Name: 成年小鼠背根节外植体和分离细胞模型调查可塑性和对包括病毒感染在内的环境侮辱的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解成年小鼠背根节外植体与分离细胞培养技术，用于研究神经可塑性、神经炎症及病毒感染反应。该方法为探索神经元-胶质细胞相互作用提供了可靠的体外模型。

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我们衷心感谢中西部大学（MWU）影像核心设施以及学生团队[Chanmoly Seng、Christopher Dipollina、Darryl Giambalvo 和 Casey Sigerson]在细胞培养和成像工作中所做出的贡献。本研究工作得到了MWU对M.F.的院内资助以及对V.T.的研究启动资金的支持。

所有实验操作，包括动物的使用，均已获得机构审查委员会批准的方案（IACUC- Midwestern University）的许可。
1. 从小鼠胚胎中分离背根神经节
<ol>
	<li>采用窒息法（CO2）处死成年小鼠，随后进行断头。立即开始手术切除脊柱。
	<ol>
		<li>使用精细剪刀沿背部切开皮肤层，暴露脊柱。在脊柱两侧切断肋骨，并切断骶骨，将脊柱与动物其他部分分离，从而游离脊柱。</li>
		<li>用针或固定针将脊柱腹侧朝上固定于手术垫上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用精细剪刀在椎体两侧进行双侧切割，以暴露椎管的腹侧。</li>
	<li>在手术显微镜下（放大倍数设为4倍），用剪刀轻轻将脊髓向一侧移动，以暴露对侧背根神经，并沿周围神经的背根定位背根神经节（DRG）。每个神经节部分隐藏在椎间孔内。</li>
	<li>为收获DRG，用一把镊子夹住背根（位于脊髓与DRG之间），轻轻将DRG从椎间孔中拉出。</li>
	<li>将第二把镊子置于DRG外周的脊神经上，连同脊神经和背根一起牵拉DRG。</li>
	<li>将收集的DRG置于含有3 mL冰浴无血清培养基（SFM）34的35 mm培养皿中。</li>
	<li>将每个单独的DRG转移至干燥的玻璃培养皿中，在手术显微镜下，使用刀片清除并修剪仍附着在DRG上的多余纤维和结缔组织。DRG易于识别，表现为沿白色脊神经/根分布的膨大透明结构。血管常环绕在DRG周围。</li>
	<li>将清理后的DRG放入新的含有冰浴SFM培养基的培养皿中。</li>
	<li>将胶状蛋白混合物（见材料表）用冰浴SFM按1:1比例稀释。</li>
	<li>将DRG以ex vivo方式接种于预先包被10/20 µL胶状蛋白混合物的12孔板中，并置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30–60分钟。</li>
	<li>轻柔地向培养体系中加入1.5–2 mL SFM，覆盖整个组织块，并在培养条件下（37 °C和5% CO2）维持培养。 
	注意：此步骤至关重要，因为DRG仅通过聚合的胶状蛋白混合物锚定在玻璃器皿上。聚合时间及移液操作技巧至关重要，以避免组织漂浮。</li>
	<li>每72小时更换一次培养基，根据需要让DRG持续生长。</li>
</ol>
2. 从背根神经节中分离单细胞神经元
<ol>
	<li>将所有收集的背根神经节（DRG）放入含有1.2 mL F12培养基（含1.25 mg/mL IV型胶原酶）的1.5 mL无菌离心管中，在37 °C、5% CO2条件下孵育45分钟。第一次孵育结束后，重复此步骤再孵育45分钟。</li>
