Name: 衰减全反射红外光谱和多变量数据分析检测和定量水红血球中恶性疟原虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学习使用衰减全反射傅里叶变换红外光谱结合多变量数据分析技术，建立回归模型以快速定量检测感染红细胞中的恶性疟原虫。该方法具有高灵敏度、低成本和便携性，适用于疟疾即时诊断，有助于改善患者预后并加速临床决策。

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作者的研究经费由澳大利亚研究理事会（澳大利亚未来奖学金 FT120100926，授予 BRW）、澳大利亚国家健康与医学研究理事会（项目资助和高级研究员奖学金授予 JGB；早期职业研究员奖学金授予 JSR；研究机构基础设施支持计划资助授予伯内特研究所）以及维多利亚州政府运营基础设施支持拨款（授予伯内特研究所）提供。我们感谢 Finlay Shanks 先生提供的仪器支持。

请查阅相应的材料安全数据表（MSDS），并接受适当的生物安全二级（BSL-2）培训。所有培养步骤必须在BSL-2级生物安全柜中采用无菌技术进行操作，这意味着去污过程中存在暴露于有害紫外线辐射的风险，还可能发生针刺伤，若寄生虫培养物进入伤口，则存在潜在的生物暴露和感染风险。此外，血库提供的库存血液仅针对某些疾病进行筛查，因此仍存在传播经血液传播疾病的潜在风险。一旦发生伤害，应立即寻求医疗救助。
1. 3D7 Plasmodium falciparum 寄生虫稀释系列的制备与测定
注意：Plasmodium sp. 培养物极为敏感。应使用新鲜且未过期的试剂，并定期更换培养基以喂养寄生虫。当寄生率低于5%时，每两天喂养一次；寄生率在6–10%之间时，每天喂养一至两次；寄生率在11–20%之间时，每天最多喂养四次。开始饥饿的寄生虫会失去原有形态并发生收缩。一旦出现此情况，应立即更换培养基并添加储备红细胞进行喂养和稀释。采集供体血液时，应使用含肝素作为抗凝剂的采血管，并在采血后6小时内完成测量。
<ol>
	<li>按照标准操作流程培养总共 30 mL 的 3D7 株 Plasmodium falciparum 寄生虫，直至寄生率达到 10% 环状体阶段。</li>
	<li>寄生虫同步化
	<ol>
		<li>在裂殖生殖进入寄生虫生命周期后 11 小时，使用自动移液器重悬培养物，并转移至 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>在标准实验室条件（25°C 和 100 kPa）下，以 300–400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用移液器吸取或连接真空泵的巴斯德吸管小心去除上清液，避免扰动沉淀。将废液弃入含 10% 次氯酸钠溶液中。</li>
		<li>使用自动移液器缓慢向沉淀中加入 12–15 mL 的 4% 山梨醇溶液，盖紧管盖后反复倒置混匀，直至培养物均匀。</li>
		<li>将培养物在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
		<li>在标准实验室条件下，以 300–400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>按步骤 1.2.3 所述方法去除上清液。</li>
		<li>向沉淀中加入 10–15 mL 的 0.9% 生理盐水，盖紧管盖后反复倒置混匀，直至培养物均匀。</li>
		<li>重复步骤 1.2.6–1.2.8 两次，以彻底洗去残留的山梨醇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备寄生率稀释系列
	<ol>
		<li>按照步骤 1.2.6–1.2.9 的方法洗涤储备红细胞（RBCs）。</li>
		<li>在标准实验室条件下，将培养物和储备红细胞以 300–400 × g 离心 5 分钟，按步骤 1.2.3 所述弃去上清液。</li>
		<li>标记微量离心管为 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750% 和 1.000%，并分别使用 0.2–20 µL 移液器加入 0 µL、1 µL、2.5 µL、7.5 µL、10 µL、25 µL、75 µL 和 100 µL 的培养物。</li>
		<li>分别向标记为 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750% 和 1.000% 的离心管中加入 100 µL、99 µL、97.5 µL、92.5 µL、80 µL、75 µL、25 µL 和 0 µL 的储备红细胞。</li>
		<li>将采集于抗凝管中的新鲜供体血液在标准实验室条件下以 1,200 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>按步骤 1.2.3 所述方法用移液器吸除血浆并弃去。</li>
		<li>向每支微量离心管中加入 900 µL 分离得到的红细胞，反复倒置 10 次充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光谱采集
	<ol>
		<li>使用配套的光谱采集程序，点击 &#34;Instrument Set-Up&#34;，并将数据采集参数设置如下：背景扫描次数为 128 次；样品扫描次数为 32 次；分辨率为 8/cm，覆盖仪器的最大样品范围。</li>
		<li>根据制造商建议或过夜预热，设置 ATR-FTIR 光谱仪的温度。</li>
		<li>使用沾有超纯水的无绒擦拭布以轻柔的环形动作擦拭晶体表面进行清洁，随后用另一块无绒擦拭布彻底擦干。</li>
