用于内皮靶向和药物传递的功能化10纳米高分子涂层金粒子的合成
January 15th, 2018
我们描述了一种合成具有生物相容性的10纳米金纳米粒子的方法, 其功能是在表面上涂上聚乙二醇。这些微粒可以使用在体外和在体内提供治疗的纳米细胞和细胞外空间, 难以获得常规纳米颗粒的大小。
该程序的总体目标是合成直径为 10 纳米、生物相容性、延长循环时间并且可以用荧光显微镜成像的功能化聚合物涂层金纳米球。这种方法可以帮助回答心脏病学中有关疾病条件下内皮通透性的关键问题。该技术的主要优点是它可以产生具有生物相容性的超小颗粒，这些颗粒具有可用于进一步定制的官能团。
首先，在微量离心管中，用 1 毫升超纯水稀释 12 微升 80% THPC。将 100 毫升圆底烧瓶夹在磁力搅拌板上。向烧瓶中加入 45 毫升水和一个小蛋形搅拌棒。
开始以 300RPM 的速度搅拌水。向培养瓶中加入 0.5 毫升 1 摩尔氢氧化钠溶液和 1 毫升稀释的 THPC 溶液。继续剧烈搅拌反应混合物 5 分钟。
然后，在搅拌的同时向反应混合物中加入 2 毫升 25 毫摩尔氯金酸溶液。确认黄色反应混合物在几秒钟内变为深棕色，表明形成了 THPC 封端、带负电荷的金纳米颗粒。继续搅拌混合物 15 分钟。
在混合物搅拌的同时，制备异双功能胺 PEG 硫醇、羧甲基 PEG 硫醇和单功能甲氧基 PEG 硫醇的水溶液。金纳米颗粒反应混合物搅拌 15 分钟后，将搅拌速度降低至 100 RPM。搅拌的同时将 PEG 溶液逐滴加入混合物中。
继续在室温下轻轻搅拌混合物过夜。然后，用透析夹关闭 12-14 道尔顿 MWCO 纤维素膜的一端。使用移液器将反应混合物转移到膜上。
用第二个透析夹关闭膜的另一端。将纳米颗粒混合物与 4 升水一起以 60RPM 搅拌 72 小时。前 6 小时每 2 小时换一次水，之后每 6 到 12 小时换一次水。
然后，通过 0.2 微米注射器过滤器将半纯化的聚乙二醇化金纳米颗粒混合物过滤到 50 毫升锥形管中。将纯化的纳米颗粒溶液在零下 80 摄氏度下冷冻约 5 小时。使用冷冻干燥机冻干纯化的纳米颗粒。
要开始制备荧光聚乙二醇化金纳米颗粒，请将 100 毫升圆底烧瓶夹在磁力搅拌板上。向培养瓶中加入 18 毫升超纯水和一个小蛋形搅拌棒，然后以 100RPM 开始搅拌。在 4 毫升锥形管中，将 2 毫克冻干聚乙二醇化金纳米颗粒与 2 毫升水混合。
然后，将纳米颗粒溶液转移到圆底烧瓶中以进一步重构。在搅拌的同时，向重构的纳米颗粒中加入 1 毫升 pH 值为 8.8、0.1 摩尔的碳酸盐缓冲液。然后，加入 5 微升每毫升 10 毫克的荧光羟基琥珀酰亚胺酯二甲基亚砜溶液。
用箔纸包裹烧瓶以完全排除光线。在室温下继续搅拌荧光纳米颗粒混合物过夜。然后，使用制备聚乙二醇化金纳米颗粒中描述的程序，将混合物与 4 升水透析 72 小时。
在整个透析过程中，请用铝箔纸覆盖容器。留出一毫升纯化的荧光聚乙二醇化纳米颗粒进行表征。将剩余的荧光纳米颗粒冷冻、冻干并储存在 4 摄氏度下。
为了用透射电子显微镜观察金纳米颗粒核心，首先将 10 微升纯化的荧光纳米颗粒溶液放在碳涂层网状 TEM 网格上。让滴剂静置 5 分钟。然后，使用滤纸小心地从 TEM 网格边缘吸走多余的液体，直到网格上只剩下一层荧光纳米颗粒。
在80 kV 下对纳米颗粒进行成像，放大倍率为 50， 000 至 150， 000。为了测量流体动力学纳米颗粒的大小，将 1 毫克冻干的 THPC 包被的金纳米颗粒放入微量离心管中。向每个试管中加入 1 毫升水，然后将溶液转移到 1 毫升透明塑料比色皿中。
用动态光散射评估每种溶液，并测量颗粒的球形流体动力学直径。然后，将含有荧光聚乙二醇化金纳米颗粒的比色皿转移到荧光分光光度计中。将释放波长设置为 633 纳米，并读取 650 至 800 纳米的发射信号。
接下来，为了评估 7 种纳米颗粒浓度的生物相容性，首先将 DMEM 中的 100 微升大鼠脂肪垫内皮细胞悬液移液移液到 96 孔透明底部无菌组织培养处理板的 21 个孔中的每一个孔中。孵育细胞直至达到汇合，然后在 DMEM 中获得七种荧光纳米颗粒溶液，浓度范围为 0 至 1000 μg/mL。从孔中吸出 DMEM。
将 100 微升的 7 种纳米颗粒溶液分别放入每个单独的孔中，一式三份。让细胞和纳米颗粒共孵育 16 小时。然后，从孔中吸出 DMEM 和悬浮或松散连接的纳米颗粒。
向每个孔中加入 100 微升含有 20 微升 MTS/PES 溶液的新鲜 DMEM。将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 小时。然后，使用读板器在 492 纳米处通过氯度分析评估细胞活力。
接下来，以每平方厘米 10， 000 个细胞的速度将大鼠脂肪垫内皮细胞接种到无菌的 12 毫升玻璃盖玻片上。用补充有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 DMEM 喂养细胞。孵育细胞直至完全汇合。
如果需要，修改内皮糖萼，然后用每毫升 550 μg 荧光金纳米颗粒孵育细胞 16 小时。准备用于免疫荧光显微镜检查的细胞。将每个盖玻片安装在带有含有 DAPI 的抗褪色封固剂的显微镜载玻片上。
用指甲油密封盖玻片边缘。使用共聚焦显微镜对免疫染色的内皮细胞进行成像。分别用蓝色、绿色和远红通道可视化细胞核、硫酸肝素糖萼和纳米颗粒。
THPC 涂层金纳米颗粒的 TEM 显示颗粒直径为 2 至 3 纳米。聚乙二醇化纳米颗粒的 TEM 只能确认分散颗粒的存在，因为 PEG 在 TEM 图像中不可见。THPC 涂层和聚乙二醇化纳米颗粒的 DLS 显示峰颗粒直径从 2.5 纳米变为 10.5 纳米。
