Name: AAV 滴定定量斑点印迹法及其在腺相关病毒组装活化蛋白功能评价中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学习使用斑点印迹法定量腺相关病毒滴度，并评估组装活化蛋白在促进同源及异源AAV衣壳组装中的功能。该方法简便经济，适用于基因治疗研究。

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感谢北卡罗来纳大学教堂山分校的 Xiao Xiao 提供 pEMBL-CMV-GFP 质粒。感谢 Christopher Cheng 和 Samuel J. Huang 对手稿的审阅。本研究得到了公共卫生服务基金（NIH R01 NS088399 和 T32 EY232113）的支持。

注意：本方案所需溶液和缓冲液的配制方法见表1。下述方案针对VP-AAP交叉互补点印迹实验，用于研究AAP蛋白在衣壳组装中的作用。更通用的纯化AAV载体滴度定量点印迹实验方法详见代表性结果部分。
1. VP3、AAP 和 AAV2 Rep 表达质粒的构建
<ol>
	<li>pCMV-AAVx-VP3（x = 血清型）的构建
	<ol>
		<li>使用高保真DNA聚合酶及以下引物对，通过PCR扩增整个VP3开放阅读框（1.6 kb）：VP3上游引物，CTAA-RE1-CACC-N25 （VP3 ORF 的前25个核苷酸）；VP3 反向，TCTT-RE2-N25 （VP3 ORF 的最后25个核苷酸）。 
		注意：RE1 和 RE2 是用于克隆的限制性内切酶（REs）位点。CTAA 和 TCTT 是添加至双链 DNA 末端附近的 5' 和 3' 端四核苷酸序列，以促进限制性内切酶消化。CACC 是 Kozak 共识序列。</li>
		<li>将经限制性内切酶（RE）消化的PCR产物克隆至哺乳动物表达载体相应的RE位点中，该载体采用人巨细胞病毒即刻早期（CMV-IE）增强子-启动子以实现高水平表达。 
		注意：进行分子克隆时，消化 5 µg 用限制性内切酶以每微克4单位的浓度对骨架质粒DNA进行酶切µg DNA在最佳温度下孵育1小时。对于PCR片段，应增加所用酶的单位数（例如，10 U/µg 1.6 kb VP3 ORF PCR产物）以及更长的孵育时间（例如，4 小时）是由于单位长度内限制性酶切位点数量增加所致。有关分子生物学酶、克隆实验步骤（包括细菌转化）的有用信息可参见其他文献。15,16,17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pCMV-FLAG-AAPx（x = 血清型）的构建
	<ol>
		<li>使用高保真DNA聚合酶及以下引物对，对AAP开放阅读框（0.6 kb）进行PCR扩增，扩增区域除外第一个氨基酸编码序列：AAP上游引物，CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 （AAP开放阅读框中第4个核苷酸起的25个核苷酸）；AAP反向，TCTT-RE2-N25 （AAP开放阅读框的最后25个核苷酸）。 
		注意：GACTACAAGGACGACGATGACAAA 编码一个 FLAG 标签，已有研究表明该标签不会产生不利影响4,5 但如果不需要，可以省略。</li>
		<li>将经限制性内切酶消化的PCR产物克隆至含有CMV-IE增强子-启动子的哺乳动物表达载体的相应位点之间15,16,17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pHLP-Rep 的构建
	<ol>
		<li>消化 5 µg 使用20单位的Xho I和Xcm I分别酶切pAAV-RC2质粒（7.3 kb），并通过 commercial DNA纯化试剂盒或苯酚-氯仿抽提法纯化DNA。 
		注意：从 7.3 kb 的 pAAV-RC2 质粒中移除 1.8 kb 的 Xho I-Xcm I 片段会导致衣壳 VP 蛋白表达丧失，但保留 Rep 蛋白的表达。</li>
		<li>使用6单位T4 DNA聚合酶钝化DNA末端，通过琼脂糖凝胶纯化5.5 kb DNA片段，然后根据制造商的建议，使用50至100 ng DNA和400单位T4 DNA连接酶对纯化片段进行自连。15.</li>
		<li>参照步骤1.1.2注释中引用的标准细菌转化实验步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过限制性酶切和测序验证质粒构建15,18.</li>
	<li>使用市售试剂盒进行质粒小提或大提实验，以获得足量质粒DNA用于后续腺相关病毒（AAV）生产实验。</li>
</ol>
2. 通过质粒DNA转染在HEK 293细胞中生产AAV（交叉互补实验）
<ol>
	<li>在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素的高糖（4.5 g/L）杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK 293细胞 &amp; 链霉素混合物，以及 1 mM L-谷氨酰胺，在一个 37 °C 含5%二氧化碳（CO₂）的培养箱2). 
