血清</td><td>GIBCO</td><td>16030-074</td><td>中国台湾小鼠3T3-J2细胞培养（饲养层）用血清</td></tr><tr><td>火腿&amp;rsquo;s F12 培养基</td><td>GIBCO</td><td>21765</td><td>角质形成细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>海拉细胞培养基用血清</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，澳洲来源</td><td>GIBCO</td><td>10099-141</td><td>人原代角质形成细胞培养基用血清</td></tr><tr><td>牛胰腺来源的胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>角质形成细胞生长试剂</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>VWR</td><td>1152-25</td><td>角质形成细胞生长试剂</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>VWR</td><td>3867-1</td><td>角质形成细胞生长试剂</td></tr><tr><td>霍乱弧菌霍乱毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>角质形成细胞生长试剂</td></tr><tr><td>三碘甲状腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>角质形成细胞生长试剂</td></tr><tr><td>人表皮生长因子</td><td>Austral Biological</td><td>GF-010-9</td><td>角质形成细胞生长试剂</td></tr><tr><td>小鼠单克隆APC标记抗饲养层抗体</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-099</td><td>标记饲养层。</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA纯化试剂盒</td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>Life Technologies</td><td>18080051</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>脱氧核苷酸混合物，10 mM（dNTP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7295</td><td>半定量PCR试剂</td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>用于半定量 PCR 和 qRT-PCR 的试剂。</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Hot Start 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M740B</td><td>Taq 聚合酶</td></tr><tr><td>琼脂糖，用于分子生物学</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>琼脂糖凝胶电泳试剂</td></tr><tr><td>UltraPure TBE 缓冲液，10X</td><td>Invitrogen</td><td>15581028</td><td>琼脂糖凝胶电泳试剂，使用去离子水稀释至1X浓度。</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>琼脂糖凝胶电泳试剂</td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9891</td><td>用于在HeLa细胞和角质形成细胞中诱导转座酶表达的药物</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystem</td><td>4304437</td><td>包含引物和探针的TaqMan通用PCR主混合液</td></tr><tr><td>15 mL 高透明度聚丙烯离心管，锥形底，带圆顶密封螺旋盖，无菌</td><td>Falcon Corning</td><td>352096</td><td>用于细胞收集和载体稀释制备的试管。</td></tr><tr><td>150 mm 细胞培养皿（经TC处理，带20 mm网格），无菌</td><td>Falcon Corning</td><td>353025</td><td>用于病毒生产的细胞培养皿</td></tr><tr><td>6孔透明平底TC处理细胞培养板，带盖，独立包装，无菌</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td>用于HeLa细胞和人原代角质形成细胞转导的细胞培养板</td></tr><tr><td>安全锁微量离心管，体积 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>用于稀释液配制的试管。</td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量离心管，体积 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>用于稀释液配制的试管。</td></tr><tr><td>0.2 ml PCR管，带平盖，无RNase、DNase、DNA和PCR抑制剂</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>用于半定量 PCR 的试管</td></tr><tr><td>MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码），0.1 mL</td><td>应用生物系统公司</td><td>4346906</td><td>用于qRT-PCR的96孔板</td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管，无盖</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td>用于流式细胞术检测的试管。</td></tr><tr><td>一次性血清移液管，聚苯乙烯材质，独立包装，无菌（不同规格）</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>用于无菌组织培养的移液器</td></tr><tr><td>滤器小贴士，无菌且无RNase、DNase、DNA和内毒素（不同规格）</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>用于无菌组织培养和分子生物学应用的滤芯吸头。</td></tr><tr><td>pH计</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>用于测量 HBS 2X pH 的设备</td></tr><tr><td>PCR热循环仪</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>半定量 PCR 仪器设备</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳设备</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>用于半定量 PCR 的琼脂糖凝胶电泳设备</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II 2LSR 4/2</td><td>BD</td><td>-</td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>7900HT Fast 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>应用生物系统</td><td>7900HT</td><td>qRT-PCR 仪器设备</td></tr><tr><td>用于细胞培养应用的台式离心机，带微孔板桶，带制冷功能，适用于高效样品处理。</td><td>（任意）</td><td>-</td><td>用于细胞培养处理和离心感染的离心机。</td></tr><tr><td>Optima L-90K 超速离心机配备 SW32TI 转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>-</td><td>用于慢病毒颗粒生产的超速离心机</td></tr><tr><td>细胞培养和分子生物学实验室设备（例如，适用于 BSL2 级材料操作的 II 级生物安全柜、细胞培养孵育箱、冰箱和冷冻柜（+4 °C、-20 °C 和 -80 °C）） &amp;deg;C，-20 &amp;deg;C，-80 &amp;deg;C）、微量移液器和移液辅助器）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>根据研究所规定，特别是在慢病毒颗粒制备和转导过程中，需穿戴防护实验服、手套和面部防护装备。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

