Name: 一种改进的麻醉小鼠脑脊液采集方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习使用显微操作仪从麻醉小鼠采集脑脊液的改进方法，通过玻璃毛细管精准穿刺枕骨大池，减少血液污染，提高样本纯度与体积，适用于神经疾病生物标志物分析。

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本工作得到中国国家自然科学基金（81650110527，81371400）和中国国家重点基础研究发展计划（2013CB530900）的支持。

所有动物实验均按照美国神经科学学会（Society for Neuroscience, USA）和复旦大学（中国上海）伦理委员会的政策进行。本操作适用于非存活手术。
1. 脑脊液采集装置的设置
<ol>
	<li>使用显微拉针仪将玻璃毛细管（内径 0.75 mm，外径 1.0 mm）拉制成细针（如 Liu et al.10 所示；锐化的毛细管见图 1）。</li>
	<li>将锐化的玻璃毛细管牢固地插入安装在显微操作器上的毛细管固定器中（图 1A）。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用直头镊子折断锐化毛细管的尖端，使断裂后的尖端内径约为 10–20 µm（图 1C）。</li>
	<li>将一根细管和一个注射器连接到毛细管固定器的另一端，并通过三通阀连接细管与注射器。</li>
	<li>转动三通阀至开放位置，推动注射器活塞，使空气从注射器经管道吹入玻璃毛细管，以清除任何污染物并在毛细管内形成正压。</li>
	<li>在最后一次将注射器重新连接至三通阀前，重复数次断开和重新连接注射器的操作，并在每次连接前将注射器抽吸约 100–200 µL（图 1B）。</li>
	<li>将带有玻璃毛细管的显微操作器移至一侧，以避免在小鼠解剖过程中造成损坏。</li>
</ol>
<img alt="光纤拉制装置：显微镜、注射器、用于制备和分析的玻璃纤维。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 显微镜、显微操作器和毛细管装置。（A）配备连接毛细管的显微镜与显微操作器装置，以及（B）连接的注射器和三通阀的特写图像，用于打开（如图所示）或关闭管路，和（C）用于脑脊液采集的完整（右侧）与断裂（左侧）毛细管尖端。断裂后，毛细管尖端的内径应为0.75 mm，外径为1.0 mm。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 小鼠解剖
<ol>
	<li>麻醉小鼠。 
	注意：本实验方案使用了 C57BL/6 和淀粉样前体蛋白/早老素 1（APP/PS1）转基因（阿尔茨海默病小鼠模型）小鼠，并采用 4% 水合氯醛（溶于 dH₂O）进行麻醉。20）在 10 µL/g 通过腹腔注射方式测定小鼠体重。</li>
	<li>当小鼠完全麻醉后，需确保其麻醉程度充分。通过轻度伸展后肢并捏压脚趾，观察是否存在回缩反应，以此确认麻醉是否充分。应捏压全部四只肢体进行检查；若无任何反应，则表明小鼠已处于适当麻醉状态。使用解剖剪刀从小鼠眼睛上方、耳间区域至颈部底部剪除并修整头部背面的毛发。图 2A或者，也可使用电推剪或脱毛膏辅助去除毛发。</li>
	<li>使用小鼠适配器固定小鼠头部（头部背面朝上，鼻部向下倾斜约~ 45 °, 图2A）。将耳杆固定在小鼠的耳朵和眼睛之间并拧紧。确保头部无法移动，并通过轻轻下压小鼠头部确认其在适配器中已牢固固定。</li>
	<li>在进行手术切口前，需重新检查脚趾夹捏的回缩反应，以确认麻醉深度，并在之后定期检查以确保麻醉水平。术中应目视观察呼吸频率的任何变化，以提示麻醉深度的改变。本短时非存活手术可采用清洁但非无菌的技术。使用剪刀和弯头镊子剪开皮肤及第一层肌肉，直至颅底仅剩一层薄肌肉覆盖。 
