Name: 用于内皮靶向和药物传递的功能化10纳米高分子涂层金粒子的合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习合成10纳米聚乙二醇涂层金纳米粒子的方法，用于心血管内皮靶向和药物递送。该技术可制备具有功能化基团的生物相容性超小颗粒，适用于荧光成像和生物医学应用研究。

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本工作得到了东北大学化学工程系启动资金、东北大学教务长办公室一级试点研究资助、美国国立卫生研究院项目（K01 HL125499）以及美国国家科学基金会IGERT项目（NSF/DGE-096843）的支持。作者还感谢Thomas J. Webster及其实验室提供的帮助，以及东北大学纳米医学科学与技术中心和药学科学系的支持。

1. 储备溶液的制备或采购（室温或冷冻保存备用）
<ol>
	<li>在室温下，将 400 mg 氢氧化钠（NaOH）溶解于 10 mL 超纯水中，并充分混合，配制 1 M 氢氧化钠（NaOH）储备液。 
	注：超纯水是指不含颗粒物、细菌、核酸酶、离子或有机物残留等杂质的水。通常使用纯化系统制备超纯水，其电阻率可达 18.2 mΩ·cm，表明阴离子污染极低。不建议使用市售瓶装超纯水。除非另有说明，下文中所述“水”均指超纯水。</li>
	<li>将 2.4 g NaOH 溶解于 10 mL 水中，配制 6 M NaOH 储备液，并于室温保存。</li>
	<li>将 1 g 干燥的氯金酸（HAuCl4）溶解于 10.16 mL 水中，配制 250 mM 氯金酸（HAuCl4）储备液。取 1 mL 250 mM HAuCl4 溶液加入 9 mL 水稀释，得到 25 mM HAuCl4 工作浓度溶液。HAuCl4 溶液于室温保存。</li>
	<li>将 84 mg 碳酸氢钠溶解于 10 mL 水中，然后逐滴加入步骤 1.2 中的 6 M NaOH 溶液调节 pH 至 8.8，配制 pH 8.8 的 0.1 M 碳酸盐缓冲液。碳酸盐缓冲液于室温保存。</li>
	<li>取 20 mL 四氮唑化合物 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑盐（MTS）与稳定剂吩嗪硫酸甲酯（PES）混合（见材料表）。将 MTS/PES 混合液分装后避光保存于 -20 °C，最多可经历 10 次冻融循环。</li>
</ol>
2. 金纳米颗粒核的合成
<ol>
	<li>在室温下，将12 µL 80%的THPC水溶液加入1 mL水中，于微量离心管中配制稀释的THPC溶液。</li>
	<li>将一个100 mL的圆底烧瓶固定在磁力搅拌器的中心位置。向烧瓶中加入45 mL水，并使用小型卵形磁力搅拌子以300 rpm的速度搅拌水。随后加入0.5 mL 1 M NaOH溶液和1 mL稀释的THPC溶液。继续剧烈搅拌反应混合物5分钟。</li>
	<li>保持搅拌，加入2 mL 25 mM的HAuCl4溶液。混合物的颜色将在数秒内由黄色变为深棕色，表明已形成带负电荷的THPC包被金纳米颗粒（AuNPs）。继续搅拌混合物15分钟，以确保金核完全形成。</li>
</ol>
3. 在金纳米颗粒周围添加聚合物冠层
<ol>
	<li>在步骤 2.3 所述的 15 分钟期间内，将以下各组分分别溶于 4 mL 玻璃小瓶中的 1 mL 水中，配制 PEG 溶液：30 mg NH2-PEG-SH；7.5 mg m-PEG-SH；7.5 mg COOH-PEG-SH。 
	注意：所得浓度应为 8.8 M NH2-PEG-SH、3.75 M m-PEG-SH 和 3.75 M COOH-PEG-SH。</li>
	<li>将圆底烧瓶中溶液的搅拌速度降至 100 rpm 后，将 PEG 溶液逐滴加入 THPC 封端的 AuNP 溶液中。在室温下继续轻轻搅拌过夜，以确保 THPC 被有效去除并被 PEG 取代。</li>
	<li>在接下来的 72 小时内，使用截留分子量为 12–14 kDa 的纤维素透析膜，将搅拌中的混合物对置于 60 rpm 搅拌条件下的 4 L 水桶进行透析。用透析夹夹紧膜的两端，并通过移液器转移溶液。 
	注意：该使用 12–14 kDa 截留分子量膜的透析过程仅通过浓度梯度扩散去除未反应的 PEG、THPC 及其他化学反应物。</li>
	<li>为维持高浓度梯度并促进持续扩散，在前 6 小时内每 2 小时换水一次，之后 66 小时内每 6–12 小时换水一次。 