	注意：AAV 滴度因 HEK 293 细胞来源的不同而有显著差异。 
	注意：尽管腺相关病毒（AAV）可在生物安全一级（BSL1）条件下操作，但建议在生物安全二级（BSL2）条件下进行HEK 293细胞实验。</li>
	<li>开启 第-1天（转染前24小时），接种 6–7 × 105 在6孔板中每孔接种HEK 293细胞，加入2 mL步骤2.1所述的完全培养基。通常次日细胞融合度可达约90%。</li>
	<li>第0天：转染
	<ol>
		<li>DNA转染的准备工作
		<ol>
			<li>确保细胞融合度达到约90%。</li>
			<li>预热添加了1%青霉素的DMEM &amp; 链霉素混合液和1 mM L-谷氨酰胺，但不含10% FBS（即，无血清培养基）中 37 °C 水浴锅</li>
			<li>使聚乙烯亚胺（PEI）溶液恢复至室温。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>质粒DNA混合物的制备
		<ol>
			<li>将质粒混合 96 µL 不含 CaCl 的磷酸盐缓冲液（PBS）2 或 MgCl2 在无菌的1.5 mL微量离心管中，按指示进行 表2DNA 的总量为 2 µg/well. 
			注意：如果质粒DNA溶液的体积为名义体积，则可忽略其体积。如果质粒DNA溶液的总体积≥10 µL.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PEI 转染
		<ol>
			<li>添加 4 µL 将PEI溶液（1 mg/mL）加入PBS-质粒DNA混合液（按上述方法制备）。最终体积约为 100 µL （培养基体积的5%）。短暂涡旋混匀各管，室温孵育DNA:PEI混合物15分钟。</li>
			<li>在等待15分钟孵育完成的同时，将培养基更换为步骤2.3.1.2中所述的预热无血清培养基。</li>
			<li>DNA:PEI 混合物孵育15分钟后，用微量离心机短暂离心试管，使液体沉降至管底，然后将DNA:PEI混合物逐滴加入HEK 293细胞培养板各孔的培养基中。轻轻振荡培养板，随后将其放回培养箱 37 °C 5% CO₂ 培养箱2.</li>
			<li>将细胞在此转染培养基中培养至第5天收获（无需更换培养基）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启 第1天 和 第2天在倒置荧光显微镜下观察转染了pCMV-GFP质粒的细胞，以评估转染效率。 
	注意：对于荧光显微镜观察，此处使用10X/0.25数值孔径物镜与10×目镜组合，并采用450–490 nm激发带通滤光片和515–565 nm带通发射滤光片。上述条件通常可实现超过70%的转染效率。细胞可能表现出一定的形态学变化（例如 细胞因无血清条件而变细)</li>
	<li>开启 第3–5天继续在培养箱中培养转染后的细胞 37 °C 5% CO₂ 培养箱2.</li>
	<li>开启 第5天用移液器反复吹打或用细胞刮刀刮取，将细胞和含病毒的培养基收集至15 mL聚丙烯圆锥管中。</li>
	<li>将样品储存在 -80 °C 直至使用。</li>
</ol>
3. 用于AAV定量的点印迹分析
<ol>
	<li>病毒颗粒的回收
	<ol>
		<li>快速将冻存管在37℃水浴中解冻 37 °C 水浴。剧烈涡旋振荡管子1分钟，以最大程度回收细胞中的AAV。</li>
		<li>通过在 3,700 x g 条件下离心沉淀细胞碎片 4 °C 10分钟。取 200 µL 取每管上清液，转移至已标记并带有螺口盖的微量离心管中，用于点印迹实验。 
		注意：将剩余上清液分装至微量离心管中，于 -80 °C 冻存80 °C 以备后续使用。此处使用了带螺口盖和O形圈的聚丙烯微量离心管。必须确保严密密封，以防止AAV和苯酚-氯仿溶液泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理 粘质沙雷菌 核酸内切酶
	<ol>
		<li>制备试剂混合液A和试剂混合液B（表3）。加入 10 µL A混合液 10 µL 将Mix B加入各管中。涡旋振荡各管5秒，短暂离心使液体沉至管底，随后将各管在指定温度下孵育。 37 °C 至少 1 h。 