	注意：在小鼠颈部背部横向剪开皮肤，然后沿两耳和两眼之间的颅骨中线纵向剪开皮肤。随后可将皮肤和组织从枕大池区域分离并拉开。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察，使用镊子小心地剥离颅底上方最表层的薄层肌肉，并将这些肌肉层移至一侧，远离目标区域。若出现出血，可用棉签清除并帮助止血。</li>
	<li>暴露小脑延髓池处的硬脑膜后（呈三角形，通常有1-2条较大的血管穿过该区域；穿刺毛细管插入及脑脊液采集的最佳位置位于血管的任一侧或血管之间）， 图 2B），用湿润的棉签擦拭膜以清洁，然后用干燥的棉签擦干该区域。</li>
</ol>
<img alt="小鼠颅骨成像装置；显微镜图像显示血管观察与分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56774/56774fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠解剖装置及脑脊液采集用毛细管插入的代表性图像。 准备进行脑脊液提取的小鼠装置，其中（A）头部已剃毛并固定，准备解剖；（B）小鼠小脑延髓池硬脑膜的详细图像（10倍视野），虚线箭头显示穿过该区域的血管，实线箭头显示毛细管插入的最佳位置。详细图像（10倍视野）显示：（C）锋利的玻璃毛细管尖端对准小脑延髓池硬脑膜；（D）毛细管即将穿刺硬脑膜的位置，此时硬脑膜产生一定阻力；（E）毛细管尖端轻敲穿过硬脑膜以收集脑脊液。脑脊液应为在玻璃毛细管中收集到的透明液体（点状箭头所示）。每张显微镜图像右下角的比例尺均表示100 µm。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56774/56774fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 从麻醉小鼠收集脑脊液
<ol>
	<li>将玻璃毛细管对准小鼠头部后方，使尖端刚好位于膜后方，呈约 30–45 ° 角（图 2C）。</li>
	<li>快速推注注射器一次或数次，并将注射器回抽约 100–200 µL（以确保无污染物，并使玻璃毛细管内形成负压）。</li>
	<li>使用显微操作器将毛细管尖端缓慢靠近膜，直至观察到阻力，但不刺破膜（图 2D）。</li>
	<li>当毛细管尖端与膜之间出现阻力时，轻敲显微操作器控制装置，轻轻将毛细管敲穿膜。通过显微镜观察，可见毛细管尖端刺入小脑延髓池。一旦穿破开口，脑脊液（CSF）应自动被吸入毛细管内（图 2E）。</li>
	<li>让毛细管缓慢收集脑脊液。若脑脊液停止流出，可缓慢回抽注射器少量体积（约 50 µL），以在毛细管内产生更大的负压，从而继续提取脑脊液。 
	注意：也可使用精细的显微操作器控制装置，缓慢、轻柔地将毛细管从脑组织中抽出，使脑脊液再次流入毛细管。通常收集约 10–15 µL 脑脊液（在毛细管中约 3–4 cm），耗时约 10–30 分钟，偶尔可收集到 20 µL 或更多。虽然并非绝对必要，但建议在脑脊液采集过程中使用加热垫。脑脊液采集在室温（约 23 °C）下进行。</li>
	<li>当收集到所需量的脑脊液后，通过旋转三通阀至关闭位置，关闭管路（以停止继续吸取脑脊液）。</li>
	<li>取下连接管路的注射器，打开后再关闭管路（以使毛细管、管路及毛细管外部区域的压力达到平衡）。重新将注射器连接至三通阀，但不要推注注射器。</li>
	<li>使用显微操作器轻柔地将玻璃毛细管从小鼠体内取出。</li>
	<li>将收集管（含 1 µL 20 倍蛋白酶抑制剂的 1.5 mL 微量离心管）置于玻璃毛细管的尖端下方。</li>
	<li>打开管路并轻柔推注注射器：脑脊液应从毛细管流出并进入收集管。</li>
	<li>采集完成后，立即对脑脊液样本进行短暂离心（使用小型离心机，最大转速脉冲离心 5 秒），使样本与收集管底部的蛋白酶抑制剂充分混合。 
	注意：脑脊液样本可分装后于 -80 °C 保存，用于后续分析。其余小鼠组织可继续解剖，用于获取脑组织和脊髓等其他组织。此时小鼠仍存活，如有需要，也可采集血液。</li>
</ol>

