通过衰减全反射红外光谱法与多元数据分析检测与定量无细胞红细胞中Plasmodium falciparum

本实验的总体目标是利用ATR-FTIR光谱结合多元数据分析，建立用于预测疟疾寄生虫血症的回归模型。该方法有助于加快即时检测诊断的速度，未来可能改善患者的治疗效果。该技术的主要优势在于，尽管模型构建可能需要一定时间，但其具有高度便携性、操作简便、灵敏度高且成本低廉。

尽管该方法可用于疟原虫的定量分析，但也可用于观察表型对环境变化的响应，例如由抗菌剂引起的寄生虫组成变化。这一思路源于我们在澳大利亚同步辐射中心对疟疾感染细胞的研究工作，该研究是在单细胞水平上进行的。

随后，我们决定采用ATR-FTIR光谱法来实际开发诊断检测方法。在开始同步化程序之前，按照文本方案中的描述，培养30毫升的3D7株恶性疟原虫寄生虫。使用自动移液器重悬培养物，并将其转移至50毫升锥形管中。

在标准实验室条件下，以 300 至 400 ×g 离心 5 分钟。使用自动移液器小心吸走上清液，避免扰动沉淀。将废液弃入 10% 次氯酸钠溶液中。

缓慢加入12至15毫升4%山梨醇溶液至沉淀中，盖上管盖并倒置试管，混匀培养物直至均匀。在37°C下孵育培养物15分钟。15分钟后，离心培养物5分钟。

使用自动移液器小心移除上清液，避免扰动沉淀物。向沉淀物中加入10至15毫升0.9%生理盐水，通过盖紧管盖并倒置试管的方式混匀溶液，直至菌液均匀。重复离心及生理盐水洗涤步骤两次，以彻底去除山梨醇的所有残留物。

开始此操作时，先将储备的红细胞（RBCs）进行离心。弃去上清液，并用0.9%生理盐水洗涤，共洗涤三次。将储备红细胞和培养物在300至400 × g条件下离心5分钟，然后弃去每根试管中的上清液。

按照指示标记八个微量离心管。然后使用 0.2 至 20 微升移液器向每根管中加入适量的培养物。接着，向每根管中加入适量的储存红细胞，以获得所需寄生血症稀释度。

将采集在抗凝管中的新鲜供体血液在标准实验室条件下以1,200 × g离心10分钟。用移液器吸除血浆，并弃入10%次氯酸钠溶液中。将900 µL分离的供体红细胞加入每个微量离心管中，通过倒置混匀10次，充分混匀。

将使用一台简单的台式衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪（ATR-FTIR）来采集光谱。使用经超纯水润湿的无尘擦拭布，以环形运动方式轻轻擦拭晶体表面，完成晶体的准备和清洁。然后，换用另一张无尘擦拭布将晶体彻底擦干。

单击“背景测量”以获取空气的背景读数。每20分钟清洁一次晶体，并重复此测量。单击“预览”以打开实时视图。

观察一条平坦、水平的基线，表明晶体表面洁净。用移液器将10微升去离子水直接滴加到晶体中央，然后点击“测量样品”。使用无绒布以轻柔的环形运动擦干晶体。

用移液器将10微升样品滴加到晶体中央，然后点击“测量样品”。在测量不同样品之间需清洁晶体。在本演示中，将使用MATLAB进行多变量数据分析。

开始数据处理时，在命令窗口中输入分析命令以打开图形用户界面。右键单击 X 框以找到导入数据选项。选择要分析的文件类型。

通过分别选择每组中的所有光谱，点击“打开”，并为每组指定一个简短名称，将样品、水和基线光谱作为数据集导入工作区。在命令窗口中点击“新建变量”，并将该向量命名为寄生率。输入每个样品的寄生率。

右键单击 X 框以找到“绘制数据”。单击“绘制数据”图标以绘制数据。通过单击“缩放”并放大至 1,800 到 1,400 厘米⁻¹ 范围，检查光谱中水蒸气的影响，该影响最明显地表现为酰胺 I 和酰胺 II 谱带斜坡上短而尖锐、狭窄的峰。

在水蒸气干扰严重的情况下，打开“编辑预处理数据”选项卡并选择平滑处理。通过对样品光谱和水光谱进行平滑处理，以降低噪声和/或强烈的水蒸气干扰。按照文本方案中所述进一步处理数据后，打开“编辑数据”选项卡，在列变量中仅勾选 2980 至 2800 厘米⁻¹ 和 1750 至 850 厘米⁻¹ 范围。

数据现已准备好进行分析。要执行主成分分析（PCA），请点击分析分解并选择PCA。点击构建模型。

观察主成分1与主成分2得分图中95%置信限（虚线圆环）。使用“选择光谱”工具标记得分位于该限值之外的样本光谱，将其视为潜在的离群值。要执行偏最小二乘回归（PLSR），请单击“分析”菜单中的“回归”，然后选择PLSR。

右键单击 Y 模块，选择向量寄生率构建模型。分析回归模型和回归向量，识别生物学相关波段。对红细胞中寄生率从 0% 到 1% 梯度加标样本生成的偏最小二乘回归图，得到的决定系数（R²）为 0.87，交叉验证的均方根误差为 0.13% 寄生率。

该图展示了模型预测每份样本寄生率的能力，其中横轴为已知寄生率，纵轴为预测寄生率。相关的回归系数描述了每个波段对模型预测能力的贡献程度。波段信号越强，其对模型的贡献越大，从而反映寄生虫如何改变血液的化学成分。

结果显示，寄生虫的信号与红细胞的信号差异足够显著，可用于建立线性回归模型，以预测未来数据集中的寄生虫。一旦掌握，若操作得当，该技术每次样本检测耗时可少于三分钟。在进行此操作时，重要的是务必记得将ATR晶体上的所有残留物彻底清洁干净。

采用该方法后，可对其他疟原虫种类（如 P. vivax 和 P. malariae）进行建模，以回答诸如“ATR-FTIR 光谱法是否足够灵敏以区分不同物种？”之类的问题。该技术建立后，为生物光谱学领域的研究人员探索其他血源性病原体的检测与定量，乃至血液中葡萄糖、尿素等成分的分析开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解 ATR-FTIR 光谱法和 NVDA 分析，并掌握构建回归模型的方法。

请注意，处理患者血液和疟疾样本可能存在危险，进行此操作时必须采取适当的生物安全级别培训和防护措施。