	注意：此换水方案旨在应对初始阶段因样品内浓度较高而发生的快速扩散。上述透析过程使纳米颗粒溶液得到初步纯化，因为纳米颗粒、沉淀物、聚集体及其他大尺寸杂质无法穿过 12–14 kDa 截留分子量膜的孔隙。</li>
	<li>使用 0.2 µm 注射式滤器将初步纯化的纳米颗粒溶液过滤至 50 mL 锥形管中，以去除残留的沉淀物、聚集体及其他大尺寸杂质。</li>
	<li>将锥形管置于 -80 °C 超低温冰箱中，使纯化的 PEG 修饰金纳米颗粒（PEG-AuNP）溶液冷冻约 5 小时。</li>
	<li>使用冷冻干燥机对纯化的 PEG-AuNP 进行冻干。</li>
	<li>将干燥的纯化 PEG-AuNP 储存于 4 °C 环境中，直至使用。</li>
</ol>
4. 使用 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯将荧光染料偶联到 PEG-AuNP 的 NH2 基团上
<ol>
	<li>将一个50 mL的圆底烧瓶固定在磁力搅拌器的中心位置。向烧瓶中加入18 mL水，并使用橄榄形磁力搅拌子以100 rpm的速度搅拌水。</li>
	<li>使用高精度台式天平，在一个4 mL锥形管中称取2 mg冻干的PEG-AuNP。使用防静电枪消除静电荷，防止PEG-AuNP粉末粘附在管壁上。向管中加入2 mL水。将2 mL PEG-AuNP溶液倒入圆底烧瓶中，使其在总共20 mL水中进一步复溶。继续使用橄榄形磁力搅拌子以100 rpm的速度搅拌混合物。</li>
	<li>向圆底烧瓶中含有的20 mL复溶AuNP中加入1 mL 0.1 M、pH 8.8的碳酸盐缓冲液。继续搅拌。</li>
	<li>加入5 µL浓度为10 mg/mL的荧光NHS酯（溶于二甲基亚砜中）。 
	注意：此过程可使用任何荧光染料。将荧光标记的PEG-AuNP在室温下避光搅拌过夜。</li>
	<li>在接下来的72小时内，采用步骤3.3中所述方案去除多余的荧光分子。简要而言，使用4 L去离子水和截留分子量为12–14 kDa的纤维素透析膜对搅拌中的混合物进行透析。前6小时内每2小时换水一次，之后66小时内每6–12小时换水一次。</li>
	<li>取1 mL纯化的荧光PEG-AuNP溶液，用于下文第5节所述的表征分析。其余溶液按照步骤3.5–3.7所述进行冷冻干燥，获得粉末状荧光纳米颗粒，并于4 °C保存。</li>
	<li>在用于细胞培养应用前，使用0.2 µm注射器滤器对复溶后的溶液进行除菌，并去除可能存在的沉淀物。</li>
</ol>
5. 荧光标记的聚乙二醇化金纳米颗粒的表征
<ol>
	<li>使用透射电子显微镜（TEM）观察金纳米颗粒核心并量化其尺寸
	<ol>
		<li>将10 µL纯化的荧光PEG-AuNP溶液滴加到碳支持膜铜网上。</li>
		<li>5分钟后，用滤纸小心地从铜网边缘吸去多余液体，直至留下含有荧光PEG-AuNP的薄膜。</li>
		<li>在80 kV电压下，以50,000–150,000倍放大倍数观察荧光PEG-AuNP，并拍摄数字图像。 
		注意：由于PEG在TEM下不具电子密度，因此仅能观察到金核心。</li>
		<li>使用测量软件，根据标尺设置测量比例。测量约20个金核心的直径，并计算平均金核心直径。 
		注意：TEM成像系统会自动在数字图像上添加标尺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用动态光散射（DLS）测量纳米颗粒的流体动力学尺寸
	<ol>
		<li>采用步骤4.2所述方法，将1 mg冻干的THPC包覆AuNP转移至微量离心管中。另取一管，转移1 mg冻干的PEG-AuNP。向每管中加入1 mL水，并将每种AuNP溶液转移至1 mL透明塑料比色皿中。</li>
		<li>将比色皿放入DLS仪器中，使用DLS系统内置的颗粒分析软件测量球形流体动力学直径。</li>
		<li>以直方图形式绘制测得的流体动力学直径。 
		注意：直方图将按尺寸对纳米颗粒进行分组。数量最多的颗粒群将明确反映本实验方案所合成AuNP的典型直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光分光光度法确认荧光信号 
	注意：可使用步骤5.2中的同一样品和比色皿测量荧光信号。
	<ol>
		<li>将比色皿从DLS仪器中取出，插入荧光分光光度计中。设定激发波长为633 nm，检测650–800 nm波长范围内的发射荧光信号。</li>
		<li>确认荧光峰位于约665 nm处，该波长与NHS的发射峰一致。 
