Name: 基于细胞荧光检测平台的γ-分泌介导的淀粉样前体蛋白和缺口裂解的定量测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习基于细胞的荧光素酶报告基因检测γ-分泌酶活性，用于定量分析淀粉样前体蛋白和Notch的裂解。该方法可高效筛选阿尔茨海默病的新型调节剂，为神经退行性疾病治疗研究提供可靠工具。

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作者感谢中国台湾中央研究院细胞与个体生物学研究所核心设施提供的技术支持。本研究由中国台湾科技部（MOST 103-2320-B-001-016-MY3，授予 Y.-F. L.）、生物制药发展转化创新计划——技术支撑平台轴心方案（NP7，授予 Y.-F. L.）以及中央研究院（授予 Y.-F. L.）资助。

1. 测量与APP-C99或NΔE的γ-分泌酶切割相对应的荧光素酶报告信号
注意：有关 CG 和 NG 细胞生成的详细描述，请参见之前发表的文献20,21。
<ol>
	<li>将 NG 或 CG 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种至 96 孔微孔板中，每孔终体积为 200 μL，培养基为含 10% 胎牛血清（FBS）、5 μg/mL 杀稻瘟菌素（blasticidin）和 250 μg/mL 抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）例如，zeocin）和 200 μg/mL 潮霉素B。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>将微孔板转移至加湿的 CO₂ 培养箱中2 培养箱中37 °C过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从每个孔中移除 100 μL 培养基。</li>
	<li>每孔加入100 μL含2 μg/mL四环素的生长培养基，培养基中分别含有0.2%二甲基亚砜（DMSO）、2 μM CL-387,785、2 μM N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）或其他相关的ErbB1/ErbB2抑制剂。</li>
	<li>将处理后的CG或NG细胞在微孔板中于37 °C孵育24 h。</li>
	<li>从微孔板中每孔移除 150 μL 培养基。</li>
	<li>加入50 μL/孔的荧光素酶检测试剂（详见 材料表).</li>
	<li>将微孔板转移至化学发光微孔板读数仪。
	<ol>
		<li>将微孔板置于室温下，轻轻振荡孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定 萤火虫 使用存储在发光微孔板读数仪中的预设程序检测荧光素酶（FL）发出的发光信号。
	<ol>
		<li>打开仪器控制软件（参见 材料表 有关仪器详情）。</li>
		<li>从“工具”菜单中选择“发光测量”。
		<ol>
			<li>在“参数”设置中，选择“无滤光片”作为发射滤光片，勾选“正常”作为发射孔径，输入“1”作为计数时间，然后点击“确定”以设置发光读数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在“仪器控制”选项卡下，浏览活动程序列表，并选择预存的发光检测程序。</li>
		<li>在“实时显示”选项卡中，从下拉列表中定义尺度，并为类型选择“对数”或“线性”。</li>
		<li>在“温度”选项卡中，将“板加热”选择为“关闭”。</li>
		<li>点击“开始”按钮以进行发光读数。</li>
		<li>根据需要，使用控制软件内嵌的“Explorer”将结果导出为电子表格格式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. γ-分泌酶活性的定量分析
<ol>
	<li>将CG或NG细胞在含有1 μg/mL四环素的生长培养基中用0.1% DMSO处理后发出的发光信号定义为100%相对γ-分泌酶活性。
	<ol>
		<li>通过用不含四环素的生长培养基处理CG或NG细胞，估算其背景发光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将CG或NG细胞在含有1 μg/mL四环素以及1 μM CL-387,785或1 μM DAPT的生长培养基中培养后测得的荧光素酶信号，与经DMSO处理的CG或NG细胞的荧光素酶信号（即步骤2.1中定义的100%相对γ-分泌酶活性）进行归一化处理。</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
<li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+strategies+for+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li>
<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
<li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+diversifies+its+portfolio%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li>
<li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18548070">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li>
<li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li>
<li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li>
<li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li>
<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