	<li>在IV型胶原酶处理后，立即用2 mL含0.025%胰蛋白酶的F12培养基在37 °C、5% CO2条件下处理组织块30分钟。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，用2 mL含胎牛血清（FBS；33%）的F12培养基孵育组织块15分钟。</li>
	<li>用2 mL F12培养基清洗组织块三次，然后用玻璃移液管进行机械性解离，直至培养基变浑浊。 
	注意：本操作涉及如前文所述从动物体内采集干净/修剪后的背根神经节（DRG）。进行组织块机械解离时应轻柔操作，避免用力过大，以防溅出或损失实验材料。</li>
	<li>将解离后的细胞悬液通过0.22 µm滤膜过滤，以去除杂质和多余的结缔组织。将滤过的细胞裂解液在2,500 × g条件下离心2分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL神经基础培养基中，该培养基需添加神经元培养用补充剂（1×）、抗生素混合物（1×）、L-谷氨酸（0.5 mM）和神经生长因子（5 µg/mL）（参见材料表）。</li>
	<li>将解离后的细胞以适宜的细胞密度接种至经层粘连蛋白包被的盖玻片（50 µg/mL；参见材料表）上。使用细胞计数仪确定细胞密度。 
	注意：我们采用每张盖玻片接种25,000个细胞。该技术可同时解离出神经元和胶质卫星细胞。与假单极神经元共培养的胶质细胞成分对神经元存活具有关键作用。</li>
</ol>
3. 背根神经节外植体及背根神经节来源的分离细胞的HSV-1感染
注意：本研究严格遵循生物安全二级（BSL-2）要求进行，我们所在的实验室已获得中西部大学生物安全委员会批准，并配备完善的设施。本研究使用了HSV-1的KOS毒株。若操作病毒毒株，请根据所在机构的指导方针采取适当的测量方法和安全防护措施。
<ol>
	<li>确定并用SFM培养基将病毒稀释至适当浓度，以用于感染模型。本研究中使用的病毒为HSV-1的KOS株。在处理DRG来源的离散细胞时，感染应使用1个感染复数（MOI）单位，即病毒数量与细胞数量相等。</li>
	<li>若感染DRG组织块，则应使用病毒颗粒数（例如，10,000个病毒颗粒），因为无法确定组织块中确切的细胞数量。</li>
	<li>将待感染的组织块或细胞置于含有SFM培养基与病毒混合液的无菌细胞培养板或离心管中。 
	注：我们对含有25,000个细胞的盖玻片使用25,000个病毒颗粒（1 MOI）。感染组织块时，我们使用10,000个病毒颗粒。</li>
	<li>将细胞培养板或离心管置于37 °C环境中进行感染；病毒感染时间可根据病毒的感染性而调整。 
	注：病毒进入已通过邻硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-gal）检测法确认26。</li>
</ol>
4. 免疫荧光
<ol>
	<li>使用磷酸盐缓冲液（PBS）配制的4%甲醛固定外植体和单细胞样品。用PBS洗涤样品，每次10分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>将样品与所需的一抗（抗β-微管蛋白抗体、抗周边蛋白抗体、抗硫酸乙酰肝素（HS）抗体和/或抗糖蛋白D（gD）抗体；稀释比例见材料表）在含0.3% Triton-X（PBST）和10%正常山羊血清的PBS缓冲液中孵育。4 °C下过夜保存样品。</li>
	<li>用PBS洗涤样品，每次10分钟，共洗涤3次。在室温下用适当的二抗（488和/或Cy3；稀释比例见材料表）在PBS中稀释后孵育样品1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤样品，每次10分钟，共洗涤3次。在封片前，将样品在PBS中与Hoechst染料（1.5 µM）孵育20分钟。</li>
	<li>使用荧光封片剂将样品封固于载玻片上，并加盖盖玻片。</li>
</ol>

