Name: 报告酶荧光法检测小鼠结核分枝杆菌的影像学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 了解报告酶荧光成像技术在小鼠结核分枝杆菌感染研究中的应用。该方法支持纵向追踪感染进程，评估治疗效果，为结核病病理机制与疫苗开发提供可靠的临床前研究工具。

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动物实验严格按照德克萨斯大学安德森癌症中心机构动物照护与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M University）制定的指南与规定进行。&amp;#38;M 大学。贵机构生物危害安全官员或委员会的审查与批准&#160;可能需要。&#160;
注意：所有操作均需在生物安全三级（BSL3）条件下进行。工作人员必须始终佩戴个人防护装备。所有操作均在生物安全柜（BSC）内完成，所有锐器须丢弃至锐器容器中。在开始工作前和工作结束后，需使用缓冲酚和70%乙醇清洁工作台面和生物安全柜。&#160;通常情况下，涉及结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的操作应在生物安全三级条件下进行，但为了演示和拍摄需要，作者在生物安全二级条件下使用毒力较弱的细菌来展示这些操作流程。
1. 菌株与培养条件
注意：本研究使用结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌株CDC1551，但任何结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌株均可采用相同方法使用。
<ol>
	<li>在M-OADC-TW（含0.5%甘油、10%不含过氧化氢酶的油酸-葡萄糖复合物和0.05%Tween-80的7H9肉汤）培养基中静置培养细菌，37 °C培养至OD600为0.5（约0.2 × 107 CFU）。</li>
	<li>用M-OADC-TW培养基对菌液进行系列10倍稀释（1:10梯度稀释）。将稀释后的菌液（105、106、107、108）分别取三份，接种于选择性7H11平板，用于测定CFU。</li>
	<li>将平板在37 °C培养四周，或直至菌落可准确计数。</li>
	<li>将细菌接种物在8,534 × g离心5分钟，收集菌体沉淀。用10 mL生理盐水（0.9% NaCl）洗涤沉淀一次，再将沉淀重悬于15 mL生理盐水（0.9% NaCl）中。</li>
</ol>
2. 使用麦迪逊腔对小鼠进行气溶胶感染
<ol>
	<li>让小鼠在新环境中适应一周。</li>
	<li>将小鼠放入腔室前称重。</li>
	<li>将三根电源线依次插入电源插座：主腔室电源、真空泵和空气压缩机。</li>
	<li>小心拧开玻璃罐。将玻璃罐移至生物安全柜中，加入悬浮于15 mL生理盐水（0.9% NaCl）中的挑战接种物，使终浓度约为104&#160;- 106 肺组织中的细菌菌落形成单位（CFU）</li>
	<li>在生物安全柜中盖上玻璃罐的盖子。将罐体连接至雾化器装置，并调节垂直的不锈钢管，使下端（进气端）位于罐内液面下方约四分之一英寸处。</li>
	<li>将实验所需的所有动物（腔室最多可容纳90只小鼠）放入腔室，并关闭门上的所有锁扣。</li>
	<li>检查主（房间）空气流量计。确保浮子（小球）中心在左侧刻度上显示的流量约为 50 L/min。</li>
	<li>按下舱室控制面板上的启动按钮。将压缩机空气流量计（左侧较小的流量计）的气流速率调节至刻度显示4 L/min。目视检查以确认攻毒接种物正在被雾化。</li>
	<li>15分钟后，当控制面板前方的红灯亮起且发出声音信号提示运行结束时，按下控制面板右下角的复位按钮以重置计时器。</li>
