Name: 大鼠双侧髌腱损伤模型中干细胞治疗的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解大鼠双侧髌腱损伤模型在骨科研究中的应用，该模型使用脐带间充质干细胞球体治疗肌腱缺损。此方法可有效控制个体差异，减少实验动物数量，为评估干细胞疗法促进肌腱愈合的效果提供标准化平台。

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作者谨此感谢苏博士（PhD）对数据进行的统计学分析。作者同时感谢麦克卢尔博士（DVM，PhD DACLAM）在本研究中所采用的麻醉与镇痛管理方案方面提供的专业建议。本项目获得了西海岸健康科学大学研究副校长办公室基金（编号：12678v）以及美国农业部第1433节基金（编号：2090）的资助支持。

本文所述所有方法均已获得西部健康科学大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 从马脐带基质中分离和扩增间充质干细胞
<ol>
	<li>在观察到母马（怀孕）分娩后，无菌地从胎盘中分离脐带，并将脐带置于含1%青霉素-链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4 °C保存并转移至处理场所。</li>
	<li>在50 mL离心管中，用室温下含1% P/S的PBS清洗脐带两次。在150 mm培养皿上将脐带切成约5 cm长的片段，再用含1% P/S的室温PBS在50 mL离心管中清洗两到三次，直至大部分血液被冲洗干净。</li>
	<li>沿纵轴切开脐带以暴露血管。使用镊子和剪刀将脐带中的两条动脉、一条静脉以及尿囊 stalk 移除。用手术刀刮取围绕血管的胶状基质（即华通胶，Wharton's Jelly），收集至150 mm培养皿中，并将其切碎成细小组织块。</li>
	<li>取2–3段脐带片段中的华通胶（约12–15 g）放入50 mL离心管中，加入15 mL含0.1%（w/v）I型胶原酶A的PBS溶液。于37 °C轻柔振荡孵育3–4小时，直至组织完全消化溶解。</li>
	<li>将消化后的组织在300 × g条件下离心15分钟，吸除上清液。用15 mL含1% P/S的室温PBS重悬组织，通过移液混匀后，在150 × g条件下离心5分钟，吸除上清液（洗涤步骤）。重复洗涤两次。</li>
	<li>将洗涤后的细胞用含1% P/S的室温PBS重悬，移液混匀后，经100 µm细胞滤网过滤，随后在150 × g条件下离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>通过混合低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（LG-DMEM）、胎牛血清（FBS）和1% P/S配制培养基（CM）。经滤器过滤灭菌后备用。</li>
	<li>将过滤后的细胞用10 mL预热至37 °C的培养基重悬，移液混匀后转移至25 cm2组织培养瓶中，置于含5% CO2、90%湿度、37.0 °C的培养箱中培养。每3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70–80%，此时进行传代。</li>
	<li>传代时，吸除培养瓶中的培养基，用5 mL室温PBS洗涤两次，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，在37 °C孵育5分钟以使细胞脱落。</li>
	<li>加入6 mL预热至37.0 °C的培养基中和胰蛋白酶/EDTA作用，移液混匀后转移至15 mL离心管中，在150 × g条件下离心5分钟，吸除上清液。将脱落的细胞用1 mL培养基重悬，移液混匀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。以5,000 个细胞/cm2的密度重新接种至25 cm2组织培养瓶中，置于含5% CO2、90%湿度、37.0 °C的培养箱中继续培养。</li>
</ol>
2. 在壳聚糖薄膜上培养脐带间充质干细胞以制备球形体
<ol>
	<li>要配制 100 mL 的 1% (w/v) 壳聚糖溶液，将 1 g 壳聚糖加入 99 mL 去离子水 (dH₂O) 中2O），并用磁力搅拌器充分混匀。</li>
	<li>加入670 µL冰醋酸，继续搅拌直至壳聚糖溶解并变得黏稠。此过程通常需要3–4小时。</li>
	<li>向12孔组织培养板的每个孔中加入500 µL壳聚糖溶液，轻轻摇动培养板，使壳聚糖溶液均匀分布并覆盖孔底全部表面。</li>
