基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测量

本定量细胞报告基因检测方法针对γ-分泌酶的总体目标是研究假定的γ-分泌酶调节剂对γ-分泌酶介导的切割反应所产生的差异性影响。该方法有助于回答阿尔茨海默病研究领域中的关键问题，例如发现可用于治疗阿尔茨海默病的新型γ-分泌酶调节剂。该技术的优势在于其具有高效的检测系统，能够便捷地鉴定出γ-分泌酶调节剂。

该技术的应用前景包括通过发现副作用最小的抗阿尔茨海默病（AD）药物，推动阿尔茨海默病的治疗。该方法可揭示γ-分泌酶对底物的选择性，还可应用于其他疾病（如神经母细胞瘤）的研究。

初次使用该方法的研究人员可能在向96孔微孔板中小心移除和添加细胞培养基时遇到困难，因为过度扰动可能会影响最终结果。请按照文本方案中所述，首先准备NG和CG细胞。使用血细胞计数板对NG或CG细胞进行计数。

然后，将细胞以每孔20,000个细胞的密度接种到96孔微孔板中，每孔终体积为200 µL培养基。将微孔板转移至加湿的二氧化碳培养箱中，在37 °C条件下培养过夜。过夜培养后，从每孔中吸除100 µL培养基。

每孔加入含有 2 微克/毫升四环素的生长培养基 100 微升，并分别加入 0.2% 二甲基亚砜、2 微摩尔 CL-387,785、2 微摩尔 DAPT 或其他相关的 ErbB1/ErbB2 抑制剂。将处理后的细胞和微孔板在 37°C 下孵育 24 小时。孵育结束后，从微孔板每孔中移除 150 微升生长培养基。

然后，每孔加入 50 µL 荧光素酶检测试剂。接着，将微孔板转移至化学发光微孔板检测仪中，在室温下孵育 5 分钟。使用化学发光微孔板检测仪中预设的程序检测荧光素酶发出的发光信号。

首先，打开仪器控制软件。然后，从“工具”菜单中选择“发光检测”。在“参数设置”下，选择“无滤光片”作为发射滤光片，勾选“发射光圈”为“正常”，计数时间输入“1”，然后点击“确定”以设置发光读数。

在仪器控制选项卡中，浏览当前可用的实验方案列表，并选择预存的发光检测方案。在实时显示选项卡中，从下拉菜单中定义量程，并选择对数或线性作为显示类型。在温度选项卡中，选择关闭以停止对微孔板加热。

最后，点击“开始”按钮进行发光检测。使用控制软件中嵌入的资源管理器将结果导出为电子表格格式。通过培养基中不含四环素处理的CG或NG细胞来估算背景发光信号。

将CG或NG细胞在含有1微克/毫升四环素的生长培养基中经0.1% DMSO处理后发出的发光信号定义为100%相对γ-分泌酶活性。最后，将CG或NG细胞在含有四环素以及CL-387,785或DAPT的生长培养基中培养后测得的荧光素酶信号，相对于DMSO处理的CG或NG细胞发出的荧光素酶信号进行归一化。此处展示的是在CG细胞中定量检测γ-分泌酶对APP-C99剪切的代表性结果。

细胞在37摄氏度条件下，用1微摩尔的CL-387, 785或DAPT处理24小时，同时加入1微克/毫升的四环素。每孔加入100微升荧光素酶检测试剂后，定量检测由γ-分泌酶介导的C99-GV蛋白水解所产生的发光信号。以仅用溶剂处理的细胞所发出的荧光素酶信号作为100%相对发光量。

此处展示了NG细胞中γ-分泌酶对N-delta-E切割进行定量检测的代表性结果。类似地，细胞在37摄氏度下，用1微摩尔的CL-387,785或DAPT处理24小时，同时加入1微克/毫升的四环素。在每孔加入100微升荧光素酶检测试剂后，定量检测由γ-分泌酶介导的N-delta-E-GV蛋白水解所产生的发光信号。

仅用溶剂处理的细胞所发出的荧光素酶信号被设定为100%相对发光量。掌握该技术后，实际操作时间仅为一至两小时，具体时长取决于待检测化合物的数量。该技术建立后，为阿尔茨海默病领域的研究人员探索γ-分泌酶的遗传和化学调控因子、进而开发阿尔茨海默病的新型治疗手段铺平了道路。