小鼠骨髓基质细胞与骨破骨祖的分离、培养及分化

该程序的总体目标是分离和培养骨髓基质细胞 （BMSC）。这种方法可以帮助回答骨骼和脂肪细胞领域中关于祖细胞的关键问题。该技术的主要优点是可以以相对较快速、可重复且成本低廉的方式分离 BMSC。

这种方法的视觉演示非常有用，因为仅用文本很难解释解剖步骤。在开始骨采集程序之前，将 100 微升骨髓干细胞培养基加入一个 1.5 毫升微量离心管中，每采集三块骨头。并从每个微量离心管的一个 200 微升移液器吸头上切下末端，以便每个吸头都可以装入一个盖子合上的情况下放入单个试管中。

接下来，将第一只 78 周龄的安乐死小鼠仰卧放在解剖板上，并用 70% 乙醇喷洒动物。用镊子在腹部做一个皮肤帐篷，用无菌解剖剪刀做一个大约一厘米的皮肤切口。剥开皮肤，露出下腹部和腿部。

沿每个髋关节的髂嵴切开，将股骨头与骨盆分开，并在骨盆中线切开，将髂骨分开，在踝关节以下切开，去除脚。然后，通过切割膝关节将胫骨与股骨分开。然后，使用无绒湿巾小心地去除股骨、胫骨和髂骨的肌肉。

收集完所有骨骼后，将样品置于冰上的 PBS 中，然后将样品转移到无菌培养罩中。使用无菌技术，在每个骨头的近端和远端进行 1 到 2 毫米的切割，然后将三根骨头放入微量离心管中的每个改良微量移液器吸头中。通过离心从骨骼中收获骨髓，确认骨髓在旋转结束时是否已完全沉淀到每个微量离心管的底部。

如果已收集所有骨髓，则骨骼将显示为白色。从收集管中取出微量移液器吸头和骨头，以便进行适当的生物安全处理。要对骨髓细胞进行铺板，首先使用配备 25 号针头的 1 毫升注射器缓慢地重新悬浮沉淀并打碎任何团块，然后将样品汇集到一个 15 毫升锥形管中。

每 500 μL 样品添加 10 mL骨髓干细胞培养基，并通过 70 μm 过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL锥形管中，以去除任何骨碎片。计数后，将骨髓细胞以每平方厘米密度 10 至 6 个细胞的一次接种在新鲜培养基中，在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 72 小时。第 3 天，用新鲜培养基替换上清液，此后每两天更换一次培养基，直到细胞达到 80% 至 100% 汇合。

为了对分裂的骨髓细胞群培养物进行铺板，将一只小鼠收获的骨髓细胞接种到 10 cm 细胞培养皿中，在细胞培养箱中的新鲜培养基中放置 48 小时。在培养的第二天，去除非贴壁的含造血干细胞的上清液，并用 PBS 小心洗涤板，不要干扰贴壁的骨髓细胞。用 0.25% 胰蛋白酶替换 PBS。

在 37 摄氏度下放置 1 到 3 分钟后，用新鲜细胞培养基淬灭反应，并对所得细胞悬液中的细胞进行计数。离心适当数量的细胞进行铺板，并将沉淀重悬于足够的新鲜培养基中，以获得所需的铺板密度。然后，将板放入细胞培养箱中直至汇合。

为了诱导骨髓干细胞成骨细胞分化，每两天用分化培养基更换细胞培养基，直到细胞开始产生可以在肉眼下观察到的白色矿化结节。为了诱导骨髓干细胞脂肪细胞分化，用脂肪细胞诱导培养基替换融合骨髓细胞培养物的细胞培养基。培养两天后，用新鲜的脂肪细胞诱导培养基替换上清液，在第 4 天改用脂肪细胞基础培养基。

第 7 天，确认细胞已积累脂滴，并且它们表现出与成熟脂肪细胞相似的表型。为了将造血干细胞分化为破骨细胞，当全骨髓细胞培养物或非贴壁细胞培养物变得贴壁时，用破骨细胞分化培养基替换细胞培养基。每两天更换一次培养基，每天在光学显微镜下以 10 倍放大倍率检查破骨细胞分化，直到破骨细胞融合并形成多核细胞，通常在分化的第 5 至 7 天左右。

使用由抗坏血酸和 β-甘油磷酸酯组成的成骨培养基，BMSC 的汇合培养物可以分化为成骨细胞。分化几天后，成骨细胞开始表达碱性磷酸酶。进一步的分化将触发类骨质基质的产生，并最终触发该基质的矿化。

有趣的是，只有一部分细胞会在体外分化成成骨细胞，如结晶紫染色所示。无论使用混合细胞群还是分裂的骨髓细胞群，只有一部分细胞会分化成脂肪细胞，脂肪细胞表现为具有多个脂质液泡的圆形细胞，可以用油红 O 染料染色。补充有小鼠细胞刺激因子和 RANKL 的人干细胞培养物将迅速融合，形成 TRAP 染色呈阳性的多核细胞。

这些破骨细胞能够在体外重新吸收矿物基质，可用于评估破骨细胞活性。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在不到一个小时的时间内完成，具体取决于小鼠的数量。在尝试此程序时，请务必记住对工具进行消毒并提前准备培养基，以便能够尽可能快速和无菌地工作。

看完这个视频，你应该对如何分离和培养骨髓基质细胞有了很好的了解。