		<li>点击 &#34;Background Measurement&#34; 进行空气背景测量。每 20 分钟，按步骤 1.4.3 清洁晶体并重复此测量。</li>
		<li>点击 &#34;Preview&#34; 打开实时视图，观察是否出现平坦、水平的基线，以确认晶体已清洁干净。</li>
		<li>用移液器将 10 µL 去离子水直接加在晶体中央，点击 &#34;Measure Sample&#34; 进行测量。每测定五个样品后重复一次水样测量。</li>
		<li>使用无绒擦拭布以轻柔的环形动作擦干晶体。</li>
		<li>用移液器加入 10 µL 样品，点击 &#34;Measure Sample&#34; 进行测量。</li>
		<li>每测完一个样品后，按步骤 1.4.3 清洁晶体。</li>
		<li>重复测量直至获得 3 次重复数据，确保样品及重复测量的顺序随机化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多元数据解析（MVDA）
注意：必须对整个数据集进行数据处理，以避免噪声及非生物来源峰的引入。相反，应针对生物学相关区域进行分析：2980-2800/cm 和 1750-850/cm。
<ol>
	<li>数据处理 
	注意：两种软件， 例如， Matlab（下文简称软件1）和The Unscrambler X（下文简称软件2）被用作多变量数据分析（MVDA）的示例软件。软件1能够在不附加图形用户界面（GUI）的情况下执行MVDA。然而，建议购买GUI材料表）。下述关于软件1的操作说明均基于其与市售GUI工具箱配合使用的情况，且示例数据处理脚本已附上。
	<ol>
		<li>打开相应的多变量数据分析软件，点击 &#34;导入数据&#34; 并选择用于分析的文件类型。
		<ol>
			<li>在软件1中输入 &#34;分析&#34; 在命令窗口中输入以打开图形用户界面。右键单击 X 框以查找 &#34;导入数据&#34;.</li>
			<li>在软件2中，单击选项卡 &#34;文件&#34; 找到 &#34;导入&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样品、水和基线光谱作为数据集导入工作区，方法是分别选中每组中的所有光谱，然后点击 &#34;打开&#34; 并为每组分配一个简短的名称， 例如， 用于水光谱数据集的“wat”。</li>
		<li>通过点击选择新表格/矩阵 &#34;新矩阵/向量&#34; 并生成一个 n×1 的向量，其中 n 为样本数量。输入每个样本的寄生率，并将该向量命名为 'Parasitemia'。
		<ol>
			<li>在软件 1 中，单击 &#34;新变量&#34; 在命令窗口中。</li>
			<li>在软件2中，单击图标 &#34;新基质&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>单击以绘制数据 &#34;绘图数据图标&#34;. 通过点击检查光谱中的水蒸气影响 &#34;缩放&#34; 并在1800-1400/cm范围内放大观察；最明显表现为酰胺I带和酰胺II带斜坡上的短而尖锐、狭窄的峰。</li>
		<li>在水蒸气极端情况下，打开编辑/预处理数据选项卡，然后选择 &#34;平滑处理&#34;通过使用最多25个数据点对样品和水的光谱进行平滑处理，或采用水蒸气校正方法，以降低噪声和/或强烈的水蒸气干扰。</li>
		<li>如有必要，在步骤 2.1.4 中相同的“编辑/预处理数据”选项卡下，使用基线校正算法校正非水平基线。</li>
		<li>平均水光谱，并将各行复制到一个与样本数据集等效的 n×m 矩阵中，通过乘以 0.7 将其强度降低至 70%。
		<ol>
			<li>在软件1中，通过在命令窗口输入以下脚本进行操作 &#34;AverageWater = mean(WaterDataset)&#34;然后复制并粘贴行以匹配样本数据集。为降低强度，请输入 &#34;AverageWater70 = AverageWater × 0.70&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从每个样品光谱中减去平均水光谱。
		<ol>
			<li>在软件1中，通过在命令窗口输入以下脚本进行操作 &#34;WaterCorrectedData=SampleDataset-AverageWater70&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>打开编辑/预处理数据选项卡，应用二阶导数函数，然后选择单个标准变量（SNV）函数并对数据进行均值中心化以实现归一化。
		<ol>
			<li>在软件1中，需一次性完成操作。首先选择 &#34;衍生物&#34;，对样本集使用25个点的平滑、3阶多项式以及导数阶数，并应用Savitzky-Golay函数进行处理。然后选择 &#34;单核苷酸变异&#34; 和 &#34;均值中心化&#34;. 点击 &#34;确定/应用&#34;.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>打开编辑/预处理数据选项卡并在 &#34;柱变量&#34;选择 2,980–2,800/cm 和 1,750–850/cm，确保仅勾选这两个范围的复选框。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>主成分分析（PCA）
		<ol>
			<li>点击 &#34;分析 | 分解&#34; 并选择主成分分析（PCA）。
			<ol>
				<li>在软件1中，单击 &#34;构建模型&#34;.</li>