当用 633 纳米光激发时，荧光发射的最大值在 660 到 672 纳米之间，这与所用荧光探针在 665 纳米处的预期最大发射一致。大鼠脂肪垫内皮细胞在与浓度高达 1 毫克/毫升的荧光聚乙二醇金纳米颗粒共孵育 16 小时后显示出相似的活力水平，表明纳米颗粒没有显着毒性。观察到具有健康糖萼的大鼠脂肪垫内皮细胞中纳米颗粒的摄取最小。
在糖萼降解的细胞中，摄取率显著增加，如纳米颗粒的红色荧光信号增加所示。在此程序之后，可以进行进一步的修饰，例如与开放官能团偶联，以修饰颗粒以特异性靶向内皮成分或递送药物。
概述
本文描述了一种用于合成生物相容性10纳米金纳米粒子的方法，这些纳米粒子被包覆有聚乙二醇。这些纳米粒子专为在具有挑战性的细胞环境中的治疗递送而设计。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米技术
- 生物相容材料
- 治疗递送系统
背景
- 金纳米粒子具有对生物医学应用有益的独特性质。
- 传统纳米粒子可能无法有效地靶向某些细胞空间。
- 功能化可以增强纳米粒子的性能。
- 这种方法旨在改善体内难以到达区域的可及性。
研究目的
- 合成超小金纳米粒子以增强生物相容性。
- 实现心脏病学中的成像和治疗应用。
- 提供一个可定制的平台以便进一步纳米粒子修饰。
使用的方法
- THPC的稀释和反应混合物的制备。
- 搅拌并添加氯金酸以形成金纳米粒子。
- 使用各种PEG硫醇进行功能化以增强性能。
- 使用透射电子显微镜和动态光散射进行表征。
主要结果
- 成功合成了具有所需性质的10纳米金纳米粒子。
- 通过细胞活力测定证明了生物相容性。
- 表征确认了纳米粒子的大小和功能性。
- 突出了在成像和治疗递送方面的潜在应用。
结论
- 合成的金纳米粒子适用于生物医学应用。
- 功能化增强了它们在靶向治疗中的可用性。
- 这种方法为未来纳米粒子应用研究提供了基础。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables the synthesis of biocompatible, fluorescently labeled 10-nm gold nanoparticles with customizable surface functional groups for endothelial targeting and drug delivery applications. The approach supports mechanistic de-risking in cardiovascular research by probing glycocalyx integrity and nanoparticle uptake under diseased versus healthy endothelial conditions. The platform provides a scalable, reproducible foundation for lead identification and preclinical validation of nanotherapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial permeability and glycocalyx function as therapeutic targets in cardiovascular disease models.
- Operational Value: Provides a tunable nanoparticle scaffold for functional group screening to optimize target binding and reduce off-target effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, fluorescently detectable nanoparticles for quantitative uptake assays in endothelial cell models.
- Operational Value: Supports high-confidence screening through reproducible size control (10.5 nm hydrodynamic diameter) and surface chemistry control via PEG thiol exchange.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translation from in vitro endothelial uptake to in vivo biodistribution studies via biocompatible PEG coating and fluorescence tracking.