的 睡美人 （SB）转座子是一种非病毒整合系统，在基因转移和功能基因组学中已证明具有显著功效。为优化SB转座子系统，本研究采用转录调控的高活性转座酶（SB100X）和基于T2的转座子。通常，转座酶和转座子通过质粒转染瞬时提供，SB100X的表达由组成型启动子驱动。本文描述了一种高效递送SB组分至对多种物理和化学转染方法具有抗性的哺乳动物细胞的方法，可调控SB100X的表达，并实现目的基因（GOI）的稳定整合 &#34;剪切并粘贴&#34; SB 机制。高活性转座酶的表达由 Tet-ON 系统严格调控，该系统自1992年以来被广泛用于控制基因表达。目的基因两侧为 T2 转座子的反向重复序列（IR）。SB 的两个组分均被包装至整合缺陷型慢病毒载体中，这些载体在 HEK293T 细胞中瞬时产生。人类细胞，包括细胞系或来自人体组织的原代细胞， 体外 使用病毒载体进行瞬时转导。当在培养基中加入多西环素（dox，四环素类似物）后，可精确调控转座酶的表达水平，从而实现目的基因在受处理细胞基因组中的长期稳定整合。该方法高效，适用于细胞系（如 HeLa 细胞）和原代细胞（如人原代角质形成细胞），因此是基因工程和治疗性基因转移的重要工具。

使用此处介绍的程序，可构建三种携带受调控SB组分（SB100X、rtTA2）的IDLV载体S-M2 和 T2-GFP 转座子）被包装并用于在人细胞中高效递送并严格调控SB系统。 图1A 展示了一个方案 体外 转导HeLa细胞，该操作旨在评估两种IDLV载体以最佳剂量组合对SB转座酶的转录调控（已在报道中提及） 表 2）。通过qRT-PCR检测SB100X的转录调控图1B）并相对于关闭状态（IDLVTKSB单独处理，RQ=1）以相对定量（RQ）值表示。在转导的HeLa细胞中，加入多西环素（+dox）后SB100X的表达量达到背景水平（IDLVTKSB）的8倍激活效果。值得注意的是，在未添加多西环素的情况下共转导的HeLa细胞中，转座酶的表达水平与关闭状态相当，表明rtTA2对TetTK启动子具有严格的调控能力。sM2 调节剂
<p class="jove...

本方案描述了一种通过转录调控实现目的基因在人类基因组中稳定整合的方法 睡美人 系统。缺陷型慢病毒载体整合的制备 体外 报告了人类细胞的转导以及对转导细胞的分子检测。