		注意：A 混合液含有 NaOH，可优化处理过程中的 pH 值 S. marcescens 内切核酸酶。Mix B 补充镁离子。浓度为 S. marcescens 商业可得的酶制品中内切核酸酶的含量可能有所不同。其体积的 S. marcescens 在步骤 3.2.1 中将混合液 A 和混合液 B 加入管中后，需相应调整内切核酸酶的浓度，使其终浓度为 200 U/mL。 
		注意：更长的孵育时间（最长可达4 h）可降低背景信号。</li>
		<li>孵育结束后，使用台式离心机短暂离心管子，以收集管壁顶部和侧壁的冷凝液和溶液。 
		注意：此处可暂停实验流程。样品可在 -20 °C 或 -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白酶K处理
	<ol>
		<li>配制混合试剂C（表3）。加入 180 µL 将混合液C加入各管中。涡旋振荡各管5秒，短暂离心，然后将各管在指定温度下孵育 55 °C 1小时。 
		注意：Mix C 试剂中的 EDTA 可螯合游离镁离子并使其失活 S. marcescens 核酸内切酶</li>
		<li>孵育结束后，将样品置于室温下平衡，然后使用台式离心机短暂离心，以收集管壁顶部和侧壁的冷凝液和溶液。 
		注意：此处可暂停实验流程。样品可在 -20 °C 或 -80 °C. 要继续该实验方案，将试管在指定条件下孵育 55 °C 5到10分钟，以完全溶解缓冲液中的SDS晶体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酚-氯仿抽提与乙醇沉淀
	<ol>
		<li>添加 200 µL 加入酚-氯仿至样品中，涡旋混匀1分钟。在室温下，以≥16,100 × g离心≥5分钟。 
		警告：苯酚-氯仿应在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE； 即，腈类手套、护目镜或面罩，以及长袖实验服）。</li>
		<li>转移 320 µL 水相层的160 µL 用P200移液器吹打两次，转移至新的标准微量离心管中（水相液体体积的80%）。 
		注意：在不同样品之间必须取相同体积的水溶液，否则该检测将失去定量准确性。</li>
		<li>配制混合试剂D（表3）。加入 833 µL 将D混合液加入各管中。涡旋振荡各管5秒，然后将各管在-80 °C 不少于20分钟。 
		注意：混合液 D 是乙醇、乙酸钠和糖原的混合物，用于方便地进行 DNA 的乙醇沉淀。样品可保存于 -80 °C 在此步骤可暂停，后续可继续执行本方案。</li>
		<li>使用微型离心机以 ≥16,100 x g 离心样品 4 °C 至少15分钟。倒去上清液，并用干净的纸巾轻拍一次。加入约 500 µL 将70%乙醇加入每个离心管中，涡旋振荡5秒，并使用台式微量离心机在≥16,100 x g条件下离心 4 °C 不少于5分钟。</li>
		<li>倒掉上清液，并用干净的纸巾轻拭一次。将沉淀物干燥 65 °C；沉淀物可完全干燥。 
		注意：用纸巾吸干管壁后残留的乙醇时，切勿使用移液器吸取。沉淀物也可在室温下干燥过夜。本实验步骤可在此暂停，干燥后的DNA沉淀物可在管盖闭合的条件下于室温保存数天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TE缓冲液中病毒DNA的重悬
	<ol>
		<li>将DNA沉淀溶解在 120 µL 通过在室温下轻轻振荡每支试管30分钟至1小时，用TE缓冲液处理各样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点印迹
	<ol>
		<li>质粒DNA标准品的制备
		<ol>
			<li>将AAV载体基因组质粒DNA稀释至10 ng/μLµL 在水或Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 8.0）中 25 µL 该稀释液，并在反应体系中用适当的限制性内切酶消化1小时，以线性化质粒DNA，反应体积为 50 µL. 