aducanumab 免疫疗法治疗阿尔茨海默病（AD）的1b期临床试验所取得的积极结果，已明确确立了 Aβ 在 AD 发病机制中的关键作用22，并表明抗 Aβ 策略仍是开发抗 AD 药物的有效途径。本文中，我们描述了基于细胞的检测方法，利用萤火虫荧光素酶报告系统定量分析 γ-分泌酶催化的 APP-C99 和 NΔE 蛋白水解过程。APP-C99 和 NΔE 是目前研究最为深入的两种 γ-分泌酶底物，共同代表了 γ-分泌酶的致病性与生理性活性13。本研究中所述的 γ-分泌酶底物特异性细胞检测方法，进一步证实了我们此前发现的 CL-387,785 通过下调 ErbB2 优先降低 APP-C99 稳态水平及分泌型 Aβ 水平的现象。因此，本实验方案为发现新型 γ-分泌酶调节剂提供了一种高效的方法。
该γ-分泌酶底物特异性检测方法的优势是多方面的。例如，这些底物特异性的γ-分泌酶检测可用于初步筛选，以排除潜在的非选择性γ-分泌酶抑制剂，避免其进入后续开发阶段，并提供与最小化潜在副作用相关的定量评...

淀粉样蛋白-β（Aβ）的寡聚体形式被认为是阿尔茨海默病（AD）患者大脑中神经退行性变的主要原因1。Aβ肽是由淀粉样前体蛋白（APP）经逐步剪切产生的，首先由β-分泌酶剪切，然后由γ-分泌酶剪切2。在过去十年中，针对AD的治疗策略主要集中于抑制Aβ的生成3。大多数研究聚焦于增强α-分泌酶活性（可阻止γ-分泌酶对APP的剪切，从而减少Aβ的生成）或抑制β-和/或γ-分泌酶的活性4。然而，非选择性地抑制β-或γ-分泌酶会干扰这些酶对其他生理底物的正常功能，导致不可避免的副作用5,6。关于γ-分泌酶抑制剂，最近的研究报道发现了若干种化学和遗传调节因子，可在对Notch蛋白的必需γ-分泌酶介导加工过程影响极小的情况下调节Aβ的生成7,8,9,10,11,12，但目前尚未成功开发出有效的治疗药物。因此，有必要进一步开展系统性筛选，以发现能够选择性调节γ-分泌酶介导的APP加工过程的新型遗传和化学修饰因子。
γ-分泌酶已知可切割超过90种不同的膜锚定蛋白。这些底物中包括Notch，其活性在发育过程中对细胞命运决定和分化至关重要。13在不影响Notch剪切的前提下，选择性调控γ-分泌酶催化的APP加工过程，对于最小化γ-分泌酶抑制剂相关的Notch相关副作用至关重要。这种选择性被认为将决定潜在γ-分泌酶调节剂在阿尔茨海默病（AD）慢性治疗中生物疗效的主要因素。已有多种芳基磺酰胺类衍生物，如GSI-953（begacestat）和BMS-708163（avagacestat），被发现可有效且选择性地抑制γ-分泌酶。14,15先前的一项研究已证明，可通过基于定量ELISA的检测方法结合 在体内 使用斑马鱼进行验证16此外，已建立基于细胞的检测方法，以研究γ-分泌酶对APP和Notch的潜在底物选择性。17,18采用与本文所述相似的实验方案，我们近期发现了一类新型的(D)-亮氨酰胺化合物，其可有效调节APP的γ-分泌酶切割，并具有选择性保留Notch功能的特性19综上所述，这一系列研究提供了概念验证，支持γ-分泌酶的底物选择性/可及性可受到化学调控并进行实验验证的观点。然而，这些检测平台通常依赖于通量相对较低的检测方法和劳动密集型的操作流程，可能难以满足工业级药物发现项目的要求。
我们近期开发了基于细胞的荧光素酶报告基因检测方法，可定量测定γ-分泌酶对两种不同底物的催化活性，这两种底物分别为淀粉样前体蛋白（APP）的99个氨基酸组成的C端片段（APP-C99）以及细胞外结构域缺失的Notch肽段（NΔE）。APP-C99和NΔE已被广泛用作多种检测中γ-分泌酶的直接底物。为了建立均一且稳定的针对γ-分泌酶切割APP-C99或NΔE的荧光素酶报告基因检测体系，我们构建了一种来源于HEK细胞的稳定细胞系（CG），该细胞系持续表达由Gal4启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因（Gal4-Luc）以及Gal4/VP16标记的APP-C99融合蛋白（C99-GV）。此外，我们还构建了另一种来源于HEK细胞的稳定细胞系（NG），该细胞系持续表达Gal4-Luc和Gal4/VP16标记的NΔE（NΔE-GV）。利用这些新型的底物特异性γ-分泌酶检测方法，我们现在提供了一种可定量并区分γ-分泌酶对不同底物催化活性的技术（在CG细胞中针对APP-C99，或在NG细胞中针对NΔE）。此外，这些底物特异性的γ-分泌酶检测体系被设计为适用于高内涵筛选平台。这些新建立的γ-分泌酶检测方法有望推动新型γ-分泌酶调节剂的发现，从而在不引发不良Notch信号抑制的前提下抑制Aβ生成，为下一代阿尔茨海默病（AD）治疗中改善认知功能开辟新途径。