				<li>在软件2中，输入PCA方法。输入最优主成分（PCs）数量——本研究中为7——以及最大迭代次数100，并选择交叉验证作为验证方法。点击 &#34;运行&#34;.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>观察主成分1与主成分2得分图上的95%置信限（虚线圆环）。</li>
			<li>使用以下方法对标记样本光谱中超出限值的得分进行标注，以识别潜在的离群值 &#34;选择光谱工具&#34;.</li>
			<li>如果标记的光谱具有较高的霍特林T2 数值和高Q残差值使其被排除在进一步分析之外。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>偏最小二乘回归（PLS-R）
		<ol>
			<li>点击 &#34;分析 | 回归&#34; 并选择 &#34;PLS-R&#34;.
			<ol>
				<li>在软件1中，右键单击Y模块并选择该向量 &#34;寄生虫血症 | 构建模型&#34;.</li>
				<li>在软件2中输入PLS-R方法，选择向量 &#34;寄生虫血症&#34; 作为 &#34;Y 参考&#34; 以及样本数据集作为 &#34;X 数据集&#34; 并选择交叉验证作为验证方法。点击 &#34;运行&#34;.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>分析回归模型。R2 大于0.80的值以及交叉验证均方根误差（RMSECV）低于0.1%寄生虫血症的模型为可接受模型。</li>
			<li>分析回归向量并识别生物学特征峰。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2016/report/en/">World Malaria Report 2016</a>. , (2016).</li>
<li>Rogers, W. Chapter 105. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRogers%2C+W+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).</li>
<li>White, N. J. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+NJ+%22Manson%27s+Tropical+Infectious+Diseases%22">Manson's Tropical Infectious Diseases</a>. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).</li>
<li>Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+threat%3A+asymptomatic+parasitemia+and+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).</li>
<li>Hanscheid, T., Grobusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+useful+is+PCR+in+the+diagnosis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">How useful is PCR in the diagnosis of malaria.</a> Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).</li>
<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
<li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Malaria+Rapid+Diagnostic+Test+Performance%3A+results+of+WHO+product+testing+of+malaria+RDTs%3A+round+6+%282014-2015%29%22">Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015)</a>. , (2014).</li>
<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PLS-R 模型是一种监督型多元方法，用于寻找预测变量 X（此处为每个波数处的吸光度）与连续变量 Y（此处为寄生虫血症水平）之间的线性关系，即 Y = bX + E。简而言之，该模型将 X 中的变量进行组合，生成一组新的潜在变量（LVs），以捕获 X 中与 Y 相关的方差，并计算一个回归向量（b），将该向量与新的光谱相乘即可估计出 y 值。模型的性能可通过两个指标来评估：R2 值和交叉验证均方根误差（RMSECV）值。前者描述模型的线性程度，反映其稳健性（越接近 1 越好）；当模型的 R2 值低于 0.8 时，必须仔细检查数据中是否存在离群值和噪声数据。RMSECV 值则表示预测过程中的误差大小。应尽可能降低该数值，为此需排除离群值、谨慎处理数据，并确保拥有尽可能多的生物学重复。
因此，获取高质量的数据对于构建模型至关重要。稀释系列的制备尤为关键，具体而言，必须确保每个红细胞（RBC）样品尽可能均匀。通过使用移液器将红细胞上下吸取数次，同时将微量离心管管端轻轻晃动或轻弹5–10次，可避免样品不均一的情况。同理，每次测量后清洁晶体表面以防止...