	<li>按住腔室门上的小型红色按钮以释放真空。</li>
	<li>打开舱门并取出动物，将小鼠放回其笼中。</li>
	<li>取下玻璃雾化器罐，放入密封且防漏的转运容器中。将该容器置于生物安全柜内，并将挑战悬浮液弃置到指定的废弃物容器中。</li>
	<li>将使用过的雾化器罐放入生物危害袋中，密封后运送至高压灭菌器。</li>
	<li>感染程序结束后，用缓冲酚和70%乙醇喷洒培养 chamber 内部，静置10分钟。</li>
	<li>然后，彻底擦拭所有可触及的内部表面。丢弃所有被污染的纸巾。 等等丢弃于生物危害垃圾桶中。对垃圾、废液容器和使用过的雾化瓶进行高压灭菌处理。</li>
	<li>将动物放回饲养室，直至成像时间点。</li>
	<li>成像当天，将动物转移至次级容器中，并送至成像室。</li>
</ol>
3. 动物麻醉
<ol>
	<li>使用定制的气体麻醉系统，以异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>称量位于麻醉机顶部的两个活性炭过滤罐各自的重量。</li>
	<li>如果过滤罐重量比初始重量增加50 g，则更换为新的过滤罐。</li>
	<li>检查蒸发器单元，确保异氟烷的存量足以完成实验操作。</li>
	<li>将鼻罩支架放入成像室中，根据实验所需放置相应数量的鼻罩，并使用鼻罩堵头将剩余开口密封。</li>
	<li>打开高压氧气瓶的氧气供应，并将压力调节至55 psi。</li>
	<li>启动位于麻醉机前方的废气抽吸泵，并将流速设置为8 L/min。</li>
	<li>打开位于麻醉机前方的氧气开关。</li>
	<li>打开麻醉诱导室的气体流量，将气体流速设定为1.5 L/min，随后关闭气体流量。</li>
	<li>打开成像室的气体流量，将气体流速设定为0.25 L/min，随后关闭气体流量。</li>
	<li>打开异氟烷蒸发器，并将浓度设定为2–2.5%。根据实验所用动物的数量和体重，旋转蒸发器上的旋钮调节异氟烷浓度（体重约20 g的小鼠使用2–2.5%；体重300 g的豚鼠使用4%）。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉诱导室中并盖上盖子，然后打开麻醉诱导室的气体流量。</li>
	<li>让小鼠在麻醉诱导室内停留5–10分钟，直至完全麻醉。</li>
	<li>小鼠麻醉后，在其眼部涂抹眼用软膏，以在成像过程中保护眼睛。</li>
	<li>将小鼠置于腹卧位或胸骨卧位&#160;，使其鼻部置于鼻罩中，以便在成像过程中持续维持麻醉状态。</li>
</ol>
4. 报告酶荧光（REF）成像
<ol>
	<li>通过腹腔注射向感染小鼠和对照小鼠注射底物（20 µM，2.5 µL/g 体重）。&#160;小鼠在成像室内处于麻醉状态的时间少于1分钟。&#160;</li>
	<li>启动成像系统。</li>
	<li>点击“初始化”以启动系统。等待温度指示条变为绿色。 
	注意：&#160;成像室包含一个加热平台，用于在成像过程中维持动物的体温。</li>
	<li>在成像采集设置中，选择荧光 | 透射照明用于整体动物，或落射照明用于肺组织，在采集控制面板中选择结构和叠加模式。</li>
	<li>将视野设置为B，用于单只小鼠，灯亮度调至高。</li>
	<li>将曝光时间设为自动，中等 binning，2 - 3&#160;f/光圈值，激发滤光片为745 nm，发射滤光片范围为780 nm至840 nm。</li>
	<li>对于序列设置，单击“Sequence Setup”，选择 9 -&#160;肺部区域的12个透照点。</li>
	<li>单击“采集”以获取图像。</li>