			注意：我们制备两份相同的消化反应（见步骤 3.6.4.1）。所选用的合适酶应能切割质粒 DNA 中位于点杂交探针结合区域之外的位点。为方便起见，可将稀释后的质粒 DNA 分装25 µL/tube) 并于 -80°C 冻存20 °C 以备后续使用。在步骤 3.5.1 振荡试管的同时，对质粒 DNA 进行消化。切勿过度消化质粒 DNA 标准品。</li>
			<li>添加 450 µL 向含有消化后质粒DNA标准品的离心管中加入水或TE缓冲液，并充分混匀。转移 70 µL 将该混合物加入新的1.5 mL微量离心管中 1,330 µL 水或TE缓冲液稀释质粒标准品（25 pg/μL）µL).</li>
			<li>遵循 表4 以制备一系列两倍倍比稀释液（600 µL/tube）。涡旋振荡5秒以充分混匀稀释液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>标准品和病毒DNA样本的变性
		<ol>
			<li>添加 600 µL 向每个标准稀释液中加入2x碱性溶液。涡旋振荡5至10秒，充分混匀。室温孵育10分钟。</li>
			<li>添加 120 µL 向每个病毒DNA样本中加入2x碱性溶液。涡旋振荡5至10秒，充分混匀。室温孵育10分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置点印迹装置
		<ol>
			<li>使用剪刀剪取一张印迹（例如，将zeta探针膜裁剪至适合样本和标准品数量的大小。将膜用纯水浸泡10分钟，然后置于点印迹装置上。用覆盖物封住膜装置上未使用的孔位。 
			注意：使用洁净的镊子操作膜。可使用随膜提供的浅蓝色保护片覆盖空孔。在结合样品和标准品之前，切勿让膜干燥。有关仪器组装和使用的更多详细信息，请参阅用户手册。19.</li>
			<li>向将要加样的孔中加入水。施加真空，使水穿过各孔，以检查是否存在错误，修复后重新测试。在施加真空的同时重新拧紧螺丝，以确保密封严密。 
			注意：密封不完全可能导致样品在孔之间泄漏。</li>
			<li>一旦水完全被抽滤后，彻底释放真空即，真空 manifold 应处于与大气压相通的状态）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将标准品和样品加入点印迹装置
		<ol>
			<li>应用 400 µL 将每种稀释后的质粒DNA标准品加入到各孔中，运行四列标准品稀释梯度。取两份独立的等分标准消化产物，每份重复加样两次。应用 200 µL/well 每份病毒DNA样本 
			注意：使用剩余的约~40 µL 变性样品可制备稀释样品（例如，使用10倍稀释的样品 20 µL 样品加 180 µL （必要时用1×碱性溶液冲洗并吸干。）</li>
			<li>施加轻柔的负压，使DNA溶液穿过小孔。 
			注意：需要通过部分打开三通阀来调节真空压力，使真空压力同时作用于点印迹装置和大气环境即，将旋塞臂置于大约 45° 角度，此时会发出更大的吸力声）。</li>
			<li>所有孔中的液体流尽后，通过调节三通阀释放真空。加入 400 µL 向含有标准品和样品的每个孔中加入1x碱性溶液。等待5分钟后，再次施加真空以排空各孔。</li>
			<li>以相同方式重新施加真空（见步骤 3.6.4.2）。</li>
			<li>在真空条件下拆卸点印迹装置，取出膜并用 2x SSC 缓冲液冲洗。将膜放置在干净的纸巾上，使结合有 DNA 的一侧朝上，以去除多余的 2x SSC。</li>
			<li>使用适当的紫外交联仪将印迹上的DNA与膜进行紫外交联；膜现已准备好用于杂交。 
			注意：湿膜可用于紫外交联。干燥的紫外交联膜可在室温下保存。更多详细信息请参见 材料表.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交与洗涤
	<ol>
		<li>将杂交缓冲液在水浴中预热 65 °C 水浴锅</li>
		<li>用放射性 α- 酶法标记 DNA 探针32使用市售试剂盒，按照生产商推荐的方法纯化P dCTP。 
		注意：我们使用长度为0.5–2.0 kb的探针，来源于病毒基因组中的增强子-启动子区域或蛋白质编码序列。尽管本方案采用 32可用于信号检测的P标记放射性探针，也可使用非放射性的化学发光或荧光探针（详见下文） 讨论 部分）。</li>
		<li>将膜放入杂交瓶中，DNA结合面朝上，用5 mL预热的杂交缓冲液冲洗膜，弃去缓冲液。随后加入10 mL预热的杂交缓冲液，将杂交瓶置于旋转杂交炉中，温度设为 65 °C旋转至少5分钟。</li>
		<li>热变性 20 µL 10 mg/mL 剪切的鲱鱼或鲑鱼精子DNA溶液 32P标记的探针（≥107 cpm）5 分钟，将离心管置于设定为 100 °C然后在冰上快速冷却至少2分钟，短暂离心，并在使用前保持在冰上。 
		注意：对于放射性DNA探针，必须使用带螺口盖和O形圈的1.5 mL离心管。</li>
		<li>迅速将变性的精子DNA和放射性探针加入杂交瓶中的杂交缓冲液内，振荡混匀10秒。将杂交瓶放回 65 °C 烘箱中旋转孵育瓶 65 °C ≥4 小时</li>