<ol><li>Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+Biomarkers+for+Alzheimer%27s+Disease+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Alzheimers.+Dis%22%5BJournal%5D)">CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis.</a> Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Schoonenboom, N. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+markers+for+differential+dementia+diagnosis+in+a+large+memory+clinic+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort.</a> Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).</li>
<li>Molinuevo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+use+of+cerebrospinal+fluid+biomarker+testing+for+Alzheimer%27s+disease+diagnosis%3A+A+consensus+paper+from+the+Alzheimer%27s+Biomarkers+Standardization+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative.</a> Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).</li>
<li>Fagan, A. M. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/archive/2014/302712/">CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design.</a> Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).</li>
<li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+mouse+cerebrospinal+fluid+by+sheathless+CE-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).</li>
<li>Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+A%CE%B242+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).</li>
<li>Schelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+tau+increase+in+cerebrospinal+fluid+of+APP+transgenic+mice+suggests+downstream+effect+of+BACE1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition.</a> Alzheimer's Dement. , (2016).</li>
<li>You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+blood+contamination+on+the+proteome+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Technique+for+Serial+Collection+of+Cerebrospinal+Fluid+from+the+Cisterna+Magna+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), (2008).</li>
<li>Maia, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+amyloid-%CE%B2+and+Tau+in+the+cerebrospinal+fluid+of+transgenic+mice+overexpressing+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein.</a> Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2(2013).</li>
<li>Oshio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cerebrospinal+fluid+production+and+intracranial+pressure+in+mice+lacking+choroid+plexus+water+channel+Aquaporin-1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1.</a> FASEB J. , (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案详细描述了一种改进现有脑脊液（CSF）采集方法的技术10，旨在最大限度减少血液污染，并实现从小鼠中大量采集脑脊液（平均可获得约 10–15 µL）。在折断毛细管尖端时，其尖端&#160;不宜过小（否则脑脊液提取速度会非常缓慢），也不宜过大（否则无法精细采集脑脊液，且组织可能堵塞毛细管）。进行脑脊液采集区域的解剖时应格外小心：任何出血都应予以止住，并用 dH2O 将玻璃毛细管插入区域的血液清洗干净，以避免样本污染。每只小鼠的解剖结构存在差异，但大多数小鼠在毛细管需插入的区域均有一至两条主要血管穿过。选择正确的插入位置至关重要，若插入位置过于靠近主要血管，则会导致脑脊液被血液污染。如图2所示，应优先选择无血管区域（例如主要血管之间或两侧）进行毛细管插入，以避免污染。若脑脊液未能持续稳定流出并在一段时间后停止，可轻微回抽注射器（约 50 µL）以帮助恢复脑脊液流入毛细管。或者，也可使用显微操作仪缓慢、轻柔地将毛细管略微进出移动，以重新启动脑脊液的提取流程。执行这些操作时必须谨慎，以防血液流入毛细管内。该技术之...

