一种用于腺相关病毒滴定的定量点印迹检测方法及其在腺相关病毒组装激活蛋白功能评估中的应用

该方法可测定纯化和非纯化腺相关病毒（AV）的空载体滴度，并评估腺相关病毒辅助蛋白（AAV AAP）促进同源及异源AV血清型衣壳组装的能力。该技术的主要优势在于其操作简便、成本低廉，且避免了其他AAV滴定方法的诸多缺点。尽管该方法通常用于AAV载体的定量，但如本方案所示，它也可应用于解答有关AAV生物学的多种基础科学问题。

在第0天，将HEK 293细胞培养至90%融合度后，取无钙、无镁的磷酸盐缓冲液（PBS）96微升，加入无菌的1.5毫升微量离心管中，并与质粒混合，配制转染试剂。如本表所示，每孔总DNA用量为2微克。向PBS质粒DNA混合物中加入4微升PEI溶液。

最终体积约为100 µL，或培养基体积的5%。短暂涡旋混匀试管，并将DNA-PEI混合物在室温下孵育15分钟。孵育结束后，在微量离心机中短暂离心试管，使液体全部收集至管底。

将DNA与PEI的混合物逐滴加入HEK 293细胞培养板每个孔的培养基中。然后轻轻振荡培养板，并将其放回含5%CO2的37°C培养箱中。HEK 293细胞的转染是本实验方案中实现高滴度病毒生产的关键步骤。

应使用健康且低代次的细胞，并注意不要破坏细胞的单层结构。在第1天和第2天，于倒置荧光显微镜下观察转染了PCMVGFP质粒的细胞，以评估转染效率。在第5天，用移液器反复吹打含有病毒的细胞培养液，或使用细胞刮刀刮下所有细胞。

然后，将悬液转移至15毫升聚丙烯圆锥形试管中。将样品在-80 °C下保存，直至使用。为回收病毒颗粒，需在37 °C水浴中快速解冻冷冻的试管。

然后，剧烈涡旋振荡各管1分钟，以最大程度回收细胞中的AAV。在3,700 × g、4 °C条件下离心10分钟，沉淀细胞碎片。随后，将每管上清液中的200 µL转移至带有螺帽并已标记的微量离心管中，用于点印迹分析。

为了用粘质沙雷氏菌核酸酶处理样品，准备试剂A和试剂B。向每个样品管中加入各10微升的两种试剂。将样品涡旋混匀5秒，并短暂离心，使液体收集至管底。

然后将离心管置于37摄氏度孵育至少一小时。短暂离心样品后，通过配制试剂C并加入180微升至每个离心管中，进行蛋白酶K处理。随后涡旋混匀，并再次短暂离心，将离心管在55摄氏度孵育一小时。

待样品恢复至室温后，加入 200 微升苯酚-氯仿，涡旋振荡管子 1 分钟。然后在微型离心机中以 16,100 × g 的转速、室温离心至少 5 分钟。将水相层 320 微升或水相液体体积的 80% 转移至新的标准微型离心管中。

此转移步骤至关重要，因为必须从样品中取用相同体积的溶液，以确保 AAV 定量的准确性。在移除水相层时，应小心避免接触有机相。配制混合试剂 D，并向每个样品管中加入 833 µL。

将离心管涡旋振荡后，在-80摄氏度下孵育至少20分钟。离心后，倒出上清液，并将离心管在干净的纸巾上轻拍一次。向每根离心管中加入约500 µL的70%乙醇，并涡旋振荡5秒。

再次离心样品后，倒掉上清液，并将离心管在干净的纸巾上轻拍一次以吸干残留液体。然后在 65 摄氏度下干燥沉淀，再用 TE 缓冲液重新悬浮。为进行点杂交实验，通过将 AAV 载体基因组质粒 DNA 用无菌水或 Tris-HCl 缓冲液稀释至 10 纳克/微升，制备质粒 DNA 标准品。

取25微升稀释后的质粒DNA，加入适当的限制性内切酶，在50微升反应体系中酶切1小时，使其线性化。向含有已消化质粒DNA标准品的离心管中加入450微升水或TE缓冲液，充分混匀。然后取70微升该混合液转移至新的1.5毫升微量离心管中，加入1,330微升水或TE缓冲液，配制稀释的质粒标准品。