		<li>杂交完成后，停止旋转，取出杂交瓶，将放射性探针溶液倒入带有防漏封口盖的50 mL锥形管中。将探针储存于适当的容器内，并置于指定存放放射性物质的冰箱中。 
		注意：使用含有储存于特定条件下的探针的杂交缓冲液 4 °C 可将装有杂交缓冲液并配有防漏密封盖的50 mL锥形管置于 100 °C 水浴5分钟。</li>
		<li>用预热至指定温度的洗涤缓冲液洗涤膜 65 °C向杂交瓶中加入20至30 mL洗涤缓冲液，旋转5分钟。重复此洗涤步骤2次。 
		注意：根据当地机构要求，测量洗涤液的放射性并记录结果。</li>
		<li>洗涤膜的同时，将磷光成像屏置于成像擦除仪上照射5分钟。</li>
		<li>第三次洗涤后，将膜从杂交瓶中取出，用纸巾吸去膜表面多余的缓冲液，然后将膜放入透明的塑料胶片保护袋中。使用盖革计数器检测膜上的放射性信号。根据信号强度，将已擦除的磷屏成像仪暴露于膜上10分钟至过夜。</li>
		<li>使用磷屏成像系统扫描膜，并获取每个点的信号强度数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>使用电子表格和数据分析软件绘制标准曲线例如，Excel） 
		注意：采用半对数线性回归绘制标准曲线。</li>
		<li>通过插值法确定每个病毒DNA样本的纳克当量（ng-eq）。ng-eq是指用于绘制标准曲线的质粒DNA量，其对应于病毒DNA分子的数量。当质粒DNA长度为8,000 bp时，1 ng-eq单链AAV病毒DNA相当于2.275 × 108 颗粒 
		注意：ng-eq 可通过以下公式换算为病毒颗粒数量： 
		<img alt="用于计算单链腺相关病毒颗粒的公式；分子生物学，基因治疗分析。" src="/files/ftp_upload/56766/56766eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		<img alt="双链 AAV 粒子计算公式，0.91×ng/长度(bp)×10¹²，公式计算" src="/files/ftp_upload/56766/56766eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
		AAV颗粒的数量通常以“vg”（载体基因组）或“DRP”（DNase I抗性颗粒）表示。</li>
		<li>计算起始材料的 AAV 浓度。因为印迹的病毒 DNA 代表了 66.7% <img alt="百分比产率计算公式；方程；教育数学应用" src="/files/ftp_upload/56766/56766eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"> 起始材料中病毒DNA的1 ng-eq相当于1.7 × 109 颗粒/mL <img alt="数学公式：((2.275/0.667) ÷ 0.2) × 1 × 10^8；数值计算过程。" src="/files/ftp_upload/56766/56766eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4">. 
		注意：如果起始材料中所有的病毒DNA在无损失的情况下均已被转移至膜上，则无需进行此校正（参见 图1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+assembly+factor+promotes+AAV2+capsid+formation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).</li>
<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
<li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li>
<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+Virus+%28AAV%29+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4%2C+5%2C+and+11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告描述了定量点印迹法在研究 AAV AAP 及其在衣壳组装中作用方面的应用价值。这些研究获得的知识可为不同血清型之间 AAV 衣壳组装过程的内在差异以及 AAP 的功能角色提供详细的见解。在这方面，AAV VP3-AAP 互补点印迹实验表明，Snake AAV VP3 在衣壳组装过程中严格依赖其同源 AAP 的共表达，而 Snake AAP 不能促进异源血清型的衣壳组装。这一现象引人关注，因为此前研究过的依赖 AAP 的 AAV 血清型（AAV1、2、3、6、7、8、9 和 12）均能够在一定程度上利用异源 AAP 完成组装6。
定量点印迹或狭缝印迹杂交是一种传统方法，可方便地同时定量多个样品中的核酸含量25。在20世纪90年代qPCR普及之前，该方法已被广泛用于DNA和RNA的定量26,27。尽管qPCR在灵敏度更高、动态范围更广方面优于定量点印迹及其他基于杂交的检...