脑脊液（CSF）是神经科学研究中一种有价值的体液，主要用于分析。脑脊液主要由血浆生成，细胞含量极少（无红细胞，仅有少量白细胞），几乎不含蛋白质。它是与中枢神经系统（CNS）密切接触的体液之一，能够将多种电解质从脑和脊髓转运至外周系统。在人类中，可通过腰椎穿刺（又称脊椎穿刺）这一轻微的侵入性操作采集脑脊液样本，用于临床诊断疾病或参与临床试验的研究。由于脑脊液能够反映中枢神经系统的改变，而无需直接获取这些组织，因此近年来在临床研究中，已从阿尔茨海默病及其他类型痴呆等神经退行性疾病患者中获取脑脊液样本1,2,3。目前已有多种基于脑脊液样本开发的生物标志物检测方法，有望辅助临床疾病的诊断2,3。然而，这些检测方法在产生一致且敏感的结果以特异性诊断疾病方面的可靠性仍存在广泛争议4,5。因此，迫切需要开发更优的检测方法和靶点，这些靶点可存在于脑脊液中，以助于建立一种具有更高敏感性和特异性的标准技术，用于诊断神经退行性疾病。鉴于人脑脊液样本在疾病研究中的潜在重要性，在神经科学研究中，从啮齿类动物中采集脑脊液也受到广泛关注。
小鼠是生物医学研究中的重要动物模型，在开展人体临床试验之前，可用于测试潜在的治疗性化合物并进行概念验证研究。然而，由于小鼠体型较小且脑脊液（CSF）位置靠近大脑，获取其脑脊液样本较为困难。目前小鼠脑脊液采集的常规方法是通过延髓池（cisterna magna）取样，即在小脑与延髓背侧表面之间的腔隙进行穿刺。该区域解剖难度较大，且邻近血管，因此在操作过程中容易导致血液细胞污染，增加了样本污染的风险。由于这些技术难点，大多数研究人员仅能获得少量脑脊液用于分析（通常为5–7 µL），而脑脊液样本中混入血液细胞是分析过程中首要关注的问题6,7,8,9。血液污染可能掩盖真实结果，无法准确反映中枢神经系统（CNS）的实际状态。此外，样本量有限也会影响研究的开展，因为从小鼠获取的常规样本量通常仅够进行一次检测（设双复孔或三复孔）的酶联免疫吸附测定（ELISA）。因此，通常需要将多只小鼠的脑脊液样本合并，以获得足够量的样本用于多项检测。建立一种能够大量、无污染地采集小鼠脑脊液的实验方案具有重要意义，将有助于推动基于啮齿类动物的神经科学研究进展。
本方案详细描述了一种从麻醉小鼠中大量（平均10-15 µL）采集脑脊液（CSF）的技术，该方法在现有脑脊液采集技术的基础上进行了改进，以最大程度减少血液污染10。可靠的脑脊液采集方案将有助于开发基于脑脊液的生物标志物检测方法，可用于辅助疾病诊断，并推动对影响中枢神经系统（CNS）疾病机制的研究。

<table><tbody><tr><td>水合氯醛（用作麻醉剂）</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>30037517</td><td>CAS 编号 302-17-0。</td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>66 视界科技</td><td>54002</td><td></td></tr><tr><td>解剖弯头镊</td><td>66 视界科技</td><td>53072</td><td></td></tr><tr><td>解剖直头镊</td><td>66 视界科技</td><td>53070</td><td></td></tr><tr><td>小鼠适配器（带耳杆）</td><td>自制。</td><td>N/A</td><td>World Precision Instruments 公司提供类似设备。</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Meiji Labax</td><td>型号 15381</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器磁力底座</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>型号 P-1000</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 ml）</td><td>Tansoole</td><td>02024692</td><td>适用于 1 ml。</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 ml）</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物 III（无 EDTA）</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>人 A&amp;beta;42 ELISA 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>管道（聚四氟乙烯管）</td><td>World Precision Instruments</td><td>MMP-KIT</td><td>取自显微注射套件，并连接至毛细管固定器和注射器。</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>天根生化科技</td><td>OSE-MC8</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>可从任意日用品商店或药店获取。</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改进的小鼠麻醉状态下脑脊液采集方法

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

脑脊液（CSF）是神经科学研究中一种有价值的体液，因其与中枢神经系统接触最为密切，故可用于分析脑或脊髓的病变状态，而无需直接获取这些组织。然而，在小鼠中，由于延髓池靠近血管，采集脑脊液时常受到血液污染，导致样本质量受限。此外，小鼠脑脊液采集区域解剖难度较大，通常仅能获得少量样本（最多5–7 µL或更少）。本方案详细描述了一种改进现有采集方法的技术，可最大限度减少血液污染，并实现脑脊液的充分采集（平均可采集10–15 µL）。该技术可与其他小鼠组织取材的解剖方法联合使用，因为在脑脊液提取过程中不会影响任何组织。因此，采用该技术后，脑和脊髓未受干扰，保持完整。通过获得更大量且更纯净的脑脊液样本，可对该体液开展更多分析，进一步推动神经科学研究，加深对影响脑和脊髓疾病的理解。