睡美人（Sleeping Beauty，SB）转座子是一种经过验证的非病毒整合系统，可用于基因转移和功能基因组学研究。为优化SB……

本方法的总体目标是通过转录调控的、包装于整合缺陷型慢病毒载体中的Sleeping Beauty系统，将目的基因稳定整合到原代细胞的人类基因组中。该方法有助于回答基因治疗领域中的关键问题，例如利用Sleeping Beauty系统将目的基因整合到原代细胞中的可行性。该技术的主要优势在于，可诱导的高活性Sleeping Beauty系统能够高效递送并转导对多种转染方法具有抗性的原代细胞。本实验操作将由我实验室的博士后 Daniela Benati 演示。在转导前一天，按照文本方案中所述方法培养人原代角质形成细胞。为从培养皿中解离亚融合状态的角质形成细胞，需移除培养基，用 1X PBS 洗涤细胞，然后向每孔加入 1 毫升预热的胰蛋白酶工作液。在细胞培养箱中于 37 摄氏度孵育 15 分钟。充分重悬一个孔中的细胞，并将细胞悬液转移至含有 2 mL 含血清培养基的离心管中。用 3 mL 1× PBS 冲洗该孔一次，并将冲洗液加入含有细胞悬液的离心管中。在580 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。用5毫升1× PBS洗涤细胞，在580 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。在15毫升聚丙烯管中，将1.6 × 10⁵个角质形成细胞重悬于1毫升CFAD培养基中。为每种条件准备一种稀释液。三种整合缺陷型慢病毒（IDLV）载体已在前文文字方案中描述过，预先制备完成。IDLVTKSB 携带由 TET 调控的高活性 SB100X 转座酶。IDLVrtTA 编码调控因子，IDLVT2 携带目的基因。本示例中，绿色荧光蛋白（GFP）位于转座子反向重复序列之间。根据本表所示，将慢病毒载体稀释于 1 毫升 CFAD 培养基中，并加入 20 微升聚凝胺（polybrene）。一、二、三为不含载体的阴性对照。四和五含有IDLVTKSB和IDLVrtTA。六、七、八和九含有全部三种慢病毒载体。将每种慢病毒载体稀释液加入对应的角质形成细胞悬液中，以转导悬浮状态的细胞。移除一天前已接受致死性照射且已收缩的3T3-J2饲养层细胞中的培养基，将转导后的角质形成细胞接种至其上。完成一个孔的转导后，继续进行下一个孔的操作。在25摄氏度下孵育30分钟。然后将细胞转移至37摄氏度继续孵育6小时。6小时后，向每个孔中加入1毫升CFAD培养基。向第五、第八和第九孔中加入一微摩尔的多西环素。将细胞放回37摄氏度培养箱中。随后，按照文本方案中所述处理各孔中的细胞。进行流式细胞荧光分析时，必须使用小鼠单克隆 APC 标记抗饲养层抗体对第 3 天和第 6 天脱落的转导原代角质形成细胞进行标记，以将其与 3T3-J2 饲养层细胞区分开来。通过将 5% FBS、500 毫摩尔 EDTA 和 1× PBS 混合，为每个样本配制 4 毫升染色缓冲液。用 1 毫升染色缓冲液洗涤脱落的细胞。在580 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。在用于流式细胞术检测的试管中，将5 × 10⁴个细胞重悬于100 µL染色缓冲液中。加入2 µL抗Feeder抗体（稀释比例为1:50），充分混匀。在避光冰上孵育30分钟。30分钟后，用2毫升染色缓冲液洗涤。以580 × g离心5分钟。弃去上清液，并用200微升染色缓冲液重悬。使用配备蓝色激光、红色激光以及用于检测GFP和APC荧光的滤光片的流式细胞仪，获取APC和GFP信号。APC阴性细胞群体中GFP阳性细胞的比例代表已转导的角质形成细胞。进行实时 PCR 时，在 96 孔板中设置三个重复反应，每个反应的终体积为 25 微升。每个反应体系包含 1 微升 cDNA、12.5 微升 2X 主混合液、1.25 微升 20X 探针混合液中的引物，以及 10.25 微升无菌水。按照以下 PCR 程序运行实时 PCR：95°C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95°C 变性 15 秒和 60°C 退火延伸 1 分钟，最后在 4°C 保存。最后，按照文本方案中所述分析实时 PCR 数据。对转导了不同剂量转座子的调节载体并在有或无多西环素存在下处理的 HeLa 细胞进行表达分析，结果显示需要高剂量的两种 IDLV 才能显著诱导 SB100X 表达。在有或无调节载体存在下，对转导了转座子载体的 HeLa 细胞中 SB100X 表达进行定量分析，发现在多西环素存在时，其表达水平较背景高出八倍。经转导携带转座子和调节因子载体的角质形成细胞中，转录调控的 Sleeping Beauty 系统也可用于原代细胞。SB100X 在这些细胞中的表达显示出比关闭状态高出15倍的激活水平。在角质形成细胞中进行的转座实验中，细胞被三种 IDLV 载体转导，并分别添加或不添加多西环素，结果表明，经多西环素处理的细胞中有12%在其基因组中稳定整合了至少一个拷贝的 GFP。一旦掌握，原代细胞中的关键转导过程可在八小时内完成，流式细胞分析需两小时，若操作得当，表达分析可在三小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住优化用于转导原代细胞的载体剂量组合，以实现可诱导型Sleeping Beauty转座酶的更高表达水平。在此步骤之后，可进一步采用其他方法，如定量PCR和连接介导PCR，以回答更多问题，例如每细胞转座子拷贝数以及基因组整合位点分布等。该技术问世后，为基因治疗领域的研究人员探索“睡美人”系统在临床相关细胞工程化中的应用铺平了道路。观看视频后，您应能充分掌握以下操作：首先，如何利用IDLV载体转导原代角质形成细胞；其次，如何通过多西环素诱导条件检测高活性转座酶的表达；最后，如何通过流式细胞术追踪转座过程。请务必注意，操作病毒载体可能具有极高危险性，因此在进行这些操作时，应始终采取适当的预防措施，例如使用生物安全柜（BCL）来控制污染水平，并随身配备一次性耗材。

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学习利用转录调控的Sleeping Beauty系统，通过整合缺陷型慢病毒载体将目的基因稳定整合到原代人角质形成细胞基因组中。该方法为基因治疗研究提供了高效可靠的基因递送方案。

一种高效的方法体外通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

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一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

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