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作者无任何披露事项。

这 离体 DRG 模型对于研究多种事件极为有用，例如神经元-胶质细胞相互作用，以及微环境对神经元和胶质细胞代谢的影响37此外，通过建立体外模型，DRG模型可作为一种经济高效的工具，用于研究发病机制及相关标志物的关键科学问题。 体内 可用于感染的急性期、慢性期和潜伏期，或特定疾病的研究。此外，利用背根神经节外植体构建的小分子筛选文库可借助该外植体模型进行药物开发。 体外 模型，尤其是单细胞系统，往往过于简化，难以与生理学上相关事件建立关联；而 体内 模型难以进行精确操控，部分原因在于损伤后的免疫反应、胶质瘢痕形成、周围细胞外基质（ECM）的复杂性以及高昂的经济成本。相比之下，背根神经节（DRG）外植体是一种能够保留组织原有结构的器官型培养系统，可允许 离体 包含神经元网络及其在神经元和胶质细胞功能中起重要作用的细胞外微环境在内的完整器官移植。然而，一种 离体 模型只能模拟但无法完全再现所发现的全部条件 体内使用该模型时需注意两个重要局限性：一是时间因素，二是缺乏系统性...

在本文中，我们报告了一种获取源自小鼠背根神经节（DRG）的器官型ex vivo模型系统的方法，该模型可保留类似组织的微环境，用于研究周围神经系统（PNS）损伤后多种生物学反应，包括神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、炎症标志物以及病毒感染等。此外，我们进一步开发了一种建立原代共培养体系的方案，即由DRG来源的单个感觉神经元与卫星细胞共同培养。
背根神经节（DRG）是位于中枢神经系统（CNS）之外、沿脊神经背侧根分布的卫星状灰质结构。DRG 位于椎间孔附近，内含假单极感觉神经元和卫星胶质细胞。这些假单极神经元具有一条单一的神经突，该神经突分为外周突和中枢突：外周突将来自外周靶组织的躯体和内脏感觉信号传递至胞体，而中枢突则将感觉信息从胞体传入中枢神经系统。一层结缔组织被膜将这群位于外周的神经元和胶质细胞与中枢神经系统分隔开来。迄今为止，尚未发现有任何出生后细胞迁移进入或离开 DRG 的现象，其局部的干细胞微环境负责维持终生持续发生的神经发生事件1。因此，该模型特别适用于研究成年神经发生、轴突发育、创伤性损伤后的反应以及细胞死亡过程2,3,4,5,6,7,8,9。
在神经再生领域，从背根神经节（DRG）中获取的组织 体内 并取出 体外 复制轴索断伤，即轴突完全断裂且神经元胞体与所支配靶组织失去连接的损伤状态10,11众所周知，外周神经损伤可导致背根神经节（DRG）中基因表达的下调与上调，其中许多变化源于再生过程，但也可能部分归因于免疫反应或非神经元细胞的其他应答。通过使用一种 离体 在分离的背根神经节系统中，部分复杂性得以消除，从而可更便捷地研究其机制通路。
除了在向中枢神经系统传递感觉输入方面发挥核心作用外，背根神经节（DRG）的神经元胞体上还广泛表达多种神经递质受体，包括GABA12,13,14,15，同时存在中间神经元之间相互兴奋的证据，这些提示DRG可能是感觉输入信号的复杂初级整合中枢16,17。这些新发现使DRG外植体具备了类似于其他&#34;迷你脑&#34;模型的微型神经网络系统特征，后者是神经系统组织特异性的类器官，已被广泛应用于神经疾病的实验研究和治疗探索18,19。此外，DRG作为一个被结缔组织被膜包裹的独立且界限清晰的神经组织集群，这一结构特点进一步使其成为适用于ex vivo移植的理想器官。
由于小鼠与人类在结构和遗传上的相似性，培养小鼠背根神经节（DRG）成为模拟人类病理生理过程的一种理想的多细胞模型。此外，目前已有大量转基因小鼠品系资源库，非常有利于开展后续的机制性研究。在发育过程中以及损伤后，轴突的延伸均依赖于生长锥与基底之间的力学相互作用20,21。纳米级和微米级图案化基底已被用作引导轴突发育的工具，并证明了其能够响应微环境中拓扑结构特征的能力。研究表明，神经元能够在这些基底表面存活、黏附、迁移，并通过轴突定向来沿基底沟槽等表面特征进行导航22,23。然而，这些研究通常使用的是培养的细胞系，因此很难预测原代神经元细胞在体内（in vivo）或离体（ex vivo）条件下对明确定义的物理信号将如何响应。
本研究方案所采用的小鼠背根神经节（DRG）ex vivo 外植体模型，模拟了轴突生长过程中真实的细胞间相互作用及生化信号环境。在从轴突再生、神经球生成到神经炎症等多种不同的实验范式中，DRG 外植体模型持续作为研究感觉神经节内病毒感染与潜伏特性的重要工具24,25,26,27。
神经系统（NS）通常是病毒感染的靶标28,29,30。大多数病毒首先感染上皮和内皮细胞表面，并通过外周神经的感觉和运动纤维从表层组织进入神经系统。特别是单纯疱疹病毒1型（HSV-1），在初次感染上皮细胞后，倾向于在外周神经系统（PNS）的感觉神经节（尤其是背根神经节DRG）中建立终身潜伏感染31,32。HSV-1感染外周神经系统的嗜神经特性最终可导致神经系统疾病33。