		注意：应根据所用荧光染料调整激发和发射波长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTS法11评估生物相容性
	<ol>
		<li>在96孔透明底无菌组织培养板中，每孔加入100 µL含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）及3.2 × 103个细胞。 
		注意：本研究使用大鼠脂肪垫内皮细胞。共使用21个孔，以便为7种不同纳米颗粒浓度各设3个重复（具体浓度见步骤5.4.3）。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、湿度和5% CO2控制的培养箱中培养至完全融合11。</li>
		<li>准备若干独立的微量离心管，每管含300 µL DMEM及不同浓度的纳米颗粒。本研究需7种不同浓度的DMEM，其中PEG-AuNP浓度分别为：0 µg/mL、10 µg/mL、50 µg/mL、100 µg/mL、250 µg/mL、500 µg/mL和1,000 µg/mL。</li>
		<li>吸除原DMEM，向各孔中三重复加入100 µL含0、10、50、100、250、500或1,000 µg/mL AuNP的DMEM培养基。</li>
		<li>使细胞与纳米颗粒共孵育预定时间，本实验为16小时。</li>
		<li>在孵育接近结束时，解冻步骤1.5中制备的MTS/PES混合液。</li>
		<li>孵育结束后，吸除各孔中的DMEM及悬浮的、松散附着的纳米颗粒。加入100 µL新鲜DMEM和20 µL MTS/PES溶液，使MTS/PES与DMEM的比例为1:5，按照制造商说明书操作。将细胞在37 °C下与MTS/PES共孵育2小时。 
		注意：该2小时孵育时间基于内皮细胞的代谢活性确定，其他细胞类型可延长至最多4小时。在2小时内，内皮细胞将MTS代谢为有色甲臜产物并溶于DMEM中。PEG-AuNP的生物相容性及细胞存活可能性通过更深的颜色体现；而PEG-AuNP的毒性及细胞死亡风险则表现为颜色变浅。</li>
		<li>使用合适的酶标仪在492 nm波长下读取各孔吸光度，进行比色分析。</li>
		<li>对每种纳米颗粒浓度，计算三个重复吸光度值的平均值，并将该平均值除以不含纳米颗粒（0 µg/mL）孔的平均吸光度值。 
		注意：这些不含AuNP的孔作为对照，用于计算其他孔经纳米颗粒处理后的相对细胞存活率百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光共聚焦显微镜评估完整或功能障碍糖萼内皮细胞对纳米颗粒的摄取11
	<ol>
		<li>将1.0 × 104个细胞/cm2的大鼠脂肪垫内皮细胞接种于无菌12 mm玻璃盖玻片上，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养细胞。在37 °C、湿度和CO2控制的培养箱中培养约3天，直至细胞完全融合。</li>
		<li>如需干预，可添加处理因素以改变糖萼结构。例如，用2.5 × 10-6 IU肝素酶III处理培养的内皮细胞2小时，可特异性切割糖萼中的硫酸乙酰肝素成分，从而降解糖萼。 
		注意：健康的糖萼模型可通过如步骤5.5.1所述方式培养内皮细胞而不添加降解酶来实现。</li>
		<li>在保持内皮糖萼完整或使其功能受损的情况下，将内皮细胞与550 µg/mL的荧光AuNP共孵育16小时或其他所需时间。</li>
		<li>用2 mL 37 °C含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS；含100 mg/L钙和100 mg/L镁）轻柔洗涤细胞。将细胞浸入2 mL含2%多聚甲醛和0.1%戊二醛的PBS中，在室温下固定30分钟。</li>
		<li>去除醛类固定液，用室温PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。</li>
		<li>在加入一抗前，将内皮细胞在室温下用含2%山羊血清的PBS封闭30分钟，以阻断非特异性结合位点。细胞必须完全被封闭液覆盖。</li>
		<li>将内皮细胞在4 °C下与含1%抗硫酸乙酰肝素一抗的2%山羊血清PBS溶液共同孵育过夜，以标记糖萼中的硫酸乙酰肝素成分。确保固定后的细胞完全浸没于抗体溶液中。</li>
		<li>次日，用室温PBS洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。</li>