疟疾是当今世界上最严重的疾病之一；全球超过一半的人口生活在流行地区，面临感染风险，且贫困人群受到的影响尤为严重1,2,3,4问题的很大一部分在于无症状携带者和早期阶段患者，他们作为蚊媒的储存宿主。5，导致在雨季期间出现感染高峰，并使其在社区中持续传播。疟疾由五种 疟原虫 寄生虫，其中最致命的是 P. falciparum 导致该疾病最严重的形式2.
目前，疟疾诊断技术尚不完善。光学显微镜作为当前的金标准，仅能检测到每微升62–88个寄生虫/&#181;L 取决于所使用的方法6此外，由于显微镜检查耗时且对操作技能要求较高，许多地区存在误诊现象 &#62;50%的病例，尤其是低寄生虫血症水平的病例2，这可直接归因于该地区资源的缺乏，并导致抗疟药物的滥用。另外两种主要的诊断方法是快速诊断检测（RDTs），其利用抗体进行检测，以及聚合酶链式反应（PCR）检测，可通过DNA区分并定量寄生虫。目前，RDTs仅能检测 P. falciparum 以及 P. vivax 至少100个寄生虫/&#181;血液中的寄生虫含量较低，导致疾病的一些罕见形态未能得到治疗。7,8 相比之下，PCR 检测可区分并定量不同种类的 疟原虫 在0.0004-5个寄生虫/的灵敏度下&#181;升血液。然而，该方法需要昂贵的试剂、设备和技术技能，因此不适用于现场应用。
一种高灵敏度、可靠且经济实惠的技术对于缩短诊断时间、从而改善患者预后并实现疾病消除至关重要。衰减全反射傅里叶变换（ATR-FTIR）光谱技术为此问题提供了潜在解决方案。先前的研究表明，可在甲醇固定的血膜中检测并定量 P. falciparum，检测限达到 &#60;1 个寄生虫/µL 血液（&#60;0.0002 % 寄生血症）9，该灵敏度可与 PCR 方法相媲美。最近的研究显示，可在水相样品中检测并定量寄生虫，从而省去固定步骤。然而，为获得最佳结果，需充分考虑水蒸气、光谱噪声及数据处理等因素10。
本方案旨在向新用户展示如何获取水相红细胞（RBC）样品中P. falciparum的ATR-FTIR光谱，并建立用于其检测的回归模型10。