为设置点印迹装置，使用剪刀将印迹膜裁剪至适合样品和标准品数量的适当大小。将膜浸泡在水中10分钟，然后将其放置在点印迹装置上。随后，封闭未使用的孔。

向将要加样的孔中加入水。施加真空，使水通过各孔，检查是否存在错误，然后重新拧紧螺丝。如有必要，重新测试。

将每种稀释后的质粒DNA标准品各400微升加入到每个孔中，并运行四孔标准品稀释液。取两份独立的等分标准消化产物，每份重复加样两次。然后将每种病毒DNA样本各200微升加入到每孔中。

施加轻柔的负压，使DNA溶液通过各孔。当所有孔中的溶液排空后，通过调节三通阀释放负压。向每个孔中加入400 µL的X碱性溶液。

然后等待五分钟，再重新施加真空以排空各孔。重新施加真空后，拆卸点印迹装置。随后取出膜，并用两倍浓度的 SSC 缓冲液冲洗。

将膜放置在洁净的纸巾上，使结合有 DNA 的一侧朝上，以去除多余的缓冲液。使用适当的紫外交联仪将印迹上的 DNA 与膜进行紫外交联。该膜现在即可用于杂交。

将膜放入杂交瓶中，DNA结合面朝上。用5至10毫升预热的杂交缓冲液冲洗膜，然后弃去缓冲液。随后加入10毫升预热的杂交缓冲液，将杂交瓶置于65摄氏度的旋转杂交炉中。

将瓶子旋转至少五分钟。迅速将变性的精子DNA和放射性探针加入瓶中的杂交缓冲液，并振荡10秒以混匀。将瓶子放回65摄氏度的烘箱中，在65摄氏度下旋转孵育至少四小时。

杂交完成后，停止旋转。取出杂交瓶，然后将放射性探针溶液倒入带有防漏密封盖的50毫升锥形管中。为洗涤膜，向杂交瓶中加入20至30 µL预热的洗涤缓冲液，并旋转5分钟。

重复此洗涤步骤两次。第三次洗涤后，将膜从杂交瓶中取出，并用纸巾去除膜上多余的缓冲液。然后将膜放入一个透明的塑料文件袋中。

使用盖革计数器检测膜上的放射性信号。将已擦除的磷屏成像板暴露于膜上后，使用磷屏成像扫描系统扫描成像板，并获取每个点信号强度的数据。根据文本方案进行数据分析。

该AAV 2G9载体滴定的定量点印迹包含两组标准品以及三种不同量的AAV载体样品，每种设置两个重复，分别为0.3、0.1和0.03微升。点印迹上待检测的样品量是通过经验确定或基于初步检测结果设定的。通过插值法测定，AAV 2G9载体的0.3、0.1和0.03微升等分试样平均每微升相当于5.16、0.27纳克。

通过定量点印迹法评估了AAV5、AAV9和蛇AAV的VP3衣壳蛋白与AAP蛋白所有可能的同源及异源血清型组合在衣壳组装中的表现。该图结果显示，无论是否由反式提供AAP，AAV5 VP3均能组装。此外，AAP5和AAP9均可促进AAV9 VP3衣壳的组装，但AAP5的功能效率低于AAP9。

AAP5和AAP9均不能促进蛇AAV VP3的组装，而蛇AAP仅能促进蛇AAV VP3的组装。采用点印迹分析评估了三种市售核酸酶在含有细胞及培养基来源杂质的非优化条件下的核酸酶活性。结果表明，酶A的活性低于另外两种酶，说明核酸酶的选择可能显著影响点印迹检测的结果读出。

该技术操作简便，适用于腺相关病毒（AAV）载体的定量分析，并在评估AAP在促进同源及异源血清型AAV衣壳组装中的作用方面具有重要作用。一旦掌握，只要在细胞培养实验中获得检测样本，该技术可在一天内完成。在操作过程中，务必注意准确移取液体体积，以确保定量结果的准确性。

在该方法建立后，定量点印迹法被应用于AAP研究，为腺相关病毒（AAV）生物学领域的研究人员进一步理解AAV衣壳组装机制开辟了道路。请注意，操作人源细胞、病毒制剂、苯酚-氯仿以及放射性物质可能具有极高危险性，必须穿戴实验服、手套和护目镜以减少暴露风险。

这些材料只能在经批准的区域内操作。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备用于腺相关病毒（AAV）定量的点印迹样品、搭建点印迹装置、测定AAV滴度，并将该方法应用于AAV生物学研究。在完成本操作流程后，还可进一步开展其他检测，例如在培养细胞中进行AAV载体转导实验，以回答更多科学问题，如比较载体的功能性滴度与通过点印迹法测定的物理颗粒滴度。