		<li>在避光或铝箔包裹条件下，室温下用1:1,000稀释的相应荧光标记二抗孵育内皮细胞30分钟。</li>
		<li>用室温PBS洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的二抗。</li>
		<li>使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上，用于细胞核染色。用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜对荧光免疫染色的内皮细胞样本进行成像，分别通过蓝色、绿色和远红通道观察细胞核、硫酸乙酰肝素糖萼和纳米颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该技术是一种合成可定制超小尺寸聚乙二醇（PEG）包被金纳米颗粒（AuNPs）的有效方法。该实验步骤中的关键环节是首先形成四羟丙基鏻（THPC）封端的金纳米颗粒，这一过程可通过加入氯金酸（HAuCl4）后溶液颜色由黄色变为棕色来确认（实验步骤2.3）。若未发生颜色变化，则表明未形成纳米颗粒，需检查并重复初始步骤后再继续后续操作。若颜色变为棕色以外的其他颜色（如酒红色或灰色），则所得颗粒的尺寸很可能偏离目标值（约2.5 nm），此时也应重新制备新的样品批次。
形成金核后，THPC 与 PEG 的置换反应及纯化过程包含若干关键步骤，对成功完成本实验方案至关重要。充分混合过夜可确保置换反应完全进行。若透析用水未按规定的频率更换，则可能导致纯化失败。若将颗粒在透析液中放置超过 72 小时，也可能发生颗粒聚集和沉淀。在冷冻干燥过程中也可能出现其他潜在问题。如果超小尺寸 PEG 包被的 AuNP 溶液未完全冻结，或冻干机设置不当，样品可能丢失。请参考冻干机使用手册，因为不同设备可能需要不同的样品制备步骤。
合成简便以及所得颗粒具有良好的生物相容性，是使用这些PEG-AuNPs的优势。此外，这些纳米颗粒能够与纳米尺度的细胞结构相互作用，例如通过摄取这些纳米颗粒来识别降解的糖萼，这一特性进一步凸显了其优势。该优势可被用于开发新的动脉粥样硬化治疗策略和预防措施。除了本文所展示的内容之外，本实验方案的另一优势在于，可通过将含硫醇的PEG连接到金纳米颗粒上，实现颗粒的高度定制化，并提高其稳定性和储存能力4。PEG链的另一端可携带任何功能基团，多种分子均可与这些基团偶联。在本方案中，三种常见的功能基团（甲基、羧基和氨基）均被连接。PEG的比例选择优先考虑荧光检测需求，其次为利用羧酸基团引入第二靶向基团的能力。这些基团的比例可根据具体应用进行调整，聚合物的长度和形状也可相应调节。
为了测量颗粒摄取，我们将一种荧光探针偶联到其中一个功能基团上。需要注意的是，任何超出我们所描述范围的偶联都会改变纳米颗粒的表面性质。每次向纳米颗粒添加新组分或进行偶联反应后，都应测试其是否具备所需的特性。
该方法制备的超小金纳米颗粒旨在克服内皮细胞外层糖萼的防御特性，这种特性会阻碍常规尺寸纳米颗粒的摄取。然而，颗粒尺寸过小会导致成像和药物负载方面存在困难。这些颗粒显著小于典型的纳米颗粒尺寸范围，因此可用于连接治疗剂和靶向基团的表面积大大减少。这可能导致在成像应用中难以识别单个颗粒信号，尽管如共聚焦图像所示，颗粒簇仍可被清晰识别。由于可用于连接靶向配体和治疗分子的表面积减小，可能需要施用更多的颗粒才能达到目标剂量要求。然而，考虑到糖萼的影响，较小的颗粒在递送效率上会更高。
这些新型超小颗粒能够递送至体内难以到达的纳米级区域，同时对微环境的干扰极小。添加聚乙二醇（PEG）可提高生物相容性，并为颗粒提供功能基团，从而针对不同应用进行高度定制化改造。尽管其尺寸小于典型的纳米颗粒而存在一些局限性，但若进行战略性开发，超小颗粒在血管靶向和药物递送中有望成为穿透复杂、脆弱且难以进入的糖萼结构的有效策略。

由于能够穿过体内到达特定靶区域，纳米颗粒已被应用于药物递送和成像领域1,2。这些颗粒可通过渗漏的血管在肿瘤部位聚集，或在靶向配体过表达并暴露的部位定位。其中，金因其独特的化学和物理性质可影响治疗药物的运输与释放，已成为一种常用的纳米颗粒材料3。金是一种高效的纳米颗粒材料，因其表面可被修饰以结合巯基，且由于毒性低而具有良好的生物相容性4。金纳米颗粒（AuNPs）能够携带大分子生物药物，并已在递送肽类、核酸和蛋白质方面取得成功，使其成为靶向治疗的理想选择2,4。