	<li>在无盖的情况下，将涂有壳聚糖溶液的培养板置于超净工作台中干燥过夜，持续24小时。干燥后，将形成一层薄膜并附着于培养板表面。</li>
	<li>用1 mL 0.5 N氢氧化钠（NaOH）溶液加入每个孔中以中和壳聚糖膜，室温孵育2小时。吸除各孔中的NaOH溶液，每孔用1 mL去离子水（dH₂O）洗涤2用70%乙醇（EtOH）每孔1 mL洗涤一次，共洗涤三次。</li>
	<li>为灭菌壳聚糖膜，向每个孔中加入1 mL 70% EtOH，在超净台中孵育过夜。次日吸除各孔中残留的EtOH。用1 mL无菌PBS洗涤各孔三次。将壳聚糖膜置于超净台中，不加盖，用紫外光照射过夜以进行灭菌。</li>
	<li>为形成UCM-MSCs类球体，将扩增并传代后的细胞以每平方厘米5,000个细胞的密度接种至每孔中2，并在5% CO₂中孵育2 在90%湿度和37.0 °C条件下。 
	注意：细胞可在低氧或常氧条件下孵育，具体取决于研究者的兴趣。</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术分析表面标志物的表达
<ol>
	<li>单细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>标准培养板
		<ol>
			<li>从每个孔中移除培养基，并用室温的 PBS 洗涤两次。</li>
			<li>向 12 孔板的每孔中加入 500 µL 细胞解离试剂，室温孵育 5–10 分钟以解离细胞。</li>
			<li>孵育后，向每孔中加入 1 mL 染色缓冲液（含 0.5% BSA 的 PBS），通过移液吹打混匀以充分解离细胞。</li>
			<li>将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，以 150 × g 离心 5 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>壳聚糖培养板
		<ol>
			<li>使用带有 1,000 µL 吸头的移液器吸取培养基，收集所有类球体，将收集的培养基转移至 15 mL 圆锥形离心管中。收集完培养基后，向孔中加入 1 mL PBS 洗涤，再将洗涤液转移至同一 15 mL 离心管中。</li>
			<li>以 150 × g 离心类球体 5 分钟，弃去上清液。</li>
			<li>加入 500 µL 细胞解离试剂（例如，accutase），室温孵育 5–10 分钟，使用 1 mL 吸头反复吹打直至类球体完全解离且不可见。</li>
			<li>向单细胞悬液中加入 1 mL 染色缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞洗涤
	<ol>
		<li>弃去离心管中的上清液，将细胞重悬于 3 mL 冷染色缓冲液中。从该步骤起，实验过程中始终将细胞置于冰上。</li>
		<li>以 300 × g 离心 5 分钟（洗涤）。</li>
		<li>洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞染色
	<ol>
		<li>以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞。将 1 × 106 个细胞重悬于 50 µL 封闭缓冲液（含 10% 马血清的 PBS）中，冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入 10 µL 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗体（CD44、CD90、CD105、CD34、主要组织相容性复合体（MHC）II 类分子，或每种抗体对应的同型对照），以及 40 µL 染色缓冲液，避光冰上孵育 1 小时。</li>
		<li>加入 3 mL 冷染色缓冲液混匀，以 300 × g 离心 5 分钟，吸除上清液（洗涤）。</li>
		<li>重复洗涤两次。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 0.5 mL 染色缓冲液中。</li>
		<li>加入 5 µL 7-AAD（活死染料），冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>通过流式细胞仪分析染色后的细胞样本。根据较小的侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC）排除碎片，并通过较低的 7-AAD 摄取量识别活细胞。将 FL1 和 FL2 分别设为纵轴和横轴。使用同型对照在对角线上方设定门控区域，测量该区域内阳性染色细胞的百分比。每个样本至少计数 20,000 个事件（补充图 1）。</li>