腺相关病毒（AAV）是一种小型、无包膜、单链DNA病毒，其基因组大小约为4.7千碱基（kb）。AAV基因组包含编码rep和cap基因的开放阅读框（ORFs）。2010年，Sonntag 等发现了一种此前未被识别的非结构蛋白，该蛋白由AAV2 cap基因内一个+1移码的开放阅读框编码，被证实对AAV2衣壳VP单体蛋白组装成病毒衣壳具有关键作用1。由于该蛋白在促进衣壳组装中发挥功能，这一新型蛋白被命名为组装激活蛋白（assembly-activating protein, AAP）1。
AAP 的开放阅读框（ORF）已通过生物信息学方法在 Dependoparvovirus 属所有细小病毒的基因组中被鉴定出，但在细小病毒科其他属病毒的基因组中未发现1,2。对该新型蛋白的功能研究最初集中于原型腺相关病毒2型（AAV2）的 AAP（AAP2），已证实 AAP2 在将未组装的 VP 蛋白靶向至核仁以积累并形成完整组装衣壳的过程中发挥关键作用1,3,4。多个研究团队（包括我们实验室）已独立证实，在缺乏 AAP 表达的情况下，AAV2 衣壳无法完成组装1,2,3,4,5。后续针对 AAV 血清型 1、8 和 9 的研究进一步验证了 AAP 在衣壳组装中的关键作用，因为在不共表达 AAP 的情况下，AAV1、AAV8 和 AAV9 的 VP3 单体蛋白均无法形成完整组装的衣壳2。
最近，通过包括定量点印迹分析在内的方法，我们研究了在无AAP表达的情况下AAV1至12型VP3单体组装成衣壳的能力，以及AAP1至12型促进异源血清型VP3单体组装的能力。本研究发现，AAV4、5和11型的VP3单体可在无AAP的情况下完成组装。此外，我们还发现，在所检测的十二种AAP血清型中，有八种即除AAP4、5、11和12外，其余AAP均表现出广泛支持异源AAV血清型衣壳组装的能力，而AAP4、5、11和12在该方面的能力显著受限6这四种血清型在系统发育上与其他AAP血清型相距较远2,3此外，该研究揭示了不同AAPs在亚细胞定位上存在显著异质性。6此外，该研究提示，AAP 与组装好的衣壳及核仁的紧密关联——这是 AAV2 衣壳组装的标志性特征——未必适用于其他血清型，包括 AAV5、AAV8 和 AAV9，这些血清型的组装衣壳表现出核仁排斥现象。6因此，对任何特定血清型AAP的研究所得信息并不能广泛适用于所有AAP生物学特性。AAP生物学的这种令人困惑的特性凸显了有必要对来自经典和非经典AAV血清型的每种AAP的作用和功能进行深入研究。
可以通过测定在人胚胎肾（HEK）293细胞中产生的完整包装的AAV病毒颗粒滴度来评估AAP在衣壳组装中的生物学作用，HEK 293细胞是AAV载体生产中最常用的细胞系，可在有或无AAP蛋白表达的情况下进行比较。AAV定量的标准方法包括基于定量PCR（qPCR）的检测方法7,8和基于定量点杂交的检测方法9。其他用于AAV病毒颗粒定量的方法，如酶联免疫吸附测定10,11或光密度测定12，对于来自多种不同AAV血清型的样品或含有杂质（如粗裂解液或培养基）的样品并不理想，而这些样品通常是AAV研究中常用的。目前，qPCR是AAV定量应用最广泛的方法；然而，必须认识到基于qPCR的检测方法可能存在的一些局限性，因为该方法可能导致系统性误差和显著的滴度差异13,14。基于PCR的检测方法受多种潜在干扰因素的影响，例如PCR模板中存在的共价闭合末端发夹结构会抑制扩增效率13。即使是经验丰富的操作者也可能在无意中引入影响qPCR检测结果的干扰因素13。相比之下，定量点杂交检测是一种经典的分子生物学技术，不涉及基因组扩增，其原理更为简单，与基于qPCR的方法相比出错风险极低。该方法技术难度较低，因此即使由经验不足的操作者执行，实验结果也具有合理的可重复性。
在本报告中，我们描述了一种常规用于腺相关病毒（AAV）载体定量的定量点印迹（dot blot）检测方法的详细操作步骤，并举例说明如何应用该方法研究组装促进蛋白（AAP）在常见血清型（AAV5 和 AAV9）以及一种此前未被表征的蛇源 AAV AAP14 中促进衣壳组装的作用。在自然界中，AAV 的 VP 蛋白和 AAP 蛋白由同一基因以顺式表达（即 VP-AAP 顺式互补）；而在本研究所描述的检测方法中，VP 和 AAP 蛋白由两个独立的质粒分别以反式提供（即 VP-AAP 反式互补）。由于来自不同血清型的每种 VP 或 AAP 蛋白均可由各自独立的质粒表达，因此可以测试异源 VP-AAP 组合在衣壳组装中的作用（即 VP-AAP 交叉互补）。简言之，通过质粒 DNA 转染，在 HEK 293 细胞中表达多种血清型的 AAV VP3 蛋白，在存在或不存在同源血清型 AAP 的情况下包装 AAV 载体基因组，或在存在异源血清型 AAP 的情况下进行包装。生产完成后，对培养上清和细胞裂解物进行点印迹检测，以定量衣壳内部的病毒基因组。点印迹检测的第一步是用核酸酶处理样品，以去除样品中污染的质粒 DNA 和未包装的 AAV 基因组；若不进行此步骤，尤其在检测未经纯化的样品时，将导致背景信号升高。随后进行蛋白酶处理，以破坏病毒衣壳并释放出耐核酸酶的病毒基因组至溶液中。接着，将病毒基因组变性后点样至膜上，并与特异性的病毒基因组 DNA 探针杂交，以实现定量。在本研究示例中，我们证明蛇源 AAV VP3 的衣壳组装依赖于蛇源 AAP，而蛇源 AAP 不能促进 AAV9 衣壳的组装——这与许多来源于依赖 AAP 的血清型的 AAP 不同，后者通常也能促进异源血清型衣壳的组装。最后，我们指出在基于 qPCR 或点印迹的 AAV 定量检测中存在一个重要注意事项：核酸酶的选择会显著影响检测结果。

<table><tbody><tr><td>苯并核酸酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td><td>在正文中的名称为 &lt;em&gt;Serratia marcescens 内切核酸酶&lt;/em&gt;。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>在正文中的名称为 DNase I 酶 A。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>在正文中的名称为 DNase I 酶 B。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>在正文中的名称为 DNase I 酶 C。</td></tr><tr><td>1.5 mL 带O型圈螺口离心管</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>AAV-293 细胞</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>用于包装 AAV 病毒颗粒的优化 HEK-293 细胞系。</td></tr><tr><td>AccuGENE 0.5 M EDTA 溶液</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE 缓冲液</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot 装置</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>DNA 提取试剂盒</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>用于纯化病毒的定量点杂交实验。我们仅使用制造商提供的说明书方案2中每一步推荐试剂体积的一半。