遗憾的是，纳米颗粒药物递送的有效性受到带负电荷的糖萼的阻碍，糖萼是大多数哺乳动物细胞膜表面的胞外包被，其孔径可达7 nm5,6。这一孔径小于大多数纳米颗粒药物载体，后者通常直径在50–200 nm之间。在疾病状态下，由于糖萼发生降解，其孔径会增大，从而提高物质向内皮细胞的通透性。然而，大多数纳米颗粒仍然过大，无法有效利用糖萼的这一结构变化。这种尺寸不匹配的一个结果是，传统尺寸的颗粒无法与血管内壁的内皮细胞发生有利的相互作用。这会影响静脉给药颗粒向内皮层的递送，同样也适用于颗粒穿越血脑屏障的转运过程7,8,9,10。
应对这一问题的一种方法是利用更小的颗粒穿过糖萼中的微小孔隙。本文中，我们合成了直径为10.5 nm的超小金纳米颗粒，这种颗粒正常情况下应被完整健康的糖萼所阻挡。一旦糖萼开始受损，颗粒便可随着孔径增大而更容易地穿透细胞。本文所述方案详细介绍了以聚乙二醇（PEG）包覆超小金纳米核的合成方法，该修饰可提高生物相容性并减少系统清除4。PEG还可携带多种功能基团，为靶向配体、荧光标记物及治疗药物的偶联提供了可能。既往研究结果表明，即使未进行主动靶向，这些超小纳米颗粒也更倾向于在内皮糖萼功能受损的区域富集4,11。这表明在递送应用中使用合适尺寸颗粒的可行性与重要性。以下方案介绍了PEG包覆金纳米颗粒（PEG-AuNP）的合成、纯化与表征步骤，并讨论了如何调整功能基团及偶联方式以适用于其他应用。

<table><tbody><tr><td>氢氧化钠 (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>三水合氯化金(III) (HAuCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>四(羟甲基)膦氯化物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861</td><td></td></tr><tr><td>单功能化 mPEG-硫醇</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2,000 Da</td></tr><tr><td>异双功能化胺基-PEG-硫醇</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>NH2-PEG-SH-3400-1g</td><td>Mw: 3,400 Da</td></tr><tr><td>羧甲基-PEG-硫醇</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>CM-PEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2,000 Da</td></tr><tr><td>纤维素透析膜 (12–14 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 抗静电仪</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z108812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647) 羧酸琥珀酰亚胺酯</td><td>Fisher</td><td>A20006</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>Fisherbrand 定性级普通滤纸圆片 - P5 级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-801-B</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JEM-1000</td><td>TEM</td></tr><tr><td>动态光散射</td><td>Brookhaven Instruments Corporation</td><td>Brookhaven 90 Plus 粒径分析仪</td><td>DLS</td></tr><tr><td>荧光计</td><td>Horiba Scientific</td><td>Jobin Yvon Fluromax 4</td><td>荧光计</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒 (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M4</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>10E4 表位 HS 小鼠单克隆 IgM 抗体（一抗）</td><td>Amsbio</td><td>370255</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（二抗）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37120</td><td>二抗</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>含 DAPI</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 700</td><td>共聚焦显微技术</td></tr></tbody></table>