	<li>成像结束后将小鼠放回笼中。</li>
	<li>监测小鼠直至完全恢复，或在实验的指定时间点处死小鼠以定量CFU。成像后采用改良的Karnofsky评分评估小鼠的健康状况。&#160;</li>
</ol>
5. REF 成像分析
<ol>
	<li>打开成像软件。</li>
	<li>通过点击“浏览”图标加载图像文件。</li>
	<li>进行光谱解混时，在工具面板中点击“光谱解混”，然后选择需要解混的光谱，点击“开始解混”。</li>
	<li>进行光学表面重建时，点击“表面形貌”。</li>
	<li>选择方向为背侧，对象为带毛小鼠，点击“生成表面”。</li>
	<li>绘制裁剪图像，并为感兴趣区域设置阈值图像，点击“完成”。</li>
	<li>进行器官配准时，进入“3D光学工具”下拉菜单中的配准选项卡。</li>
	<li>在器官图谱中对感兴趣器官进行配准。</li>
	<li>使用位于“配准工具”面板上的变换工具（开启/关闭），调整器官大小或位置以匹配生成的表面形貌。</li>
	<li>进入荧光断层成像（FLIT）3D重建，选择“分析”选项卡。选择要参与分析的图像，将图像类型设为归一化透射荧光（NTF）效率，点击“开始”。</li>
	<li>在“数据预览”选项卡中勾选“全选”并进行重建。</li>
	<li>进行荧光定量时，进入“感兴趣区域（ROI）工具”，在目标器官上添加ROI立方体，并调整立方体大小以覆盖整个目标器官，点击“测量3D ROI”。</li>
	<li>在ROI测量窗口中，进入“3D ROI测量”，将数据类型设为源体素，测量单位设为 pmolM-1cm-1。</li>
	<li>将FLIT 3D重建分析结果保存和/或导出为图像或数据文件。</li>
</ol>
6. 通过菌落形成单位（CFU）对细菌进行定量
<ol>
	<li>通过腹腔注射 0.1 mL 戊巴比妥钠（390 mg/mL）处死小鼠。</li>
	<li>通过挤压小鼠脚垫检查足底反射，以确认无反射反应。</li>
	<li>使用无菌镊子和剪刀取出小鼠肺组织，并将肺组织在 1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中匀浆。</li>
	<li>用无菌 1×PBS 对肺匀浆液进行 10 倍系列稀释。</li>
	<li>接种时，将相应稀释度的样品各取三份，每份 20 µL，点种于琼脂平板上。</li>
	<li>将平板置于 37 °C 培养箱中孵育，并观察细菌生长情况。</li>
	<li>孵育结束后计数每个点上的菌落数，并根据以下公式校正接种体积和稀释倍数，以 CFU/mL 表示： 
	CFU/mL = (C/V) × M 
	其中 C = 每点菌落数，V = 每平板接种的样品体积（mL），M = 稀释倍数的倒数（即所用稀释度的倒数）。 
	注意：若在稀释度为 10-4、接种样品体积为 0.002 mL 的条件下，某一点上计数到 11 个菌落，则根据公式计算菌落总数为 
	(11/0.02)&#160;× 104 = 5.5 × 106 CFU/mL</li>
</ol>

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在使用成像技术（如REF）时，有一些关键策略可确保生成可靠且一致的数据。光学成像在组织中会产生散射光，这会影响成像的穿透深度，因为难以捕获各个方向发射的光信号。采用近红外荧光染料（NIR）作为REF成像的底物，其激发波长和发射波长位于700–900 nm的近红外窗口（Querange），可显著减少哺乳动物组织对荧光信号的吸收。该定制设计的底物通过一个内酰胺环将NIR荧光染料IRDye 800Cw与淬灭剂IRDye QC-1连接，从而实现基于荧光共振能量转移（FRET）的淬灭机制。IRDye具有优异的组织穿透性和较低的光散射特性，且对哺乳动物无明显毒性作用36，可在24小时内从血液和器官中清除。在底物给药后约4小时，荧光信号开始显著增强，并在给药后6小时达到峰值水平。