		<li>通过门控活细胞并扣除自发荧光，再减去同型对照染色细胞的百分比，计算抗体染色阳性细胞的比例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 大鼠双侧髌腱缺损模型
<ol>
	<li>选择Sprague-Dawley大鼠（成年雄性，4–5月龄，体重350–375 g）。注意本模型所用大鼠的体型相对较大。</li>
	<li>麻醉&#160;使用面罩向大鼠输送含8%七氟烷的100%氧气（流速2 L/min），直至其在诱导室中夹趾反射消失，随后应用人工眼润滑剂。</li>
	<li>以美洛昔康（1 mg/kg）进行肌肉注射，作为预先镇痛。</li>
	<li>将大鼠置于两个装有温水并用布包裹的0.5 L水瓶之间，以维持体温并固定体位，同时防止皮肤损伤。用胶带将每只肢体固定在桌面上。为降低低体温风险，用气泡膜覆盖身体图1).</li>
	<li>通过鼻罩以1 L/min的流量持续给予5%七氟烷与100%氧气的混合气体，维持麻醉；将动物仰卧于水循环加热垫上。</li>
	<li>为避免皮肤损伤，不要修剪手术部位。取而代之的是，在两侧膝关节处涂抹脱毛膏，使用压舌板清除脱毛膏和毛发。</li>
	<li>用氯己定二葡糖酸盐洗液擦洗手术部位，再用70%乙醇冲洗3次。</li>
	<li>使用无菌#15手术刀片，在膝关节的颅内侧从近端向远端方向切开皮肤。切口起始于髌骨水平上方约1 cm处，并延伸至胫骨结节远端约5 mm处。</li>
	<li>用15号手术刀片分离皮下组织，将皮肤牵开以暴露髌韧带。</li>
	<li>使用#15手术刀片，从髌骨远端至胫骨结节处切取髌腱中央三分之一部分（1 mm）。
	<ol>
		<li>将直径为0.99 mm的克氏针沿肌腱对齐，作为模板以标准化每条肢体缺损的大小（图2).</li>
		<li>使用15号手术刀片在克氏针两侧各做一个全层切口，以分离肌腱的中央部分图3）。使用精细虹膜剪在近端和远端切除中央部分（图4).</li>
		<li>在缝合膝关节筋膜前，按照5.5节所述，为相应的治疗组植入凝块（混合细胞悬液和ACP）。使用5-0聚乳酸羟基乙酸共聚物910缝线，以十字缝合方式缝合筋膜，以皮内缝合方式缝合皮肤。图5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在对侧膝关节重复该操作。 
	注意：一个缺损随机分配接受一种处理（在壳聚糖上培养的干细胞或在标准培养板上培养的干细胞），对侧缺损不作处理，作为内部对照。</li>
	<li>术后给予恩诺沙星片剂4片（2 mg/片，口服，每日1次）和美洛昔康片剂1片（2 mg/片，口服，每日1次），连续给药7天。&#160;这些剂量由实验动物兽医推荐，并已获IACUC方案批准。</li>
</ol>
5. 在髌腱缺损部位递送间充质干细胞
<ol>
	<li>在诱导室中，通过面罩给予健康大鼠（未用于建立髌腱缺损）8% 七氟烷与2 L/min的100%氧气混合气体进行麻醉，直至足趾夹捏反射消失。</li>
	<li>通过心脏穿刺从麻醉的Sprague-Dawley大鼠（成年雄性，4–5月龄，体重350–375 g）采集5 mL血液，使用含1 mL酸性枸橼酸葡萄糖溶液（ACD，5:1 v/v）的5 mL注射器（20 G针头）。</li>
	<li>在相同麻醉条件下，通过心脏内注射戊巴比妥（100 mg/kg）实施安乐死，于心脏穿刺采血后进行。</li>
	<li>在室温下以 350 x g 离心 15 分钟。转移上清液，并将等分试样（每份 120 µL）储存于 -20 °C，直至使用。</li>
	<li>立即在……之前 体内 植入前，将上述分装样品解冻，取20 µL与0.5 x 10混合6 使用胰蛋白酶/EDTA从标准培养板上消化脱离MSCs（来自1.9或3.1.2.1），或通过冲洗（使用PBS/培养基）从壳聚糖培养板上收集。</li>
	<li>加入6 µL 10%氯化钙（CaCl₂）溶液2将 100 µL 解冻后的血浆加入 96 孔板的孔中，以激活血浆并诱导血块形成（激活型条件血浆：ACP）。</li>
	<li>将细胞悬液（20 µL）与ACP（100 µL）混合，形成凝块图6将凝块置于关闭股四头肌筋膜前创建的髌腱缺损处（见步骤 4.10.3）。</li>
</ol>
6. 功能性结果
<ol>
	<li>根据大鼠面部表情评分（RGS）37,38 及植入部位肿胀情况，每天两次监测大鼠疼痛迹象。 
