衰减全反射红外光谱和多变量数据分析检测和定量水红血球中恶性疟原虫

该程序的总体目标是利用 ATR-FTIR 光谱与多变量数据分析建立疟疾寄生虫预测回归模型。此方法可以帮助加快护理点诊断，从而帮助改善未来患者的治疗结果。此技术的主要优点是，虽然模型可能需要一些时间来构建，但它具有高度便携性、用户友好性、高度敏感且成本低廉。

虽然这种方法能够对疟原虫进行定量，但也可用于观察对环境变化的表型反应，例如由于抗菌剂引起的寄生虫成分变化。这个想法是在澳大利亚同步加速器对疟疾感染细胞所做的工作中发展起来的。这是单细胞级别。

从那里，我们决定使用 ATR-FTIR 光谱来实际开发诊断测试。在开始同步程序之前，培养30毫升的3D7菌株恶性疟原虫寄生虫，如文本协议中所述。使用自动移液器，重新暂停培养物，并转移到50毫升锥形管。

在标准实验室条件下以 300 至 400 倍 g 离心培养，5 分钟。使用自动移液器将其绘制起来，在不干扰颗粒的情况下将其取出。将废介质丢弃到 10% 漂白剂溶液中。

缓慢地将 4% 的三醇溶液中 12 至 15 毫升添加到颗粒中，通过封顶和反转管来混合培养，直到培养均匀。在37摄氏度下孵育培养15分钟。15分钟后，将培养培养的离心5分钟。

使用自动移液器去除上流液，而不会干扰颗粒。在颗粒中加入 10 至 15 毫升 0.9% 盐水，通过封顶和反转管来混合溶液，直到培养均匀。重复离心和盐水溶液再洗两次，以清除所有桑比托残留物。

要开始这个程序，将库存红血球或RBC离心。取出上流液，用0.9%的盐水洗涤共三次。将库存 RBC 和培养物以 300 到 400 次 g 离心 5 分钟，然后丢弃每个管中的上分。

标注八根微离心管。然后使用 0.2 到 20 微升移液器将适当数量的培养添加到每个管中。接下来，在每个管中加入适当数量的库存RBC，以获得所需的寄生虫稀释。

将抗凝液管中收集的新鲜献血以1，200倍g和标准实验室条件10分钟离心。用移液器将其拉起并丢弃到 10% 漂白溶液中，将其取出。在每个微离心管中加入900个隔离供体RBC微升，通过倒置10次进行彻底混合。

一个简单的台式衰减总反射四红外变换红外仪或 ATR-FTIR 光谱仪将用于获取频谱。使用用超纯水打湿的无绒湿巾准备和清洁晶体，以圆周运动轻轻擦洗晶体。然后，使用另一个无绒擦拭彻底干燥晶体。

单击"背景测量"对空气进行背景测量。每20分钟清洁一次晶体并重复此测量。单击"预览"打开实时视图。

观察一个扁平的水平基线，指示晶体是干净的。直接在晶体中间的移液器 10 微升除水，然后单击测量样本。使用无绒擦拭和柔和的圆形运动干燥晶体。

将 10 微升样品移液到晶体中间，然后单击测量样品。清洁样品之间的晶体。在此演示中，将使用 MATLAB 执行多变量数据分析。

要开始数据处理，请输入分析到命令窗口中以打开图形用户界面。右键单击 X 框以查找导入数据。选择要分析的文件类型。

通过单独选择每个集中的所有光谱，单击"打开"，并给每个集指定一个简短名称，将样本、水和基线光谱作为数据集导入工作场所。单击命令窗口中的新变量，为向量命名"寄生虫"。输入每个样本的寄生虫。

右键单击 X 框以查找绘图数据。单击"绘图数据"图标以绘制数据。单击"缩放"和放大 1，800 至 1，400 厘米，以最清楚地观察到沿阿米德 I 和 AmidE II 波段的斜坡的短、锐、窄峰来检查水蒸气效果的光谱。

在极端水蒸气的情况下，打开"编辑预处理数据"选项卡并选择"平滑"。通过平滑样品和水光谱，减少噪音和/或强水蒸气贡献。在文本协议中描述的进一步数据处理后，打开"编辑数据"选项卡，并在列变量中选择 2980 到 2800/厘米和 1750 到 850/厘米，确保仅勾选其框。

数据现已准备好进行分析。若要执行主组件分析或 PCA，请单击分析分解并选择 PCA。单击生成模型。

在 PC 1 和 PC 2 之间的分数图上观察 95% 置信度限制（虚线环）。使用"选择光谱"工具将样本光谱与超出限制的分数标记为潜在异常值。要执行部分最小平方回归或 PLSR，请单击"分析回归"并选择 PLSR。

右键单击 Y 块并选择向量寄生生成模型。分析回归模型和回归向量，并确定生物带。RBC 的部分最平方回归图在 0% 到 1% 之间尖峰，Parasitemia 生成 R 平方值 0.87，根均方交叉验证误差为 0.13% 寄生。

这演示了模型预测每个样本中的寄生虫的能力，在 x 轴上具有已知的寄生虫，在 y 轴上具有预测的寄生虫。关联的回归系数描述每个波段对模型预测能力的贡献。频带越强烈，对模型的贡献也越大，因此寄生虫如何改变血液的化学成分。

结果表明，来自寄生虫的信号与 RBC 足够不同，可用于形成线性回归模型，用于预测未来数据集中的寄生虫。一旦掌握，如果执行得当，这种技术可能需要不到三分钟的时间。在尝试此过程时，必须记住清洁所有残留物的 ATR 晶体。

按照这个程序，其他疟疾物种，如P vivax和P疟疾可以建模，以回答这样的问题，如，ATR-FTIR光谱是否足够敏感，以区分物种？该技术开发后，为生物光谱学领域的研究人员探索其他血液传播病原体的检测和定量，甚至对葡萄糖和尿素等血液中的检测和定量进行分析铺平了道路。观看此视频后，您应该对 ATR-FTIR 光谱和 NVDA 分析有一个良好的理解，以构建回归模型。

不要忘记，使用患者血液和疟疾样本可能是危险的，在尝试此程序时，应始终进行适当的生物安全级别的培训和遏制。