</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）-高糖（4.5 g/L）</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B 细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>在文中称为多聚蔗糖 400。</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>鲱鱼精子 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>杂交管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser 电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini Quick Spin DNA 柱</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 载体</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>磷屏成像曝光盒</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>磷屏成像板</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>11708013</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II 随机引物标记试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>引物 AAP 正向（N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 为 AAP ORF 第4个核苷酸起始的25个核苷酸，RE1 为用于克隆的限制性内切酶位点）：CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA&lt;br /&gt;CGACGATGACAAA-N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;</td><td>MilliporeSigma</td><td>定制引物</td><td></td></tr><tr><td>引物 AAP 反向（N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 为 AAP ORF 最后25个核苷酸，RE2 为用于克隆的限制性内切酶位点）：TCTT-RE2-N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;</td><td>MilliporeSigma</td><td>定制引物</td><td></td></tr><tr><td>引物 VP3 正向（N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 为 VP3 ORF 起始的25个核苷酸，RE1 为用于克隆的限制性内切酶位点）：CTAA-RE1-CACC-N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;</td><td>MilliporeSigma</td><td>定制引物</td><td></td></tr><tr><td>引物 VP3 反向（N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt; 为 AAP ORF 最后25个核苷酸，RE2 为用于克隆的限制性内切酶位点）：TCTT-RE2-N&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;</td><td>MilliporeSigma</td><td>定制引物</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>三碱柠檬酸钠二水合物</td><td>MilliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的 6 孔板</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 缓冲饱和酚</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>使用最佳交联模式，提供 120 mJ/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 的紫外能量剂量。</td></tr><tr><td>Zeta-Probe 膜</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于腺相关病毒滴定的定量点印迹检测方法及其在腺相关病毒组装激活蛋白功能评估中的应用

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

尽管腺相关病毒（AAV）被广泛认为是基因治疗中一种理想的载体，它同时也被用作研究病毒生物学的模型病毒。在这一领域，近期发现了一种非结构蛋白——称为组装激活蛋白（AAP），为理解病毒衣壳VP蛋白组装成完整衣壳的过程提供了新的视角。尽管许多AAV血清型的组装依赖于AAP，但我们最近的研究表明，AAV4、AAV5和AAV11是这一规律的例外。此外，我们还发现不同血清型的AAP及其组装完成的衣壳定位于不同的亚细胞区域。这种在不同AAV血清型之间AAP生物学特性与功能作用上的意外异质性，凸显了对来自多种血清型的AAP进行研究的重要性。本文详细描述了一种简便的点印迹（dot blot）检测方法，用于AAV的定量，并应用于评估衣壳组装过程中对AAP的依赖性及血清型特异性。为了展示该点印迹检测方法的应用价值，我们对一种此前未被表征的爬行动物AAV——Snake AAV的衣壳组装特性及其对AAP的依赖性进行了分析，同时纳入了已知不依赖AAP的AAV5和依赖AAP的AAV9作为对照。检测结果显示，Snake AAV的衣壳组装需要Snake AAP，而AAV5和AAV9的AAP无法促进其组装。此外，该检测还表明，与许多可通过交叉互补促进异源衣壳组装的常见血清型AAP不同，Snake AAP不能促进AAV9衣壳的组装。另外，我们发现核酸酶的选择显著影响点印迹检测的结果，因此，选择最适酶对于准确测定AAV滴度至关重要。

大规模制备的纯化AAV载体库存液定量点印迹结果的代表性示例如下所示 图1通过该点印迹法测定了双链AAV2G9-CMV-GFP病毒载体储备液的滴度。该载体经两轮氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心纯化，随后进行透析，具体方法如前所述。20通常情况下，对于纯化的AAV载体储备液，每种AAV载体储备液需取三个不同的体积例如, 0.3 µL, 0.1 µL，以及 0.03 µL) 采用上述点印迹实验步骤进行重复实验，其中以DNase I酶A替代 S. marcescens 在步骤3.2中使用内切核酸酶，在步骤3.4中使用市售试剂盒提取和纯化病毒DNA（参见 材料清单）。在所示的示例中 图1，从每个质粒DNA标准品获得的信号强度值（任意单位）（图1A) 根据已知的DNA量绘制标准曲线（<st...