<table><tbody><tr><td>VictorLight 发光酶标仪</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>II 级，2 型生物安全柜</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 系列 A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12100046</td><td>生长培养基的主要成分</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素 (Blasticidin)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B (Hygromycin B)</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板 (Hemocytometer)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805 Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>96 孔微孔板</td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>四环素 (Tetracycline)</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo 荧光素酶检测试剂</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>加湿 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>T-REx293 细胞系</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 软件版本 3.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>发光微孔板读板仪的仪器控制软件</td></tr></tbody></table>

基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和notch切割的定量测量

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

我们开发了一对基于细胞的报告基因检测方法，用于定量测量γ-分泌酶对不同底物的切割。本文描述了利用Gal4启动子驱动的萤光素酶报告系统，监测γ-分泌酶介导的APP-C99或Notch切割的实验流程。这些检测方法通过将Gal4驱动的萤光素酶报告基因与APP的C末端片段（APP-C99；CG细胞）或Notch-ΔE（NΔE；NG细胞）分别与Gal4/VP16标签稳定共转染至HEK293细胞中而建立。通过平行使用这两种报告基因检测，我们证明了ErbB2抑制剂CL-387,785可优先抑制CG细胞中APP-C99的γ-分泌酶切割，但对NG细胞中的NΔE切割无此作用。CG细胞与NG细胞在CL-387,785处理下表现出的差异性反应，正是γ-分泌酶调节剂所期望的特征，这与DAPT引起的γ-分泌酶广谱抑制形成鲜明对比。我们的研究为在细胞环境中区分γ-分泌酶对不同底物的活性提供了直接证据。因此，这些新检测方法可能成为药物研发中改进阿尔茨海默病（AD）疗法的有用工具。

CL-387,785 对 ErbB2 的抑制可选择性促进 γ-分泌酶对 APP-C99 的加工，而不影响 Notch 的切割 
为了建立一种能够定量检测特定 γ-分泌酶底物蛋白水解切割的细胞实验体系，我们通过将四环素诱导型C端Gal4/VP16标记的APP-C99与Gal4启动子驱动的萤光素酶报告基因稳定共转染，构建了来源于HEK293的CG细胞系。同时建立了平行的NG细胞系，用于检测γ-分泌酶对NΔE的切割。在NG细胞中，将四环素诱导型C端Gal4/VP16标记的NΔE和Gal4启动子驱动的萤光素酶报告基因稳定共转染至HEK293细胞中。首先通过用不同浓度的DAPT（一种广谱γ-分泌酶抑制剂，可阻断所有γ-分泌酶底物的切割）处理CG和NG细胞，验证了CG细胞中APP-C99以及NG细胞中NΔE的γ-分泌酶依赖性切割（图1）。实验结果还表明，CG细胞和NG细胞中的γ-分泌酶具有相当的催化活性水平。
<p class="jove_content" fo:keep-to...