功能化10 nm聚合物包被金颗粒的合成及其在内皮靶向与药物递送中的应用

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

金纳米颗粒（AuNPs）因其尺寸、生物相容性以及可修饰的表面而被广泛应用于医学研究。这些AuNPs可用于特异性靶向和药物递送等应用，但血管内皮细胞外基质的防御特性会阻碍颗粒的摄取。为解决这一问题，本文描述了一种超小金纳米颗粒的合成方法，以提高其在血管内的递送效率，并可通过定制表面功能基团和聚合物长度进行进一步优化。该方案制备出尺寸为2.5 nm的AuNPs，其表面由四（羟甲基）磷鎓氯化物（THPC）封端。通过在AuNP表面将THPC替换为具有异源功能的聚乙二醇（PEG），可使水动力学半径增至10.5 nm，同时在表面引入多种功能基团。该方案最后可选择性地添加荧光染料，使AuNPs可在荧光下可视化，从而追踪纳米颗粒的摄取过程。透析和冷冻干燥被用于纯化和分离AuNPs。由于具有生物相容性的PEG包覆层和荧光探针，这些荧光纳米颗粒可在体外（in vitro）和体内（in vivo）实验中被检测。此外，这些纳米颗粒的尺寸范围使其成为研究糖萼的理想候选工具，可在不干扰正常血管功能的前提下进行探测，从而有望实现更高效的递送和治疗效果。

合成的金纳米颗粒（AuNPs）分别以 THPC 或 PEG 包被（图 1A 和 图 1B），通过透射电子显微镜（TEM）成像，并利用 TEM 和动态光散射（DLS）测量颗粒尺寸，以确保纳米颗粒尺寸分布符合预期。图 2 显示了在 80 kV 电压和 150,000 倍放大倍数下 THPC-AuNP 样品的 TEM 图像。根据 TEM 图像中的标尺校准，THPC-AuNP 颗粒的直径范围为 2–3 nm。该 THPC-AuNP 尺寸在 图 2 所示的 DLS 尺寸测量直方图中也得到证实，其中 THPC 包被的 AuNP 在 2.5 nm 处出现主峰。由于聚合物不具备高电子密度，因此在 TEM 下无法观察到 PEG 化修饰。PEG-AuNP 样品的 TEM 成像仅能确认单个分散颗粒的存在，这符合预期，因为纳米颗粒周围的 PEG 聚合物冠层有助于防止颗粒聚集。对于这些 PEG-AuNP 样品，DLS 尺寸测量直方图显示其峰值发生偏移，约为 10.5 nm。进一步将配体或药物连接至功能基团也会影响纳米颗粒的尺寸，在测量直径时应予以考虑。
荧光染料的添加（图1C使用荧光计测量纳米颗粒样品的荧光信号以确认这一点，如图所示。 图3当使用633 nm波长激发时，测得发射光最大值位于660至672 nm之间，与制造商提供的产品信息中所述最大发射波长为665 nm相符。其他荧光探针的标记效果也应以类似方式检测，以确保其荧光响应。
通过 MTS 法检测颗粒的生物相容性及相关细胞活力，以评估细胞与不同浓度纳米颗粒孵育 16 小时后对 MTS 的相对代谢活性。荧光团偶联的聚乙二醇化金纳米颗粒（PEGylated AuNPs）未表现出显著毒性，如在浓度高达 1 mg/mL 时细胞活力水平均相似所示（图 4A）。这种生物相容性可能因连接至剩余功能基团上的治疗药物或配体的不同而发生变化，从而进一步定制颗粒特性。药物连接通常会增加毒性，但根据实际工作浓度的不同，可能不会对细胞活力产生显著影响。
通过使用具有完整或功能受损糖萼的培养大鼠脂肪垫内皮细胞，评估贴壁细胞对荧光标记的聚乙二醇化金纳米颗粒（PEGylated AuNPs，图 1C）的摄取情况（图 4B）。通过向培养体系中添加肝素酶III（heparinase III）酶，实现糖萼功能障碍，导致糖萼中的硫酸乙酰肝素成分降解，从而破坏其基质结构12。图 4B 显示了在代表性内皮细胞横截面图中，PEG-AuNPs 摄取程度的不同，表现为红色点状信号。健康的糖萼可抑制这些金纳米颗粒的摄取，而当使用该酶处理后，摄取量显著增加11。该结果突显了这些超小纳米颗粒在递送治疗药物至内皮细胞方面的潜力，其递送过程可通过依赖于糖萼健康状态的特异性相互作用进行调控。