细菌感染剂量、感染剂量的施用方式、底物以及感染后成像的时间点，应在开展大规模、复杂的实验之前通过预实验进行标准化。在对大量动物进行成像时，预实验可显著节省时间和成本，因为在开展关键实验前即可优化标准操作流程。在利用透射照明进行整体动物成像后，应测定目标器官/组织中的细菌载量。 离体 使用落射照明进行肺部成像以验证信号来源，并确定其与存在的细菌数量的相关性质量8初步研究将有助于了解该技术的检测阈值、动态范围，并确定成像的最佳实验条件。
与其它荧光和生物发光策略相比，使用REF成像的主要优势在于其高灵敏度以及能够对天然的M. tuberculosis菌株进行成像。REF成像利用一种催化活性强且在所有M. tuberculosis临床分离株及结核分枝杆菌复合群菌株中保守存在的酶BlaC。REF成像的极高灵敏度源于BlaC的快速催化速率，以及宿主细胞对酶切后产生的荧光产物的保留能力。只要底物存在，信号便会持续累积，导致感染细胞和组织内的信号几乎无限地增强。这种相较于其他成像方法更高的灵敏度，使得REF成像能够在体外（in vitro）和体内（in vivo）特异性地检测M. tuberculosis8,23,24,29。
无需基因改造的REF成像可用于细菌检测，使其可直接应用于任何感染模型，包括实验动物8,37或人类临床样本29,38。由于可针对多种酶靶点（如蛋白酶、激酶、脲酶和β-半乳糖苷酶）开发荧光原性底物，而不仅限于BlaC，因此REF可用于检测和成像多种病原体39,40。然而，在选择靶点时需谨慎考虑，以确保其具备适合成像的最佳特性。BlaC是体现此类理想特性的良好模型酶，有助于确保该策略的成功应用。REF成像可即时反映感染期间肺部的细菌负荷量，显著加快结核病发病机制的研究进程，因为传统方法测定细菌数量通常需要三到六周时间；即使对于生长较快的微生物，该方法也能节省大量时间。REF还可用于区分癌瘤与结核病，这是患者结节性病变诊断中的一个关键难题41,42。REF作为一种新型工具，可加速结核病转化成像研究，甚至可应用于人类，有望实现对治疗效果的快速预测。

生长缓慢的速率 M. tuberculosis 是结核病快速诊断的主要障碍1,2,3虽然基于培养的诊断方法需要数周时间才能出结果，但抗酸染色涂片存在诊断局限性4 在儿童中5 且合并感染人类免疫缺陷病毒的患者6,7光学成像技术最近被视为结核病传统诊断方法的一种替代方案8,9荧光和生物发光可用于光学成像 M. tuberculosis 在活体动物中实时10,11,12,13,14,15,16,17,18,19光学成像具有快速、特异性评估感染的优势 M. tuberculosis20,21,22.
我们概述了光学成像的详细步骤 M. tuberculosis 在活体小鼠中使用REF进行检测。该方法具有高度特异性和灵敏度23,24 与其它光学方法类似，该方法比其它结核病（TB）成像方法更经济25，包括计算机断层扫描（CT）26，磁共振成像（MRI）27和氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（F-FDG PET/CT）28. REF 利用定制的荧光或生物发光底物，当这些底物被细菌酶切割后，会产生荧光产物8,29因此，该方法的优势在于无需使用重组分枝杆菌报告菌株30,31FRET底物由一个荧光团和一个淬灭剂组成，两者通过β-内酰胺环连接，该环可被结核分枝杆菌复合群天然组成型表达的BlaC（β-内酰胺酶）水解 分枝杆菌8,32细菌通过REF的催化活性直接产生信号，该催化活性可实现多个数量级的信号放大，从而实现对目标物的高灵敏度检测。 M. tuberculosis.