本文详细描述了一种简便的点印迹法，用于定量腺相关病毒（AAV）滴度，并介绍了该方法在研究组装激活蛋白（AAPs）中的应用。AAPs是一类在所有AAV血清型中发现的新型非结构病毒蛋白，可促进同源及异源AAV血清型衣壳的组装。

尽管腺相关病毒（AAV）被广泛认为是基因治疗中一种理想的载体，它同时也被用作研究病毒学机制的模式病毒……

该方法可测定纯化和非纯化腺相关病毒（AV）的空载体滴度，并评估腺相关病毒辅助蛋白（AAV AAP）促进同源及异源AV血清型衣壳组装的能力。该技术的主要优势在于其操作简便、成本低廉，且避免了其他AAV滴定方法的诸多缺点。尽管该方法通常用于AAV载体的定量，但如本方案所示，它也可应用于解答有关AAV生物学的多种基础科学问题。在第0天，将HEK 293细胞培养至90%融合度后，取无钙、无镁的磷酸盐缓冲液（PBS）96微升，加入无菌的1.5毫升微量离心管中，并与质粒混合，配制转染试剂。如本表所示，每孔总DNA用量为2微克。向PBS质粒DNA混合物中加入4微升PEI溶液。最终体积约为100 µL，或培养基体积的5%。短暂涡旋混匀试管，并将DNA-PEI混合物在室温下孵育15分钟。孵育结束后，在微量离心机中短暂离心试管，使液体全部收集至管底。将DNA与PEI的混合物逐滴加入HEK 293细胞培养板每个孔的培养基中。然后轻轻振荡培养板，并将其放回含5%CO2的37°C培养箱中。HEK 293细胞的转染是本实验方案中实现高滴度病毒生产的关键步骤。应使用健康且低代次的细胞，并注意不要破坏细胞的单层结构。在第1天和第2天，于倒置荧光显微镜下观察转染了PCMVGFP质粒的细胞，以评估转染效率。在第5天，用移液器反复吹打含有病毒的细胞培养液，或使用细胞刮刀刮下所有细胞。然后，将悬液转移至15毫升聚丙烯圆锥形试管中。将样品在-80 °C下保存，直至使用。为回收病毒颗粒，需在37 °C水浴中快速解冻冷冻的试管。然后，剧烈涡旋振荡各管1分钟，以最大程度回收细胞中的AAV。在3,700 × g、4 °C条件下离心10分钟，沉淀细胞碎片。随后，将每管上清液中的200 µL转移至带有螺帽并已标记的微量离心管中，用于点印迹分析。为了用粘质沙雷氏菌核酸酶处理样品，准备试剂A和试剂B。向每个样品管中加入各10微升的两种试剂。将样品涡旋混匀5秒，并短暂离心，使液体收集至管底。然后将离心管置于37摄氏度孵育至少一小时。短暂离心样品后，通过配制试剂C并加入180微升至每个离心管中，进行蛋白酶K处理。随后涡旋混匀，并再次短暂离心，将离心管在55摄氏度孵育一小时。待样品恢复至室温后，加入 200 微升苯酚-氯仿，涡旋振荡管子 1 分钟。然后在微型离心机中以 16,100 × g 的转速、室温离心至少 5 分钟。将水相层 320 微升或水相液体体积的 80% 转移至新的标准微型离心管中。此转移步骤至关重要，因为必须从样品中取用相同体积的溶液，以确保 AAV 定量的准确性。在移除水相层时，应小心避免接触有机相。配制混合试剂 D，并向每个样品管中加入 833 µL。将离心管涡旋振荡后，在-80摄氏度下孵育至少20分钟。离心后，倒出上清液，并将离心管在干净的纸巾上轻拍一次。向每根离心管中加入约500 µL的70%乙醇

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生物学

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