<img alt="用有机分子修饰纳米颗粒的过程示意图，展示表面改性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：金纳米颗粒示意图。（A）PEG替换前THPC包覆的AuNP纳米球。（B）具有三种PEG末端基团的PEG化AuNP，包括COOH、NH2和CH3。蓝色波浪线代表聚合物。（C）用于荧光成像的偶联纳米颗粒。红色星号表示偶联到NH2功能基团上的荧光团。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒尺寸分布；TEM图像与直方图；AuNP与PEG-AuNP分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：金纳米颗粒的尺寸测量。 左图：在添加 PEG 前，于 80 kV 和 150,000× 放大倍数下拍摄的金纳米颗粒透射电子显微镜（TEM）图像，图中显示比例尺。右图：通过动态光散射（DLS）测量的纳米颗粒尺寸分布直方图，分别为 THPC 表面修饰的金纳米颗粒（AuNP）和 PEG 替代 THPC 后的 PEG 修饰金纳米颗粒（PEG-AuNP）。DLS 对 THPC 包覆的 AuNP 的测量结果与 TEM 观察结果一致。而 DLS 对 PEG 包覆 AuNP 的测量克服了 TEM 无法直接观察 PEG 的挑战，因为聚合物不具备足够的电子密度。PEG-AuNP 的 TEM 图像仅显示核心金纳米颗粒，其外观与 THPC 封端的 AuNP 相同。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光发射图；信号与波长的关系，光学研究中的光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：荧光性PEG-AuNP的荧光数据。 在667 nm处的荧光峰与连接到PEG-AuNP上的荧光团的发射波长一致。A.U.：任意单位。
<img alt="显示 PEG-AuNP 浓度的细胞活力图和组织样本的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：荧光标记 PEG-AuNP 与细胞的相互作用。 （A）大鼠脂肪垫内皮细胞在与荧光标记 PEG-AuNP 共孵育16小时后的细胞活力（MTS 代谢）图。 （B）经固定的大鼠脂肪垫内皮细胞的共聚焦截面图像，细胞核用 DAPI 染色（蓝色），并使用针对糖萼组分硫酸乙酰肝素的抗体（绿色）进行染色。上方图像为健康的糖萼层，下方图像为降解的糖萼层；在糖萼降解的样本中，纳米颗粒的红色荧光信号明显更强。比例尺为 10 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

我们介绍了一种合成生物相容性10 nm金纳米颗粒的方法，通过在表面包被聚乙二醇对其进行功能化。这些颗粒可用于 体外 和 体内 用于将治疗药物递送至常规纳米颗粒尺寸难以触及的纳米级细胞内和细胞外空间。

金纳米颗粒（AuNPs）因其尺寸、生物相容性和可修饰的表面而在医学研究中被广泛应用。特异性靶向……

本实验的总体目标是合成直径为10纳米、具有生物相容性、循环时间延长且可通过荧光显微镜成像的功能化聚合物包被金纳米球。该方法有助于解答心血管疾病研究中关于病变条件下内皮通透性的关键科学问题。该技术的主要优势在于能够制备出具有生物相容性的超小颗粒，并提供可用于进一步功能化修饰的官能团。首先，在一个微量离心管中，将12微升80%的THPC用1毫升超纯水稀释。将一个100毫升的圆底烧瓶固定在磁力搅拌器上。向烧瓶中加入45毫升水和一个小型卵形搅拌子。以300 rpm的转速开始搅拌水。向烧瓶中加入0.5毫升1摩尔/升的氢氧化钠溶液和1毫升稀释的THPC溶液。继续剧烈搅拌反应混合物5分钟。然后，在搅拌条件下向反应混合物中加入 2 毫升 25 毫摩尔的氯金酸溶液。观察反应混合物在数秒内由黄色变为深棕色，表明已形成 THPC 封端的带负电荷金纳米颗粒。继续搅拌该混合物 15 分钟。在搅拌混合物的同时，配制异双功能胺基 PEG 硫醇、羧甲基 PEG 硫醇和单功能甲氧基 PEG 硫醇的水溶液。当金纳米颗粒反应混合物搅拌 15 分钟后，将搅拌速度降至 100 转/分钟。在持续搅拌下，将 PEG 溶液逐滴加入该混合物中。在室温下继续轻轻搅拌混合物过夜。然后，使用透析夹封闭一端分子量截留值为12-14千道尔顿的纤维素透析膜。用移液器将反应混合物转移至透析膜中。用第二个透析夹封闭膜的另一端。将纳米颗粒混合物置于四升水中透析，60 RPM 搅拌持续 72 小时。