	注：已建立一种评分系统（0–6 分），用于评估大鼠的行走功能，该评分基于三项活动：前肢支撑下后肢站立时间（0–3 分）、无辅助后肢站立时间（0–2 分）以及攀爬 17 cm 塑料笼壁的能力（0–1 分）（表 1）。</li>
	<li>在每个时间点的上午和傍晚分别评估大鼠的两项后肢站立活动，以计算平均得分。</li>
	<li>评估大鼠是否能够用双侧后肢成功攀爬至 17 cm 塑料笼壁顶部。</li>
</ol>
7. 髌腱的大体外观与组织病理学
<ol>
	<li>在治疗后7天（评估炎症）或28天（评估组织愈合）时，通过面罩给予8%七氟烷和2 L 100%氧气进行麻醉，随后经心内注射戊巴比妥（100 mg/kg）处死大鼠。</li>
	<li>安乐死后，使用手术刀和剪刀取下髌骨-肌腱-胫骨结节复合体。去除膝关节周围的软组织和韧带，保留髌腱。</li>
	<li>肉眼观察每个标本，检查肌腱的外观及是否存在增厚（图7）。</li>
	<li>在肌腱近端和外侧用5.0聚二氧杂环己酮缝线打外科结以标记标本方向。将每个标本固定于10%中性缓冲福尔马林溶液中，并从每条肌腱中段获取横截面切片（5 µm）。</li>
	<li>按照标准方案，使用苏木精-伊红染色和马松三色染色对切片进行染色。</li>
	<li>观察切片，检测缺损区域内是否存在血肿以及炎症等病理变化。</li>
	<li>采用既往发表的评分系统对切片进行组织学评分，评分依据包括胶原等级、血管生成程度和软骨形成情况（表2）39。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究选择马源细胞，是因为我们最终希望在马匹自然发生的腱病治疗中测试候选方案。实际上，马的肌腱损伤作为人类腱病的天然模型具有吸引力，这是因为马的浅表数字屈肌腱与人类的跟腱在生物学上具有相似性41。根据国际细胞治疗学会推荐的标准，我们选择了细胞表面标志物 CD44、CD90、CD105、CD34 和 MHC II 用于细胞的免疫表型分析42。在最近的一项研究中，无论培养条件如何，eqUCM-MSCs 均表现为 CD44 阳性，CD34 和 MHC II 阴性；在标准条件下培养的细胞还表现为 CD90 和 CD105 阳性，因此符合间充质干细胞（MSCs）在表面标志物表达方面的鉴定标准。此外，本研究首次报道了当 eqUCM-MSCs 在壳聚糖薄膜上培养时可形成细胞球体，这一结果也印证了既往关于人源 MSCs 的研究发现19,20。三维细胞培养技术数十年来已被广泛研究，旨在构建一个类似于生理微环境的培养体系。本研究显示，三维培养条件...

肌腱损伤是跨物种导致显著疼痛和肌肉萎缩的最常见原因之一1。在兽医学中，马的肌腱和韧带损伤尤为受到关注，因为赛马所有损伤中有82%涉及肌肉骨骼系统，其中46%影响肌腱和韧带2,3。瘢痕组织的形成会影响愈合后肌腱的生物力学特性，这也解释了屈肌腱损伤后恢复运动功能的预后较差；在接受保守治疗的马匹中，高达67%在两年内发生再次损伤4。再生医学为这一传统治疗方法难以应对的病症提供了新的替代方案。自体干细胞治疗已取得一些令人鼓舞的结果5,6，但其应用受限于组织采集带来的并发症、细胞处理与重编程导致的治疗延迟，以及患者健康状况（如年龄）对干细胞特性的影响7,8。这些局限性促使人们探索异体干细胞作为即用型治疗手段的可行性。来源于胎儿附属结构的细胞是颇具吸引力的候选来源，因其避免了胚胎干细胞相关的伦理争议及畸胎瘤形成风险。在胎儿附属结构中，脐带基质（UCM），又称华通胶（Wharton's Jelly），资源丰富且易于采集。
无论细胞来源如何，增强干性对于建立同种异体再生医学的细胞库至关重要。从功能角度来看，干性可被定义为细胞自我更新和多向分化的能力。9干细胞特性的证据依赖于增殖与分化实验，以及基因标志物的表达检测 Oct4, Sox2 和 Nanog9一种增强干性的策略是利用生物材料作为空隙填充物和载体，以促进脐带华通胶间充质干细胞（UCM-MSCs）的增殖与分化。该方法避免了通过调控转录因子将成熟细胞重编程为诱导性多能干细胞所带来的担忧。在诸多被考虑作为干细胞载体的生物材料中，壳聚糖因其良好的生物相容性和可降解性而具有吸引力10这种天然氨基多糖是通过甲壳素的碱性脱乙酰化反应形成的，甲壳素是自然界中含量第二丰富的天然多糖，主要作为甲壳类海鲜加工的副产品获得10我们先前研究了间充质干细胞与壳聚糖支架之间的相互作用，观察到球状体的形成11,12,13,14,15,16我们还报道了壳聚糖基质在软骨生成中的优越性12,13,14,15,16,17,18最近，两项独立研究描述了在壳聚糖膜上培养的脂肪组织和胎盘组织来源的间充质干细胞形成球状体的现象。19,20类球体的形成不仅增强了干细胞特性，还提高了干细胞移植后的留存率 体内 植入20.