本研究中使用的REF底物在活体动物中具有优异的组织穿透能力，并因其长波长而降低了背景信号。使用这种长波长底物可实现检测阈值的提升，从而 M. tuberculosis 近100个菌落形成单位（CFU） 体外 和 &#60;小鼠肺部1000 CFU 体内 （整体动物）8,33. REF 可用作痰液、临床样本甚至通过微内镜系统直接在患者体内进行诊断的工具16,32,33,34 由于其高灵敏度和特异性，REF 可应用于任何结核病临床菌株的检测，因为它利用了一种所有菌株均天然产生的细菌酶 BlaC 进行检测。这些特性使 REF 成像技术成为结核病临床前研究中的有力工具，不仅有助于治疗手段和疫苗效果的评估以及发病机制的分析，未来还可能应用于结核病患者的诊断。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>定制合成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>致命性溶液（Fatal Plus solution）</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Middlebrook 肉汤</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Middlebrook 增菌剂</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>孢子杀菌剂（Sporcidin）</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook 琼脂</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>麦迪逊腔室（Madison Chamber）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 气体麻醉系统</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging 软件</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明鼻罩</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;M. tuberculosis&lt;/em&gt; 菌株 CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>雌性 BALB/C 小鼠，5–7 周龄</td><td>杰克逊实验室（Jackson Laboratory）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成像 结核分枝杆菌 在携带报告酶荧光的小鼠中

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

报告酶荧光（REF）利用对目标生物体内特定酶具有选择性的底物，通过荧光或生物发光进行成像或检测。我们采用 BlaC，这是一种由所有结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌株组成型表达的酶。REF 可实现对感染小鼠肺部细菌的快速定量。同一组小鼠可在多个时间点进行成像，显著降低成本，加快细菌计数速度，允许对宿主-病原体相互作用进行新颖的观察，并因每组可轻松维持更多动物而提高统计效能。由于 BlaC 酶报告系统的催化特性，以及所使用的定制荧光共振能量转移（FRET）或荧光底物的高度特异性，REF 具有极高的灵敏度和特异性。REF 无需使用重组菌株，从而确保宿主-病原体相互作用的自然状态。我们描述了使用在 800 nm 处具有最大发射波长的 FRET 底物对结核分枝杆菌（M. tuberculosis）感染进行成像的方法。该底物的波长适用于哺乳动物深层组织的高灵敏度成像。本文将概述通过气溶胶途径使小鼠感染结核分枝杆菌（M. tuberculosis）、小鼠麻醉、REF 底物的给药以及光学成像的操作流程。该方法已成功应用于评估宿主-病原体相互作用以及靶向结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的抗生素疗效。

