胚胎期暴露于低剂量毒物的长期行为与生殖影响

这些实验的总体目标是研究早期胚胎发生阶段低剂量双酚A（BPA）暴露的长期影响。秀丽隐杆线虫（C.elegans）胚胎在有限时间内暴露于BPA，并在发育至成虫阶段后检测其繁殖力和学习行为。该方法有助于回答有关双酚类及其他内分泌干扰化合物等有毒物质暴露对发育长期影响的关键科学问题。

该技术的主要优势在于，它能够通过在一种易于使用的无脊椎动物实验模型上进行定量行为分析，检测毒物对发育过程的长期且细微的影响。该技术的意义在于有助于理解即使在低剂量暴露下，毒物对健康产生有害影响的发育与神经基础。当我们意识到许多复杂或多种因素导致的疾病似乎都存在某种发育层面的因素时，便首次提出了开展这些实验的想法。

这可能部分通过关键基因的异常表达来发挥其影响。该方法的可视化演示至关重要，因为仅通过基于文本的说明很难掌握内部触觉适应步骤。同步前一天，将N2线虫转移至含有NGM培养基并涂有大肠杆菌OP50的100毫米培养皿中。

将组织切成约一平方厘米的小块。在20摄氏度下培养线虫三天。三天后，当培养皿中充满健康摄食、成熟的成虫且其体内可见胚胎时，开始同步化处理：首先用5毫升M9缓冲液冲洗每个培养皿，并将液体转移至无菌的15毫升锥形离心管中。

在室温下以3,000 × g离心4分钟。离心后，使用10 mL移液器小心地从每一份成虫蠕虫松散沉淀中移除上清液。然后向每一份蠕虫沉淀中加入5 mL新配制的次氯酸盐溶液，并轻轻混匀。

在室温下以3,000 × g离心4分钟。获得同步化的群体至关重要。配制新鲜的次氯酸盐溶液有助于避免污染和动物不同步。

接下来，使用10毫升移液管去除上清液，并用7毫升M9缓冲液洗涤。重复此步骤两次。最后一次洗涤后，向卵中加入约100微升M9缓冲液。

然后将约50微升的卵转移到含有用S缓冲液稀释的BPA的2毫升微量离心管中。根据表格所示，调整S缓冲液的用量，以确保每管中BPA的最终浓度正确。将试管置于摇床或旋转摇床上，于20摄氏度下以每分钟25次倾斜或25 RPM的速度振荡孵育4小时。

4小时后，将试管放入试管架中，让线虫沉降。弃去上清液，将线虫转移至接种了OP50大肠杆菌的NGM平板上。在20摄氏度下培养线虫60小时。

每天检查培养皿是否有污染。受污染的NGM培养皿通常会出现变色，并伴有单个菌落。在显微镜下检查线虫是否过于密集。

首先，使用经火焰灭菌的30号铂金丝接种针，将约十只同步化的年轻成虫线虫转移至新的未接种NGM平板上。将线虫静置五分钟，使其有时间适应新培养皿的环境。然后，将固定在木签或牙签末端的眉毛毛发浸入70%乙醇中进行消毒。

用干净无绒的纸巾擦拭，并等待一分钟使乙醇挥发。使用眉毛轻轻触碰线虫的头部。重复进行触碰，每次触碰之间间隔十秒，以使线虫恢复。

继续触碰，每次刺激之间保持10秒的间隔，直到线虫不再向后移动为止。记录发生习惯化所需的触碰次数。每次触碰之间保持10秒间隔非常重要，因为这为动物提供了恢复时间，有助于获得一致的习惯化行为检测结果。

与水平线所示的对照组相比，胚胎期暴露于一微摩尔或更高浓度双酚类化合物（BPAs）的成年动物产卵数量显著减少。源自胚胎期暴露于低至0.1微摩尔双酚类化合物（BPA）浓度的成年动物表现出非关联性学习缺陷，表现为需要更多次前端触碰才能达到习惯化。在准备胚胎以进行双酚类化合物（BPA）暴露处理时，应选择含有充分喂养的秀丽隐杆线虫（C. elegans）成虫且在解剖显微镜下可见成熟卵的培养皿，以确保获得足够的样本量。

该技术为环境毒理学领域的研究人员评估毒素及其他内分泌干扰化合物对行为的影响并设计机制性实验铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将早期阶段的秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎暴露于双酚A（BPA），以及如何检测由经BPA暴露的胚胎发育而来的成虫的 Habituation 行为。