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement by correlating glycocalyx degradation with enhanced nanoparticle uptake as a biomarker of endothelial dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation through endothelial interaction assays and enabling lead optimization via surface functionalization for improved delivery precision.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on endothelial barrier function and target accessibility in disease-relevant models.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with consistent size and fluorescence for reliable compound or ligand screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative hydrodynamic size (DLS), fluorescence emission profiles, and cellular uptake metrics for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects endothelial glycocalyx probing to preclinical continuity through visualization of nanoparticle localization in vasculature.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular nanoparticle platform adaptable across multiple targets and therapeutic indications via surface chemistry modification.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by enabling direct visualization of nanoparticle-endothelium interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dialysis, lyophilization, and fluorescence conjugation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking nanoparticle uptake to glycocalyx integrity as a disease-relevant readout.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of nanotherapeutic candidates based on endothelial penetration and biocompatibility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, PEGylation, and fluorescence labeling techniques.
- Dependent on access to dialysis equipment, lyophilizer, TEM, DLS, spectrofluorometer, and confocal microscopy.
- Necessitates cross-team standardization for consistent nanoparticle batch production and quality control.
- Adaptation considerations include varying PEG thiol types and fluorophore selection for different detection channels.
- Practical limitations include the need for light protection during fluorescence conjugation and potential aggregation if dialysis is incomplete.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Synthesis of Polyethylene Glycol-coated Gold Nanoparticles (PEG-AuNPs)
3:13
Conjugation of Fluorophores onto the PEG-AuNP NH2 Groups
4:56
Characterization of Fluorescent PEG-AuNPs
8:46
Results: Size and Biocompatibility of THPC-coated and Fluorescent PEG-AuNPs
10:19
Conclusion