我们已成功建立了两种底物特异性的γ-分泌酶检测方法。本文介绍的两种基于细胞的检测方法均通过萤火虫荧光素酶报告基因的信号输出来定量γ-分泌酶的酶活性。

基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测量

我们开发了一对基于细胞的报告基因检测方法，用于定量测量γ-分泌酶对不同底物的切割活性。本论文……

本定量细胞报告基因检测方法针对γ-分泌酶的总体目标是研究假定的γ-分泌酶调节剂对γ-分泌酶介导的切割反应所产生的差异性影响。该方法有助于回答阿尔茨海默病研究领域中的关键问题，例如发现可用于治疗阿尔茨海默病的新型γ-分泌酶调节剂。该技术的优势在于其具有高效的检测系统，能够便捷地鉴定出γ-分泌酶调节剂。该技术的应用前景包括通过发现副作用最小的抗阿尔茨海默病（AD）药物，推动阿尔茨海默病的治疗。该方法可揭示γ-分泌酶对底物的选择性，还可应用于其他疾病（如神经母细胞瘤）的研究。初次使用该方法的研究人员可能在向96孔微孔板中小心移除和添加细胞培养基时遇到困难，因为过度扰动可能会影响最终结果。请按照文本方案中所述，首先准备NG和CG细胞。使用血细胞计数板对NG或CG细胞进行计数。然后，将细胞以每孔20,000个细胞的密度接种到96孔微孔板中，每孔终体积为200 µL培养基。将微孔板转移至加湿的二氧化碳培养箱中，在37 °C条件下培养过夜。过夜培养后，从每孔中吸除100 µL培养基。每孔加入含有 2 微克/毫升四环素的生长培养基 100 微升，并分别加入 0.2% 二甲基亚砜、2 微摩尔 CL-387,785、2 微摩尔 DAPT 或其他相关的 ErbB1/ErbB2 抑制剂。将处理后的细胞和微孔板在 37°C 下孵育 24 小时。孵育结束后，从微孔板每孔中移除 150 微升生长培养基。然后，每孔加入 50 µL 荧光素酶检测试剂。接着，将微孔板转移至化学发光微孔板检测仪中，在室温下孵育 5 分钟。使用化学发光微孔板检测仪中预设的程序检测荧光素酶发出的发光信号。首先，打开仪器控制软件。然后，从“工具”菜单中选择“发光检测”。在“参数设置”下，选择“无滤光片”作为发射滤光片，勾选“发射光圈”为“正常”，计数时间输入“1”，然后点击“确定”以设置发光读数。在仪器控制选项卡中，浏览当前可用的实验方案列表，并选择预存的发光检测方案。在实时显示选项卡中，从下拉菜单中定义量程，并选择对数或线性作为显示类型。在温度选项卡中，选择关闭以停止对微孔板加热。最后，点击“开始”按钮进行发光检测。使用控制软件中嵌入的资源管理器将结果导出为电子表格格式。通过培养基中不含四环素处理的CG或NG细胞来估算背景发光信号。将CG或NG细胞在含有1微克/毫升四环素的生长培养基中经0.1% DMSO处理后发出的发光信号定义为100%相对γ-分泌酶活性。最后，将CG或NG细胞在含有四环素以及CL-387,785或DAPT的生长培养基中培养后测得的荧光素酶信号，相对于DMSO处理的CG或NG细胞发出的荧光素酶信号进行归一化。此处展示的是在CG细胞中定量检测γ-分泌酶对APP-C99剪切的代表性结果。细胞在37摄氏度条件下，用1微摩尔的CL-387, 785或DAPT处理24小时，同时加入1微克/毫升的四环素。每孔

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基于细胞荧光检测平台的γ-分泌介导的淀粉样前体蛋白和缺口裂解的定量测定

本视频演示了利用四环素诱导系统在基因改造的人类细胞中测定 γ-分泌酶活性的操作流程。该过程包括用四环素诱导 APP 基因表达，生成淀粉样蛋白-β 肽段，并激活荧光素酶的产生。随后检测荧光素酶与底物反应所产生的生物发光信号，以此反映...