采用此处所述方法（图1 和 图2），毛细管中立即采集的脑脊液应为无色透明（图2E），不得呈粉红色或红色。若毛细管中采集的液体出现粉红至红色，则提示存在血液污染。
作为应用本方法采集的脑脊液样本的一个示例，采用ELISA检测了蛋白质β-淀粉样蛋白（Aβ）的水平。在阿尔茨海默病研究中，通常需要检测脑脊液中Aβ的含量7。脑脊液几乎不含蛋白质。在阿尔茨海默病小鼠模型（APP/PS1小鼠）中，由于这些小鼠过表达人源APP，其脑脊液中人源Aβ42的水平显著升高。通过本方案采集的12月龄小鼠脑脊液样本可观察到这一差异（野生型（WT）小鼠脑脊液中为0 pg/mL，而APP/PS1小鼠脑脊液中为1,303 pg/mL，<st...

本方案描述了一种改进的技术，可用于大量采集无血液污染的脑脊液（CSF）。通过获取更多且更纯净的样本，可利用脑脊液开展更多分析，从而加深对影响脑和脊髓疾病的认知。

脑脊液（CSF）是神经科学研究中一种有价值的体液，是与中枢神经系统最密切接触的液体之一……

本实验的总体目标是改进从小鼠中采集脑脊液的方法，以避免血液污染。该方法提供了一种简便且可靠的脑脊液采集方式，可用于监测神经性疾病的相关生物标志物。该技术的主要优势在于，借助显微操作仪辅助从小鼠采集脑脊液，可显著减少采集过程中血液的污染。首先，将拉制好的玻璃毛细管插入固定在显微操作仪上的毛细管夹持器中。接着，在体视显微镜下观察，使用直镊子折断尖端已拉细的毛细管，使其断裂后的尖端内径约为10至20微米。然后，将一根细管和一个注射器连接到毛细管夹持器的另一端，通过三通阀将细管与注射器连接，并将三通阀切换至开启状态。然后快速推动注射器，排出任何污染物，并在毛细管中产生正压。通过将注射器与三通阀反复断开和连接，重复此操作数次。在最后一次将注射器重新连接至三通阀之前，吸入100至200微升空气。将带有玻璃毛细管的显微操作仪移至一侧，以防止在手术过程中造成损坏。开始手术前，通过轻捏小鼠的四肢并观察其无反应来确认小鼠已完全麻醉。然后使用解剖剪从眼睛上方、两耳之间向后至颈部底部剪除并修剪小鼠头部背面的毛发。使用立体定位仪的小鼠适配器固定小鼠头部。确保小鼠头部无法移动，并通过轻轻下压小鼠头部使其在适配器中牢固固定。使用剪刀和弯头镊子沿小鼠颈部后方剪开皮肤，然后沿两耳和两眼之间的颅骨中线向下剪开。牵拉皮肤和组织，将其从枕大池区域移开。在解剖显微镜下观察，用镊子仔细剥离颅底覆盖的最后几层薄肌层，并将这些肌肉层移至一侧，远离目标区域。一旦暴露枕大池上的硬脑膜，使用湿润的棉签擦拭膜表面以清洁，然后用干燥的棉签将该区域擦干。小脑延髓池呈三角形，有一至两条较大的血管穿过该区域。在血管的任一侧或血管之间进行毛细管插入和脑脊液采集最为理想。暴露小脑延髓池后，使用显微操作器将玻璃毛细管对准小鼠头部后方，使尖端刚好位于膜后方，角度为30至45度。接下来，将注射器快速插入一次或数次，然后将活塞回拉 100 至 200 微升，以确保无污染物且玻璃毛细管内形成负压。随后将毛细管尖端缓慢靠近细胞膜，直至观察到阻力，但不得刺破膜。轻敲显微操作仪的控制装置，使毛细管轻轻震动并穿过细胞膜。一旦刺破开口，脑脊液应自动流入毛细管中。将毛细管保持原位，以缓慢收集脑脊液。如果脑脊液停止流动，可缓慢回抽注射器约50 µL，以在毛细管内产生更大的负压。在10至30分钟内收集10至15微升脑脊液。当收集到所需体积的脑脊液后，通过旋转三通阀使其关闭，并取下连接在管路上的注射器。打开然后关闭管路，以使毛细管、管路及毛细管外部区域的压力达到平衡。然后，在显微操作仪上轻轻将玻璃毛细管从小鼠体内取出之前，重新连接注射器。接着，将含有1 µL 20X蛋白酶抑制剂的收集管置于玻璃毛细管的尖端下方。打开管路，缓慢推动注射器活塞。脑脊液应从毛细管流出并进入收集管中。收集后，短暂离心脑脊液，使样本与收集管底部的蛋白酶抑制剂充分混匀。脑脊液样本可