感染小鼠的REF成像 M. tuberculosis 以及未感染的对照小鼠如图所示 图1A感染小鼠在感染后6周经底物给药后，其肺部产生的荧光信号显著高于对照组（P = 0.0057）。一项典型的用于研究治疗效果的时间进程 M. tuberculosis 使用REF可在感染后第1、2、4、6、15和24周进行成像。肺组织的荧光强度通过落射照明法进行定量分析。图1B）。感染小鼠肺组织中从第2周到第6周持续增强的信号表明，REF能够成功检测到 体内结核分枝杆菌对照小鼠在较晚时间点背景信号的下降图1B）可能归因于小鼠在6周时间内体重和体积的增加，从而降低了激发波长的穿透能力。对感染小鼠体内荧光源的3D FLIT重建 M. tuberculosis 以……表示 图2A在小鼠体内，使用相同的激发光和一系列发射滤光片，在多个透射照明点获取图像序列。这些图像序列随后用于三维荧光寿命断层成像（3D FLIT）重建，以获得动物体内荧光光源的分布。 图2A-D 展示了小鼠肺器官配准的断层成像不同方向（冠状面、矢状面和横断面）。用于评估重建质量的NTF效率图在下文呈现 图2ENTF 可通过使用中性密度滤光片拍摄的额外图像，从透射照明图像中减去背景光泄漏。使用特定激发滤光片拍摄的图像（图2E-测量值）通过使用相同发射滤光片和开放的激发滤光片测得的透射图像进行归一化处理（图2E-模拟) 以获得底物单独产生的信号。在水平方向上，实测与模拟的NTF效率分布曲线相似图2F）和垂直（图2G）图谱的百分比误差接近0%（图2E-%误差) 提供了高质量三维重建的证据，具有更少的伪影以及改善的信号定位和灵敏度。
<img alt="小鼠感染进展的荧光成像与分析；包含比较图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1成像 M. tuberculosis 带有 REF。 （A） 体内 未感染和感染小鼠的成像 M. tuberculosis 在感染后2、4和6周进行检测。颜色条表示荧光信号强度，单位为每秒每平方厘米光子数2 从低（黄色）到高（红色）。(B) 感染小鼠荧光强度的定量分析 M. tuberculosis对照组（黑色）和感染组（红色）的荧光值及其各时间点的标准误差均予以展示。结果的显著性通过学生t检验确定。 t-测试， p 值 &lt;0.05 被视为具有显著性。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="模拟数据与实测数据的肺部光学成像模型；NTF 效率、误差分析图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2小鼠感染后荧光源的3D FLIT重建 M. tuberculosis. 小鼠断层成像在不同方向的表示；A）冠状面，B）矢状面，C）横断面，以及 D）肺器官配准。在肺部用于信号源测量的三维感兴趣区域（ROI）以红色立方体表示。（E）实测与模拟的NTF效率图，用于评估重建质量。实测与模拟NTF效率分布的对比显示，三维重建质量良好（实测与模拟NTF效率相似）。F）水平方向和 G）垂直方向的信号分布曲线，分别表示实测（蓝色）与模拟（红色）的NTF效率曲线。水平与垂直方向的红色条带指示信号源位置。颜色条表示荧光信号强度，单位为每秒每平方厘米光子数2 从低（蓝色）到高（红色）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们描述了利用报告酶荧光（REF）对感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）的小鼠进行光学成像的方法。该方案有助于在结核病发病机制、治疗及疫苗研究的临床前动物模型中，实现对M. tuberculosis的高灵敏度和高特异性检测。

报告酶荧光（Reporter Enzyme Fluorescence, REF）利用对目标生物体中存在的酶具有特异性的底物，通过成像或检测方法进行分析……

本报告酶荧光成像方法的总体目标是促进在结核病发病机制、治疗及疫苗研究的临床前动物模型中，对结核分枝杆菌进行高灵敏度和高特异性的检测。该方法有助于解答结核病领域中的关键问题，包括细菌物种的毒力机制、治疗手段的开发以及疫苗作用机制的理解。因此，该技术的主要优势在于允许对同一组动物在多个时间点进行成像观察。这大大降低了成本，使我们能够研究宿主与病原体之间的相互作用，同时由于可在相同时间内轻松维持更多数量的动物，从而提高了统计效能。首先，在37°C条件下，将任何结核分枝杆菌（M.tuberculosis）在MOADCTW培养基中培养至在600纳米波长下测得的光密度为0.5。所有涉及感染性材料操作的步骤必须在生物安全柜或其他经批准的物理密闭装置内进行。准备就绪后，用相同的培养基对菌液进行1至10倍的一系列稀释。