用于测量人细胞中γ-分泌酶活性的荧光素酶检测

实现对细胞过程的系统水平理解是当代细胞生物学的目标。本文介绍了利用全基因组规模的RNA干扰文库，通过多重荧光素酶报告系统检测多种细胞功能终点以研究基因功能的策略。...

一种基于多重荧光素酶的筛选平台用于在培养细胞中研究癌症相关信号转导

蛋白质聚集体（即蛋白毒性种子）在细胞间的转移可能介导了神经退行性疾病病理过程的进展。本文介绍了一种新型的FRET流式细胞术检测方法，可实现对重组或生物样品中种子活性的特异且灵敏的检测。...

利用FRET流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性

本报告介绍了通过蛋白质印迹法或基于荧光的检测方法来测定错误折叠蛋白质降解速率的实验方案。这些方法可应用于其他错误折叠蛋白质的分析，以及高通量筛选。...

细胞中错误折叠蛋白质降解的检测方法

我们介绍了一种定量检测错误折叠蛋白质聚集的方法。本方案详细描述了慢病毒诱导的稳定细胞系构建、自动化共聚焦成像以及蛋白质聚集体的图像分析。作为一个示例性应用，我们研究了小分子在时间和剂量依赖性条件下促进SOD1聚集的作用。...

用于活细胞中 Sod1 突变蛋白聚集体形成高内涵定量的检测方法开发

目前需要使一类新型“孤儿药”——药理学伴侣药物的临床前检测具有可重复性、快速且高效。我们开发了一种简单、高度标准化且用途广泛的基于细胞培养的检测方法，可用于筛选合适的患者以及新的药理学伴侣药物。...

体外酶活性检测用于评估法布里病和庞贝病对药物伴侣治疗的反应性

基于基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）的分子成像可实现对生物样本中多种分析物的同步定位。本文介绍了一种利用MALDI-IMS检测和可视化阿尔茨海默病及脑淀粉样血管病样本脑组织中β淀粉样蛋白的实验方案。...

利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

本方案介绍了一种在细胞环境中评估固有活性较低的单次周转蛋白酶蛋白水解活性的方法。具体而言，该方法应用于评估PCSK9的蛋白水解活性，PCSK9是脂质代谢的关键调控因子，其蛋白水解活性对其最终导致高胆固醇血症的功能至关重要。...

一种高通量荧光素酶检测法用于评估单次作用蛋白酶PCSK9的蛋白水解活性

本方案描述了如何使用与胰岛素相关的海肾荧光素酶作为β细胞胰岛素分泌的替代指标，在中等通量条件下快速、低成本地进行荧光素酶检测。该检测可使用大多数化学发光酶标仪和多通道移液器完成。...

利用共分泌的荧光素酶替代物测量相对胰岛素分泌

本方案介绍了如何通过重组蛋白纯化与泛素链切割实验相结合，来检测与神经发育障碍相关的遗传变异对去泛素化酶活性的影响。...

通过体外泛素链切割实验测定与神经发育障碍相关的去泛素化酶的酶活性

本文描述了一种重建人源γ-分泌酶的酵母系统。该系统可用于鉴定和研究影响酶活性的突变，并可用于筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。利用家族性阿尔茨海默病突变体的功能丧失特性，还可用于筛选γ-分泌酶调节剂（GSMs）。...

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

学习基于细胞的荧光素酶报告基因检测γ-分泌酶活性，用于定量分析淀粉样前体蛋白和Notch的裂解。该方法可高效筛选阿尔茨海默病的新型调节剂，为神经退行性疾病治疗研究提供可靠工具。

基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测量

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