成年小鼠背根节外植体和分离细胞模型调查可塑性和对包括病毒感染在内的环境侮辱的反应

在本报告中, 强调了脊髓培养和分离的原代培养的小鼠背根神经节的优势, 以调查与神经元-胶质细胞相互作用的广泛机制, 可塑性,neuroinflammation 和对病毒感染的反应。

该程序的总体目标是创建背根神经节外植体和/或 DRG 衍生的原代解离细胞模型的离体模型，以研究神经元对环境线索的反应。这种方法可以帮助回答神经可塑性或响应病原体暴露的神经炎症领域的关键问题。该技术的主要优点是背根神经节外植体保持了器官样复杂性，有助于启动细胞周期发挥作用，并由于特定处理而改变细胞间微环境。

这种方法的观察演示非常关键，因为由于它们的大小和位置，识别 DRG 以及收获它们可能非常困难。要开始此过程，请使用细剪刀在背侧切开动物的皮肤层，从而暴露脊柱。接下来，通过切开脊柱两侧的肋骨和骶骨来隔离脊柱，将脊柱与动物的其余部分分开。

之后，使用针头和针将腹侧朝上的脊柱安装到手术垫上。然后在椎体的两侧做一个双切口，露出椎管的腹侧。在手术显微镜下，轻轻移动一侧的脊髓，露出对侧背脊髓根，并沿着周围神经的背根定位 DRG。

每个神经节部分隐藏在椎间孔内。要收获 DRG，请用一把镊子捏住背根，然后轻轻地从椎间孔中拉出 DRG。然后将第二个镊子放在 DRG 外周的脊神经上，并将 DRG 与脊神经和脊髓根一起拉动。

随后，将收集的 DRG 放入含有 3 毫升冰冷、无血清培养基的 35 毫米培养皿中。将每个 DRG 转移到干燥的玻璃培养皿中。在手术显微镜下，使用刀片清洁并修剪掉仍附着在 DRG 上的多余纤维和结缔组织。

DRG 很容易识别为沿白色脊神经的凸起透明结构，并且经常在 DRG 周围发现血管。之后，将清洁后的 DRG 放入含有冰冷、无血清培养基的新培养皿中。在冰冷的无血清培养基中以 1：1 的比例稀释凝胶状蛋白质混合物。

然后将 DRG 离体接种在预涂有 10 或 20 微升凝胶状蛋白质混合物的 12 孔板中。并将它们保持在 37 摄氏度 30 到 60 分钟。现在向培养系统中轻轻添加 1.5 至 2 mL 无血清培养基，以覆盖整个外植体并保持外植体在培养条件下。

每 72 小时更换一次 DRG 生长培养基，并根据需要让 DRG 生长。这是一个关键步骤，因为 DRG 使用凝胶状蛋白质混合物固定在玻璃板上。因此，时间分析和移液技巧对于避免漂浮至关重要。

在此过程中，将所有收集的 DRG 放入装有含有胶原酶 4 的 F12 培养基的 1.5 毫升无菌管中，并在 37 摄氏度下孵育 45 分钟。然后，更换含有胶原酶 4 的新鲜培养基，并将样品再孵育 45 分钟。然后在胶原酶 4 处理后立即在 37 摄氏度下用两毫升含有 0.025% 胰蛋白酶的 F12 培养基处理外植体 30 分钟。

与两毫升含有胎牛血清的 F12 培养基在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。然后，用 2 毫升 F12 培养基洗涤外植体 3 次，然后用玻璃移液管机械分离它们，直到培养基变得浑浊。然后，通过 0.22 微米过滤器过滤解离的细胞培养物，以去除任何杂质和多余的结缔组织。

然后将过滤后的细胞裂解物离心 2 分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬于 500 微升 Nurobasal 培养基中。将解离的细胞以首选的细胞密度放在层压涂层的盖玻片上。

在此步骤中，在无血清培养基中制备正确稀释度的病毒，以便在处理 DRG 衍生的解离细胞时使用一个单位的 MOI 感染模型。将要感染病毒的外植体置于含有无血清培养基和病毒混合物的无菌细胞板中。然后将细胞板或试管置于 37 摄氏度以发生感染。

现在将样品固定在 4% 福尔马林中。在 PBS 中洗涤 3 次，每次 10 分钟。然后将样品与用 PBST 和 10% 正常山羊血清稀释的所需一抗一起孵育。

将样品在 4 摄氏度下储存过夜。第二天，用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。将样品在室温下与用 PBS 稀释的适当二抗中孵育 1 小时。

然后用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。在封片步骤之前，将样品与 Hoechst 染料在 PBS 中孵育 20 分钟。随后，使用荧光封固剂和盖玻片将样品封固在载玻片上。

在这张图片中，使用红色的抗病毒 GD 抗体揭示了沿着 bata 微管蛋白阳性神经突描绘的解离卫星细胞的 HSV-1 感染。卫星神经胶质细胞核用 Hoechst 染成蓝色。相同的抗体揭示了病毒进入解离的 DRG 神经元。

细胞用细胞膜上表达的抗硫酸乙酰肝素抗体共标记。硫酸乙酰肝素也是细胞外基质的组成部分，对轴突生长起重要作用。神经元用红色的 Pariferin 标记，而 Hoechst 蓝色用于识别卫星细胞核。

一旦掌握，如果作得当，离体 DRG 提取可以在两到两个半小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住尊重时间。不要让标本变干以保持外植体的活力。

在收获 DRG 之后，可以进行其他技术，如单细胞的解离，以回答其他问题，例如环境问题对细胞间代谢的影响。开发后，这项技术为神经神经学领域的研究人员探索神经元对病原体的免疫反应铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何生成背根神经节外植体以及如何进一步生成背根神经节衍生的原代解离细胞培养物有一个很好的了解。

不要忘记，与病毒或任何其他病原体一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如通过手套和实验室外套，正确处理您的废物。