脑切片神经元树突的双光子钙成像

本实验的总体目标是使用神经元胞体中的全细胞膜片钳记录与树突中的双光子钙成像并行研究神经元树突中响应不同刺激范式的钙升高。这种方法可用于监测小树突状隔室中的钙信号传导，从而可以密切观察突触输入整合过程中树突分支中发生的过程。该技术的主要优点是它能够以高时空分辨率和特异性观察钙信号传导模式。

将小鼠大脑放在含有连续含氧、冷 ACSF 蔗糖的培养皿上。要从提取的大脑中制备海马切片，让大脑冷却约两分钟。然后，将一张滤纸放在装满冰的培养皿上，然后将大脑转移到滤纸上。

然后，将大脑解剖成两个半球。将解剖的半球粘在振动切片机上，然后将其浸入装满冰冷含氧 ACSF-蔗糖的切片托盘中。随后，使用振动切片机冷却器在 1 摄氏度下切片 300 微米厚的切片，或将冰块放在振动切片机托盘周围。

使用画笔，将含有海马体的切片转移到加热至 37 摄氏度的含氧 ACSF 回收浴中。在此步骤中，在激光扫描双光子显微镜的目标下将海马切片转移到浴中。用含氧 ACSF-normal 持续灌注浴。

然后，使用红外微分干涉对比显微镜根据其大小、形状和位置定位感兴趣的细胞。之后，用含有红色荧光团的 ACSF 正常溶液填充刺激移液管。将其降低到切片的顶部，使尖端与感兴趣的细胞位于同一区域。

之后，用贴剂溶液填充贴剂移液器，并将其连接到头部平台。将其设置在切片上，使其尖端位于目标单元格的正上方。随后，将注射器装入三通旋塞阀中，并通过塑料管将其连接到贴片移液器。

将恒定的正压注入贴片移液管中，并保持旋塞阀处于接近位置。接下来，打开 MultiClamp 放大器控制软件模块，然后单击 VC 按钮切换到 Voltage Clamp 模式。打开电生理学 Clampex 数据采集软件以记录电生理信号，然后单击膜测试图标以发出恒定的方压脉冲，以监测移液器电阻的变化。

现在，放下贴片移液管，直到它正好位于目标细胞的顶部。与细胞膜接触后，将旋塞阀转到打开位置以消除压力。然后，使用安装在旋塞阀中的空注射器对贴状移液器施加轻微的负压，直到移液器阻力达到 1 吉欧。

在数据采集软件的 Membrane Test 窗口中，将电池钳制在负 60 毫伏。继续施加负压，直到移液器阻力下降并实现全细胞配置。在 MultiClamp 放大器控制软件模块中，通过单击 IC 按钮将贴片配置设置为电流钳，并记录响应超极化和去极化电流的体细胞注入的膜特性。

等待至少 30 分钟，让单元格填充补丁解决方案中存在的指示剂。要获取图像，请使用红色荧光信号定位感兴趣的树突。通过选择短于 50 微米的近端树突来确保可见的反应，因为 AP 反向传播的效率可能会随着 GABA 能中间神经元的距离而显着下降，并切换到 xt 模式。

使用激光强度控制器，将双光子激光器设置为基线绿色荧光略微可见的最小功率水平，以避免光毒性。随后，在 Clampex 电生理学数据采集软件 Protocol 窗口和图像采集软件中，创建所需持续时间的记录试验，其中包含所需振幅的躯体电流注入。之后，单击 Start Record（开始记录）按钮，并连续采集荧光 1 到 2 秒。

重复图像采集 3 到 10 次。在单次扫描之间至少等待 30 秒，以避免光损伤。要记录电刺激诱导的树突钙瞬变，请使用红色荧光信号定位感兴趣的树突。

将刺激移液管设置在感兴趣的树突上方的切片表面上。将刺激移液管从树突缓慢降低 10 至 15 微米，尽量减少移动以避免干扰全细胞配置。为了可视化突触微结构域在棘神经元中的位置，在图像采集软件中，切换到 xt 模式并沿着感兴趣的树突分支定位线。

在 Protocol （协议） 窗口中，创建触发刺激的录制试验。使用采集软件，沿着枝晶连续扫描 1 到 2 秒。重复采集 3 到 5 次，两次扫描之间等待 30 秒，以防止光损伤。

为了获得有关细胞形态的初步信息并记录刺激移液器的位置，请在红色通道中获取细胞的 Z 堆栈。在 xyz 模式下使用采集软件，设置堆栈上限和下限，以对包括所有过程在内的整个细胞进行成像。然后，将步长设置为 1 微米，并使用 Start Record 按钮启动堆栈采集。

Z 堆栈采集完成后，使用软件中的 Maximum Projection 选项叠加堆栈的所有焦点计划并验证采集质量。然后，慢慢地将补片移液管从切片中缩回。为了固定切片以进行事后形态学鉴定，请使用油漆刷从浴中快速取出切片，并将其放在填充 ACSF 的培养皿中的两张滤纸之间。

用 4% 多聚甲醛溶液替换 ACSF，并将培养皿在 4 摄氏度下放置过夜。在此图中，双光子 Z 堆栈的最大投影显示了一个充满 Alexa-594 的修补中间神经元。白色箭头指向锥体内轴突末端的位置，表明中间神经元是一个篮状细胞。

该图显示了刺激电极所在的树突状分支。虚线显示线扫描的位置。此处的图像说明了红色和绿色通道中的线扫描结果。

刺激时绿色荧光的增加表明该区域的钙浓度升高。可以将图像分箱为更小的段，以便分析响应的分布。这里看到的痕迹显示了在成像试验期间，响应于体细胞水平记录的电刺激而在不同片段中引发的钙瞬变。

钙瞬变的振幅随着与中心热点的距离而减小，表明响应在空间上是局部的。按照这个程序，可以执行其他方法，如电压敏感染料成像或光遗传学，以回答其他问题，如树突状分支内记忆电位的局部变化或特定输入的整合。观看此视频后，您应该对如何使用光生理学技术的组合来监测神经元树突中活动依赖性的钙波动有一个很好的了解，这将有助于探索树突状输入整合和可塑性的复杂性。