<table><tbody><tr><td>成年小鼠 NIH/Swiss</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Cell Treat</td><td>229635</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 胞外基质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td>明胶状蛋白混合物</td></tr><tr><td>F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0.22 µm 滤器</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>神经元培养添加剂</td></tr><tr><td>PSN 抗生素</td><td>Gibco</td><td>15640-055</td><td>*SFM 培养基组分&lt;br/&gt; 抗生素混合物</td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>神经生长因子（NGF）</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td>神经生长因子</td></tr><tr><td>层粘连蛋白包被盖玻片</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td></td></tr><tr><td>ONPG 底物</td><td>Pierce</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520034</td><td></td></tr><tr><td>抗 β-微管蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8328</td><td>1:2000 稀释</td></tr><tr><td>抗周围蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>AB1530</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>Hoechst 染料</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>终浓度 1.5 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>抗硫酸乙酰肝素抗体</td><td>US Biological</td><td>H1890-10</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>抗 gD 抗体</td><td>Virostat</td><td>196</td><td>1:10 稀释</td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇（BME）</td><td>Gibco</td><td>21010-046</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>KIT（胰岛素-转铁蛋白-硒-A）</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>维生素 C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>*SFM 培养基组分</td></tr><tr><td>488（山羊抗小鼠）</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cy3（山羊抗兔）</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清&amp;nbsp;</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td>荧光封片剂</td></tr><tr><td>钻石白玻璃盖玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-20</td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠背根神经节外植体与分离细胞模型用于研究神经可塑性及对包括病毒感染在内的环境损伤的反应

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

本方案描述了一种 离体 小鼠背根神经节（DRG）外植体模型 体外 背根神经节来源的感觉神经元与卫星胶质细胞共培养模型。该模型是研究外周神经系统（PNS）在生理与病理条件下多种生物学反应的有用且多功能的工具，涵盖神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、神经炎症以及病毒感染等研究领域。相较于简化的单细胞模型，背根神经节（DRG）组织块培养在科学上具有多重优势。例如，作为一种保留组织结构特征的培养系统，DRG组织块培养能够 离体 包括对所有神经元和胶质细胞功能起重要作用的细胞外微环境在内的完整神经网络的转移。此外，背根神经节（DRG）外植体也可被维持 离体 数天，且可根据需要调整培养条件。此外，收获的DRG可进一步解离为单个细胞 体外 背根神经节外植体系统可实现初级感觉神经元与卫星胶质细胞的共培养，用于研究神经元-胶质细胞相互作用、神经突发生、轴突生长锥与细胞外微环境的相互作用，以及更广泛的与神经元代谢相关的各类过程。因此，该系统具有高度灵活性，能够以较低成本研究多种与生物学、生理学及病理学状态相关的事件。

利用背根神经节（DRG）及其单细胞分离培养模型，可研究神经可塑性及神经元与环境相互作用的多个方面。我们首先按照图1所示的示意图，分离出DRG组织块及来源于DRG的单细胞。无论是组织模型还是单细胞模型，均可根据实验设计和研究目的，采用多种分子生物学技术进行分析，如免疫荧光、蛋白质印迹（Western blot）、基因组检测及其他分析技术。首先，我们使用DRG组织块模型研究了生化信号对轴突生长的影响（图2）。在双标或三标免疫荧光染色中，确认了波形蛋白（peripherin）（图2A、B；红色）和β-微管蛋白（β-tubulin）（图2A、B；绿色）在神经元胞体及周围神经突起中的差异性表达。细胞核通过Hoechst染色标记（图2A；蓝色）。在使用4%多聚甲醛固定并进行切片处理后，我们进一步在完整的DRG组织块中分析了上述标志物的表达情况（<stro...