<table><tbody><tr><td>供体血液</td><td>-</td><td>-</td><td>必须由受过培训的医疗专业人员采集</td></tr><tr><td>库存血液</td><td>Australian Red Cross</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 恶性疟原虫</td><td>Burnet 研究所</td><td>-</td><td>实验室菌株，相当于野生型</td></tr><tr><td>不含碳酸氢钠的 L-HEPES RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>分装至 50 mL 离心管中，保存于冷冻室</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>使用前必须过滤</td></tr><tr><td>血液采集管（真空采血管）</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>镜油</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液器吸头</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液器吸头</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>自动移液控制器</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R 离心机</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&amp;trade; 310 直热式 CO2 培养箱</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 双目光学显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>购买时需确认 100 倍物镜为油镜</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR 光谱仪，配备 ATR 快速夹具附件</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td><td>购买时务必注明需配备 &quot;Eco-ATR&quot; 附件</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td><td>多元数据分析软件</td></tr><tr><td>The Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>多元数据分析软件</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>Matlab 的图形用户界面工具</td></tr></tbody></table>

通过衰减全反射红外光谱法与多元数据分析检测与定量无细胞红细胞中plasmodium falciparum

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

我们展示了一种利用简易台式衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪（ATR-FTIR）结合多元数据分析（MVDA）对水相红细胞（RBCs）中的寄生虫进行定量与检测的方法。将培养至10% 寄生率的环状期3D7 P. falciparum 寄生虫用于加标新鲜供体分离的红细胞，制备0–1%范围内的系列稀释样本。每个样本取10 µL滴加至ATR金刚石窗口中心，以获取光谱。对样本数据进行处理，以提高信噪比并消除水的干扰贡献，随后应用二阶导数以分辨光谱特征。然后采用两种多元数据分析方法对数据进行分析：首先使用主成分分析（PCA）识别异常值，再通过偏最小二乘回归（PLS-R）建立定量模型。

偏最小二乘回归（PLS-R）图及其相应的回归向量（分别为图1a和1b）表明，寄生虫的信号与红细胞（RBCs）的信号差异足够显著，可用于建立线性回归模型，以预测未来数据集中的寄生虫。
建立了一个稳健的线性偏最小二乘回归（PLS-R）模型，其决定系数（R-squared）为0.87，交叉验证均方根误差（RMSECV）为0.13%寄生率，图1a。寄生率升高主要与核酸特征峰相关，尤其是1042、1083和1226/cm处的峰，分别归属于RNA核糖基团的ν(C=O)、νs(PO4-)和νa(PO4-)，这些构成了回归向量的主要负向部分。这是因为红细胞（RBC）无细胞核，因此核酸是寄生虫存在的强指示标志。此外，1226/cm处...

