小鼠骨髓基质细胞与破骨细胞前体的分离、培养及分化

本实验的总体目标是分离并培养骨髓基质细胞（BMSCs）。该方法有助于解答骨生物学和脂肪细胞领域中有关前体细胞的关键问题。该技术的主要优势在于，BMSCs 可以以相对快速、可重复且经济的方式进行分离。

该方法的可视化演示非常有用，因为仅用文字难以清楚描述解剖步骤。在开始取骨操作前，为每三根待取的骨骼，在一个1.5毫升微量离心管中加入100 µL骨髓干细胞培养基。同时，为每个微量离心管剪去一个200 µL移液器吸头的末端，以便每个吸头能够放入离心管中且管盖可以盖紧。

接下来，将第一只78周龄的安乐死小鼠置于解剖板上，仰卧位固定，并用70%乙醇喷洒动物体表。用镊子在腹部提起皮肤形成帐篷状，使用无菌解剖剪在皮肤上做一个约1厘米长的切口。向后剥离皮肤，暴露下腹部和腿部。

沿每个髋部的髂嵴切开，将股骨头与骨盆分离，并通过骨盆中线切开以分离髂骨，再在踝关节下方切开以去除足部。然后，在膝关节处切割，将胫骨与股骨分离。接着，使用无绒布小心地去除股骨、胫骨和髂骨上的肌肉。

当收集完所有骨骼后，将样本置于冰上的 PBS 中，并转移至无菌培养罩内。采用无菌操作技术，在每根骨骼的近端和远端各做 1 至 2 毫米的切口，然后将三根骨骼放入每个经改造的微量移液器吸头中，置于微量离心管内。通过离心法收集骨骼中的骨髓，并在离心结束时确认骨髓是否已完全沉淀至每根微量离心管底部。

如果骨髓已全部收集完毕，骨骼将呈现白色。将微量移液器吸头和骨骼从收集管中取出，并按照生物安全要求进行妥善处理。为了接种骨髓细胞，首先使用配备25号针头的1毫升注射器缓慢重悬细胞沉淀，以打散任何团块，并将所有样品汇集至一个15毫升的锥形管中。

每500微升样本加入10毫升骨髓干细胞培养基，将细胞悬液通过70微米滤膜过滤至50毫升锥形管中，以去除任何骨组织碎片。计数后，将骨髓细胞以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度接种于新鲜培养基中，在37°C及5%CO₂条件下培养72小时。第3天用新鲜培养基更换上清液，之后每两天更换一次培养基，直至细胞达到80%至100%汇合度。

为了接种分选的骨髓细胞群体培养物，将一只小鼠分离得到的骨髓细胞接种至一个10厘米的细胞培养皿中，在细胞培养箱中用新鲜培养基培养48小时。培养的第二天，移除含有非贴壁造血干细胞的上清液，并用PBS小心洗涤培养皿，注意不要扰动已贴壁的骨髓细胞。随后将PBS更换为0.25%胰蛋白酶。

在37摄氏度条件下反应1至3分钟后，加入新鲜细胞培养基终止反应，并对所得的细胞悬液进行细胞计数。根据需要接种的细胞数量进行离心，将细胞沉淀重悬于适量的新鲜培养基中，以达到所需的接种密度。随后，将培养板放入细胞培养箱中孵育，直至细胞融合。

为诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化，每两天更换一次细胞培养基，换为成骨诱导培养基，直至细胞开始产生可宏观观察到的白色矿化结节。为诱导骨髓干细胞向脂肪细胞分化，将汇合生长的骨髓细胞培养物中的细胞培养基更换为脂肪细胞诱导培养基。培养两天后，将上清液更换为新鲜的脂肪细胞诱导培养基，并在第四天更换为脂肪细胞基础培养基。

在第7天，确认细胞已积累脂滴，并表现出类似于成熟脂肪细胞的表型。要将造血干细胞分化为破骨细胞，当全骨髓细胞培养物或非贴壁细胞培养物开始贴壁时，将细胞培养基更换为破骨细胞分化培养基。每两天更换一次培养基，并在光学显微镜下以10倍放大倍数每日观察破骨细胞的分化情况，直至破骨细胞融合形成多核细胞，通常在分化第5至第7天左右完成。

使用含有抗坏血酸和β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养基，可将融合生长的BMSCs诱导分化为成骨细胞。经过数天的分化后，成骨细胞开始表达碱性磷酸酶；进一步分化将触发类骨基质的生成，并最终导致该基质的矿化。

有趣的是，通过结晶紫染色可见，在体外培养中只有一部分细胞会分化为成骨细胞。无论使用混合细胞群体还是分离的骨髓细胞群体，都只有一部分细胞会分化为脂肪细胞，这些脂肪细胞呈圆形，含有多个脂滴空泡，可用油红O染料染色。在添加了小鼠细胞刺激因子和RANKL的人类干细胞培养体系中，细胞会迅速融合形成多核细胞，且抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色呈阳性。

这些破骨细胞能够在体外吸收矿化基质，可用于评估破骨细胞活性。一旦掌握该技术，只要操作得当，根据小鼠数量的不同，可在不到一小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住对器械进行灭菌，并预先准备好培养基，以便能够尽快且尽可能无菌地操作。

观看本视频后，您应能充分掌握如何分离和培养骨髓基质细胞。