前六小时内每两小时换一次水，之后每六至十二小时换一次水。然后，将半纯化的聚乙二醇化金纳米颗粒混合物通过0.2微米注射器滤器过滤至50毫升锥形管中。将纯化的纳米颗粒溶液在负80摄氏度下冷冻约5小时。使用冷冻干燥机对纯化的纳米颗粒进行冻干。 开始制备荧光标记的聚乙二醇化金纳米颗粒时，将一个100毫升的圆底烧瓶固定在磁力搅拌器上。向烧瓶中加入18毫升超纯水和一个小型卵形搅拌子，并以100 rpm的速度开始搅拌。在一支4毫升的锥形管中，将2毫克冻干的聚乙二醇化金纳米颗粒与2毫升水混合。然后，将纳米颗粒溶液转移至圆底烧瓶中以进行进一步重构。在搅拌条件下，向重构后的纳米颗粒中加入1毫升pH 8.8、0.1摩尔的碳酸盐缓冲液。随后，加入5微升浓度为10毫克/毫升的荧光胺无水琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液。用铝箔包裹烧瓶，完全避光。在室温下持续搅拌荧光纳米颗粒混合物过夜。随后，按照聚乙二醇化金纳米颗粒制备部分所述方法，将混合物在4升水中透析72小时。透析过程中始终用铝箔覆盖容器。留出一毫升纯化的荧光标记聚乙二醇化纳米颗粒用于表征。将剩余的荧光纳米颗粒冷冻、冻干，并在4°C下保存。为了通过透射电子显微镜观察金纳米颗粒核心，首先将10微升纯化的荧光纳米颗粒溶液滴加到碳支持膜覆盖的透射电镜载网上。静置5分钟。然后，使用滤纸从透射电镜载网边缘小心地吸去多余的液体，直至载网上仅留下一层荧光纳米颗粒薄膜。在80千伏电压下对纳米颗粒进行成像，放大倍数为50,000至150,000。为测量纳米颗粒的流体动力学尺寸，取一毫克冻干的THPC包被金纳米颗粒置于微量离心管中。向每根试管中加入一毫升水，并将溶液转移至一毫升透明塑料比色皿中。使用动态光散射技术评估每种溶液，并测量颗粒的球形流体动力学直径。然后，将含有荧光标记的聚乙二醇化金纳米颗粒的比色皿转移至荧光分光光度计中。设定激发波长为 633 纳米，并读取 650 至 800 纳米范围内的发射信号。接下来，为了在7种纳米颗粒浓度下评估生物相容性，首先将100微升含大鼠脂肪垫内皮细胞的DMEM细胞悬液移入96孔透明底无菌组织培养板的21个孔中。将细胞孵育至形成汇合单层后，配制7种浓度范围为0至1000微克/毫升的荧光纳米颗粒DMEM溶液。随后吸除各孔中的DMEM培养基。将七种纳米颗粒溶液中的每种各取 100 微升，分别加入到不同的孔中，每组设三个复孔。让细胞与纳米颗粒共同孵育 16 小时。随后，吸除各孔中的 DMEM 以及悬浮或松散附着的纳米颗粒。向每个孔中加入含有20微升MTS/PES溶液的100微升新鲜DMEM。将细胞在37摄氏度下孵育2小时。然后，使用酶标仪在492纳米波长下通过比色分析评估细胞活力。接下来，将大鼠脂肪垫内皮细胞以每平方厘米10,000个细胞的密度接种于无菌的12毫米玻璃盖玻片上。使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养细胞。孵育细胞直至达到完全汇合。如需修改内皮细胞糖萼，随后将细胞与550微克/毫升的荧光金纳米颗粒孵育16小时。进行免疫荧光显微镜样品制备。将每张盖玻片用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。用指甲油密封盖玻片边缘。使用共聚焦显微镜对免疫染色的内皮细胞进行成像。分别通过蓝色、绿色和远红通道观察细胞核、硫酸乙酰肝素糖萼和纳米颗粒。THPC包被的金纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）结果显示，颗粒直径为2至3纳米。对于聚乙二醇化（pegylated）的纳米颗粒，TEM仅能确认分散颗粒的存在，因为聚乙二醇（PEG）在TEM图像中不可见。动态光散射（DLS）分析显示，THPC包被及聚乙二醇化的纳米颗粒的峰值粒径从2.5纳米 shifted 至10.5纳米。当使用633纳米光激发时，荧光发射在660至672纳米之间达到最大值，与所用荧光探针预期的665纳米最大发射波长一致。大鼠脂肪垫内皮细胞在与荧光标记的聚乙二醇化金纳米颗粒共孵育16小时后，即使在浓度高达1毫克/毫升的情况下，仍表现出相似的存活水平，表明纳米颗粒无明显毒性。在具有健康糖萼的大鼠脂肪垫内皮细胞中，观察到纳米颗粒的摄取极少。在糖萼降解的细胞中，纳米颗粒的红色荧光信号增强，表明其摄取量显著增加。在此步骤之后，可进一步对暴露的活性基团进行修饰，例如通过偶联反应，以实现纳米颗粒对内皮组分的特异性靶向或药物递送。

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