本文介绍了一种利用衰减全反射红外光谱仪结合多元数据分析，对感染红细胞水相中Plasmodium falciparum进行检测与定量的实验方案。

通过衰减全反射红外光谱法与多元数据分析检测与定量无细胞红细胞中Plasmodium falciparum

我们展示了一种利用简易台式衰减全反射（Attenuated Total ...）技术对悬浮于水相中的红细胞（RBCs）内寄生虫进行定量与检测的方法。

本实验的总体目标是利用ATR-FTIR光谱结合多元数据分析，建立用于预测疟疾寄生虫血症的回归模型。该方法有助于加快即时检测诊断的速度，未来可能改善患者的治疗效果。该技术的主要优势在于，尽管模型构建可能需要一定时间，但其具有高度便携性、操作简便、灵敏度高且成本低廉。尽管该方法可用于疟原虫的定量分析，但也可用于观察表型对环境变化的响应，例如由抗菌剂引起的寄生虫组成变化。这一思路源于我们在澳大利亚同步辐射中心对疟疾感染细胞的研究工作，该研究是在单细胞水平上进行的。随后，我们决定采用ATR-FTIR光谱法来实际开发诊断检测方法。在开始同步化程序之前，按照文本方案中的描述，培养30毫升的3D7株恶性疟原虫寄生虫。使用自动移液器重悬培养物，并将其转移至50毫升锥形管中。在标准实验室条件下，以 300 至 400 ×g 离心 5 分钟。使用自动移液器小心吸走上清液，避免扰动沉淀。将废液弃入 10% 次氯酸钠溶液中。缓慢加入12至15毫升4%山梨醇溶液至沉淀中，盖上管盖并倒置试管，混匀培养物直至均匀。在37°C下孵育培养物15分钟。15分钟后，离心培养物5分钟。使用自动移液器小心移除上清液，避免扰动沉淀物。向沉淀物中加入10至15毫升0.9%生理盐水，通过盖紧管盖并倒置试管的方式混匀溶液，直至菌液均匀。重复离心及生理盐水洗涤步骤两次，以彻底去除山梨醇的所有残留物。开始此操作时，先将储备的红细胞（RBCs）进行离心。弃去上清液，并用0.9%生理盐水洗涤，共洗涤三次。将储备红细胞和培养物在300至400 × g条件下离心5分钟，然后弃去每根试管中的上清液。按照指示标记八个微量离心管。然后使用 0.2 至 20 微升移液器向每根管中加入适量的培养物。接着，向每根管中加入适量的储存红细胞，以获得所需寄生血症稀释度。将采集在抗凝管中的新鲜供体血液在标准实验室条件下以1,200 × g离心10分钟。用移液器吸除血浆，并弃入10%次氯酸钠溶液中。将900 µL分离的供体红细胞加入每个微量离心管中，通过倒置混匀10次，充分混匀。将使用一台简单的台式衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪（ATR-FTIR）来采集光谱。使用经超纯水润湿的无尘擦拭布，以环形运动方式轻轻擦拭晶体表面，完成晶体的准备和清洁。然后，换用另一张无尘擦拭布将晶体彻底擦干。单击“背景测量”以获取空气的背景读数。每20分钟清洁一次晶体，并重复此测量。单击“预览”以打开实时视图。观察一条平坦、水平的基线，表明晶体表面洁净。用移液器将10微升去离子水直接滴加到晶体中央，然后点击“测量样品”。使用无绒布以轻柔的环形运动擦干晶体。用移液器将10微升样品滴加到晶体中央，然后点击“测量样品”。在测量不同样品之间需清洁晶体。在本演示中，将使用MATLAB进行多变量数据分析。开始数据处理时，在命令窗口中输入分析命令以打开图形用户界面。右键单击 X 框以找到导入数据选项。选择要分析的文件类型。通过分别选择每组中的所有光谱，点击“打开”，并为每组指定一个简短名称，将样品、水和基线光谱作为数据集导入工作区。在命令窗口中点击“新建变量”，并将该向量命名为寄生率。输入每个样品的寄生率。右键单击 X 框以找到“绘制数据”。单击“绘制数据”图标以绘制数据。通过单击“缩放”并放大至 1,800 到 1,400 厘米⁻¹ 范围，检查光谱中水蒸气的影响，该影响最明显地表现为酰胺 I 和酰胺 II 谱带斜坡上短而尖锐、狭窄的峰。在水蒸气干扰严重的情况下，打开“编辑预处理数据”选项卡并选择平滑处理。通过对样品光谱和水光谱进行平滑处理，以降低噪声和/或强烈的水蒸气干扰。按照文本方案中所述进一步处理数据后，打开“编辑数据”选项卡，在列变量中仅勾选 2980 至 2800 厘米⁻¹ 和 1750 至 850 厘米⁻¹ 范围。数据现已准备好进行分析。要执行主成分分析（PCA），请点击分析分解并选择PCA。点击构建模型。观察主成分1与主成分2得分图中95%置信限（虚线圆环）。使用“选择光谱”工具标记得分位于该限值之外的样本光谱，将其视为潜在的离群值。要执行偏最小二乘回归（PLSR），请单击“分析”菜单中的“回归”，然后选择PLSR。右键单击 Y 模块，选择向量寄生率构建模型。分析回归模型和回归向量，识别生物学相关波段。对红细胞中寄生率从 0% 到 1% 梯度加标样本生成的偏最小二乘回归图，得到的决定系数（R²）为 0.87，交叉验证的均方根误差为 0.13% 寄生率。该图展示了模型预测每份样本寄生率的能力，其中横轴为已知寄生率，纵轴为预测寄生率。相关的回归系数描述了每个波段对模型预测能力的贡献程度。波段信号越强，其对模型的贡献越大，从而反映寄生虫如何改变血液的化学成分。结果显示，寄生虫的信号与红细胞的信号差异足够显著，可用于建立线性回归模型，以预测未来数据集中的寄生虫。一旦掌握，若操作得当，该技术每次样本检测耗时可少于三分钟。在进行此操作时，重要的是务必记得将ATR晶体上的所有残留物彻底清洁干净。采用该方法后，可对其他疟原虫种类（如 P. vivax 和 P. malariae）进行建模，以回答诸如“ATR-FTIR 光谱法是否足够灵敏以区分不同物种？”之类的问题。该技术建立后，为生物光谱学领域的研究人员探索其他血源性病原体的检测与定量，乃至血液中葡萄糖、尿素等成分的分析开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解 ATR-FTIR 光谱法和 NVDA 分析，并掌握构建回归模型的方法。请注意，处理患者血液和疟疾样本可能存在危险，进行此操作时必须采取适当的生物安全级别培训和防护措施。

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