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Research

科研

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Neuroscience

神经科学

一种改进的麻醉小鼠脑脊液采集方法

阿尔茨海默病（AD）的转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中人脑脊液（CSF）内Aβ或tau蛋白水平变化的机制和原因提供了极佳的机会。本文中，我们展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于对小鼠进行系列脑脊液取样。...

一种在小鼠中通过大池进行脑脊液连续采集的技术

来源：Sweeney, A. M., 等。利用荧光宏观成像技术对完整小鼠颅骨内脑脊液运输进行活体成像。J. Vis. Exp.

利用荧光大体显微镜在小鼠脑内进行脑脊液运输的活体成像

在胚胎早期脑发育过程中，脑室脑脊液（CSF）包绕神经上皮及大脑皮层前体细胞。本文介绍了从不同发育阶段的啮齿类胚胎中分离脑室脑脊液的方法，以研究其生物学功能。此外，我们还展示了大脑皮层组织外植体的分离与培养技术，该技术可在极少量培养基或脑脊液条件下实现外植体的生长。...

从啮齿类动物胚胎中分离脑脊液并用于离体大脑皮层组织外植体研究

经颅光学成像技术能够通过完整颅骨对活体小鼠大脑皮层中的脑脊液运输进行宽场成像。...

利用荧光大体显微镜通过完整小鼠颅骨在体成像脑脊液运输

脑脊液蛋白水平升高可能是血脑屏障改变后血浆蛋白扩散所致，也可能是鞘内合成的结果。本文介绍了一种优化的检测方案，有助于区分这两种情况，并提供对鞘内合成蛋白的定量测量。...

小鼠鞘内合成蛋白质的定量测量

本文介绍了一种提高小鼠脑脊液（CSF）中葡萄糖浓度的详细实验方案。该方法可用于研究高脑脊液葡萄糖水平对小鼠神经退行性病变、认知功能及外周葡萄糖代谢的影响。...

渗透压微型泵植入法用于提高小鼠脑脊液中的葡萄糖浓度

我们描述了一种通过脑电场测量和相关生物标志物——脑血流量，来评估颅外刺激剂量-反应曲线的实验方案。由于该方案涉及将电极侵入性地植入脑内，因此需要实施全身麻醉，并优先选择自主呼吸而非控制性呼吸。...

麻醉小鼠颅外刺激电极的放置及脑血流与颅内电场的测量

该方案展示了对癫痫大鼠进行重复的脑脊液和血液采集，同时并行持续视频脑电图（EEG）监测。这些操作对于探索多种体液分子变化与癫痫发作活动之间的可能关联至关重要。...

在大鼠脑电图记录期间通过尾侧静脉采集脑脊液和血液

成对小脑延髓池纳米注射与激光散斑血流成像联合检测法研究脑血流调节 在体 内

本文介绍了一种评估小鼠脑膜淋巴管（MLVs）的实验方案，脑膜淋巴管在多种神经系统疾病中发挥重要作用。该方案旨在提供一种整合性方法，既能评估示踪剂引流功能，又能对背侧脑膜淋巴管网进行详细的形态学表征。...

综合评估脑膜淋巴管的整合方案：小脑延髓池注射、淋巴结成像、脑膜解剖与全层组织染色

学习使用显微操作仪从麻醉小鼠采集脑脊液的改进方法，通过玻璃毛细管精准穿刺枕骨大池，减少血液污染，提高样本纯度与体积，适用于神经疾病生物标志物分析。

一种改进的小鼠麻醉状态下脑脊液采集方法

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