本报告重点介绍了利用小鼠背根神经节的器官型培养和分离的原代培养体系，以研究与神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、神经炎症以及对病毒感染反应相关的多种机制。

本方案描述了一种小鼠背根神经节（DRG）外植体的离体模型，以及分离的感觉神经元与DRG来源细胞的体外共培养方法……

本实验的总体目标是建立背根神经节外植体和/或源自背根神经节的原代分离细胞的离体模型，以研究神经元对环境信号的反应。该方法有助于解答神经可塑性领域中的关键问题，或在病原体暴露后神经炎症相关的问题。该技术的主要优势在于，背根神经节外植体能够维持类似器官的复杂结构，有利于启动细胞周期，并反映特定处理引起的细胞间微环境变化。仔细演示该方法至关重要，因为背根神经节（DRGs）的识别及其收获因其体积小和位置特殊而具有较大难度。开始此操作时，使用精细剪刀从动物背部切开皮肤层，暴露脊柱。接着，通过在脊柱两侧剪断肋骨以及骶骨，分离脊柱与动物其他部分，从而游离出脊柱。随后，使用针和销将脊柱腹侧朝上固定于手术垫上。然后在椎体两侧各做一次切割，以暴露椎管的腹侧。在手术显微镜下，轻柔地将脊髓向一侧移开，以暴露对侧的背侧脊神经根，并沿周围神经的背根定位背根神经节（DRG）。每个神经节部分隐藏在椎间孔内。采集背根神经节（DRG）时，用一把镊子夹住背根，轻轻将DRG从椎间孔中拉出。然后用第二把镊子夹住DRG远端的脊神经，并将DRG连同脊神经和脊根一同拉出。随后，将收集的背根神经节（DRG）置于含有3毫升冰冷无血清培养基的35毫米培养皿中。将每个DRG转移至干燥的玻璃培养皿中。在手术显微镜下，使用刀片清除并修剪仍附着在DRG上的多余纤维和结缔组织。背根神经节（DRG）易于识别，表现为沿白色脊神经分布的一个膨大的透明结构，且常可见血管围绕在DRG周围。随后将清洗后的DRG置于一个新的培养皿中，内含冰冷的无血清培养基。将胶状蛋白质混合物用冰冷的无血清培养基按1:1比例稀释。然后将背根神经节离体接种于预先包被了10或20微升明胶蛋白混合物的12孔板中，并在37摄氏度条件下孵育30至60分钟。随后，轻柔地向培养体系中加入1.5至2毫升无血清培养基，以完全覆盖组织块，并在培养条件下维持组织块的生长。每72小时更换一次背根神经节（DRG）培养基，并根据需要让DRG生长足够长时间。这一步骤至关重要，因为DRG是通过胶状蛋白质混合物固定在玻璃板上的。因此，操作时间的把握和移液技术对于防止DRG脱落漂浮尤为关键。在此步骤中，将所有收集的背根神经节（DRG）放入含有胶原酶4的F12培养基的1.5毫升无菌离心管中，并在37摄氏度下孵育45分钟。随后，更换为含有胶原酶4的新鲜培养基，再将样本孵育45分钟。紧接着，在胶原酶4处理后立即用2毫升含0.025%胰蛋白酶的F12培养基在37摄氏度下处理组织块30分钟。在含有胎牛血清的 2 毫升 F12 培养基中，37 摄氏度孵育 15 分钟。随后，用 2 毫升 F12 培养基将组织块洗涤三次，并用玻璃移液管进行机械解离，直至培养基变浑浊。接着，将解离后的细胞培养物通过 0.22 微米滤膜过滤，以去除杂质和多余的结缔组织。然后将过滤后的细胞裂解液离心两分钟。弃去上清液，并将细

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成年小鼠背根节外植体和分离细胞模型调查可塑性和对包括病毒感染在内的环境侮辱的反应

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轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

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建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

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