然后将各稀释液分别接种至选择性7H11平板上，每个稀释度设三个重复，以准确测定CFU。将平板在37°C下培养四周，或培养至菌落可准确计数为止，以确定CFU。在进行接种操作前，务必确保生物安全柜的气流速度为每分钟50升。为制备可感染最多90只小鼠的接种物，需在15毫升离心管中量取所需的CFU。通常使用的CFU范围为10,000至100万。然后离心收集细菌。接着用10毫升生理盐水洗涤细菌一次。再将其悬浮于15毫升生理盐水中。然后在生物安全柜中，将接种物加入一个可连接雾化器的玻璃罐内。接着连接雾化器装置，并调节垂直的不锈钢管，使其下端位于悬液弯月面下方约四分之一英寸处。现在将该组件转移至密封防漏的运输容器中，送入接种室。操作时，将已知体重的动物放入已启动的接种舱内。该舱最多可容纳90只小鼠。然后关闭门上的所有锁扣。接下来，使用钢夹连接雾化器。然后按下腔室上的启动按钮，并将气流速率设置为每分钟3至5升。压缩空气的流速约为每平方英寸22至26磅，重要的是应能在腔室内看到接种物的雾化状态。15分钟后，控制面板前方会出现红灯，并伴有声音信号，提示运行结束。随后按下复位按钮以重置计时器。为释放真空，按下腔室门上的小红色按钮。然后打开腔室门，将小鼠放回其饲养笼中。此后，将动物饲养在隔离室内。接下来，将喷雾器瓶和运输容器放回生物安全柜中。在此将剩余的细菌悬液倒入指定的废液容器中。然后将使用过的喷雾器瓶放入生物危害袋中，并密封袋子，以便转运至高压灭菌器。清洁腔室时，将缓冲酚和70%乙醇喷洒在内表面，让这些溶液在表面作用10分钟，然后彻底擦拭干净。将所有擦拭巾丢弃至生物危害垃圾桶中。随后对垃圾桶、废液容器以及使用过的雾化器瓶进行高压灭菌处理。将动物转移至成像室。在此，根据文本方案对动物进行麻醉，并通过腹腔注射注入对比剂。在成像系统软件中初始化系统，待温度指示条变为绿色后继续操作。系统初始化完成后，将小鼠放入成像室。确保其鼻孔位于鼻罩内，以便在成像过程中接收麻醉气体。现在返回计算机，在采集控制面板中选择荧光、透射照明以进行全动物可视化，或落射照明以观察肺组织。对于单只小鼠，将视野设置为 B，灯泡亮度设置为高。曝光参数采用自动曝光时间、中等 binning 模式，F/Stop 设置为 2 或 3。然后将激发滤光片设置为 745 纳米，发射滤光片设置为 780 至 840 纳米。接下来进入序列设置，选择9到12个透射照明点，覆盖目标区域。然后按下采集按钮以获取图像。图像分析详见文本方案。为了分析感染程度，使用戊巴比妥钠处死小鼠。务必检查足底反射，以确认动物已被处死。随后采用标准解剖方法取出肺组织。随后，将肺组织在1 mL PBS中匀浆。然后用PBS对匀浆液进行10倍系列稀释。取稀释后的匀浆液做三复孔涂布，并在37°C培养至菌落可计数。然后使用菌落形成单位（CFU）计数来评估感染的严重程度。小鼠按所述方法进行处理。使用一种REF底物来观察结核分枝杆菌的进展。使用透射照明法对荧光进行定量。在感染小鼠中，荧光信号从第二周到第六周逐渐增强。对照组小鼠信号的轻微下降可归因于六周期间体重和体积的增加。采用相同的激发光源和一系列发射滤光片，通过多个透射照明点对荧光光源进行3D FLIT重建。通过生成NTF效率图以评估重建质量。使用特定激发滤光片获取的图像，经由相同发射滤光片和开放激发滤光片条件下获得的透射图像进行归一化处理。这提供了仅由底物产生的信号。重建过程中的误差几乎可以忽略。从水平和垂直视角检查数据的NTF效率，均显示出高度相关性。因此，该三维重建技术与其他方法相比，伪影更少，信号定位更准确，灵敏度更高。该技术为结核病领域的研究人员探索抗结核分枝杆菌药物的治疗效果奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过气溶胶途径使小鼠感染结核分枝杆菌，并使用REF底物进行后续的光学成像。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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利用生物发光技术在小鼠模型中对细菌感染进行实时成像

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多模态成像是研究小动物模型中细菌定植的一种有价值的方法。本方案概述了用生物发光的鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，并利用融合三维漫射光成像断层扫描与μCT成像技术对细菌定植进行长期监测，从而生成鼠柠檬酸杆菌（C.

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