跨物种肌腱病的高发病率和致病性促使研究人员开发实验模型，以研究肌腱病的病理生理机制，并测试包括干细胞注射在内的新疗法。在马匹中，胶原酶诱导的肌腱炎是利用间充质干细胞（MSCs）进行肌腱修复疗效验证的常用模型21。然而，该方法的应用价值有限，因为注射会引发急性炎症反应，而临床常见的肌腱病通常由慢性过度负荷所致22,23。此外，化学诱导的肌腱病变会触发愈合反应，无法模拟临床病例中常见的愈合障碍过程22,23。已有研究描述通过切除部分指浅屈肌腱作为马匹肌腱炎的手术模型24。最近，还采用了一种微创方法，将创伤性损伤限制于指浅屈肌腱的中央核心区域25。然而，手术模型无法模拟可能导致自然发生肌腱病的疲劳机制，且在损伤程度方面往往缺乏可重复性25。无论采用何种模型，与马匹肌腱病模型相关的高发病率和高成本仍是额外的限制因素，这也说明了为何有必要将啮齿类动物模型作为新型疗法进行体内初步评估的首选方案。
啮齿类动物实验模型的主要优势之一在于其成本较低，并且能够控制个体间的变异性。由于啮齿类动物生长迅速、寿命相对较短，可在多种生理因素方面实现标准化，从而限制变异来源，减少检测差异所需的动物数量。目前建立啮齿类动物肌腱疾病模型的策略主要依赖化学诱导，也可通过手术方式制造部分肌腱缺损。21手术模型可能比化学模型更能模拟天然的肌腱病，但可能导致更高的发病率以及受损肌腱的灾难性断裂。在这方面，大鼠似乎比小鼠更适合作为这类模型，因其体型较大，可制造更大的缺损，从而便于对组织愈合情况进行评估。Sprague-Dawley 大鼠已被用于针对四大主要肌腱群的肌腱病实验研究：肩袖肌腱、屈肌腱、跟腱和髌腱26在这些模型中，涉及髌腱的模型尤其具有吸引力，因为该肌腱尺寸较大且易于获取27髌韧带连接股四头肌与胫骨结节。在此伸肌机制中，髌骨作为一块籽骨，可引导股四头肌的作用力，并界定髌韧带的近端起点。由于髌韧带近端和远端均具有骨性附着点，便于进行生物力学测试。涉及髌韧带的实验模型通常采用单侧手术制造缺损，以对侧未处理的健侧韧带作为对照。28,29最常见的髌腱缺损模型包括从髌骨远端尖部至胫骨结节附着点处切除髌腱中央部分（宽度为1 mm），而对侧髌腱保持完整。结局评估指标包括组织学检查、非破坏性生物力学测试或破坏性生物力学测试、超声成像 离体 荧光成像、大体观察和功能检测28,30,31单侧模型无法在同一只动物体内对拟议的治疗方法与相似损伤的保守治疗进行比较。同样，多种治疗方法之间的比较也需要使用不同的动物。双侧模型可消除个体间差异，并减少研究所需的动物数量32然而，双侧损伤可能增加并发症风险，且双侧跛行可能干扰治疗效果的评估。少数研究简要报道了在大鼠中使用双侧髌腱缺损模型，但其重点在于治疗干预的效果，而非该模型的围手术期管理和并发症情况33,34.
本研究的长期目标是开发一种策略，以提高干细胞特性并 体内 异基因移植用脐带间充质干细胞的存活率。为实现这一目标，我们近期报道了通过在壳聚糖膜上形成球状体并置于低氧环境中培养，可显著增强脐带间充质干细胞的干性35。这些 体外 特性与经条件化处理的脐带间充质干细胞治疗髌腱缺损后生物力学性能的改善相关。根据这些结果，大鼠双侧髌腱缺损模型似乎适用于测试肌腱损伤的候选治疗方法。36本研究的目的是提供详细的实验方案，用于脐带华通胶间充质干细胞（UCM-MSCs）的分离与鉴定、干细胞生物递送系统的制备、双侧髌腱缺损的建立与治疗，以及术后缺损部位组织愈合的恢复与评估。

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>耗材</td></tr><tr><td>胶原酶 IA 型</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>耗材</td></tr><tr><td>DMEM 低糖培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.FS</td><td>耗材</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>耗材</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>耗材</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>耗材</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td>耗材</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>耗材</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>Sigma</td><td>C3646</td><td>耗材</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>耗材</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Hyclone</td><td>SH30574.01</td><td>耗材</td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯管</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠抗马 CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠抗大鼠 CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠抗马 MHC-II (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1085F</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 (FITC) - 同型对照</td><td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体 [SN6] 抗 CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 (FITC) - 同型对照</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>耗材</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 κ (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>耗材</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>耗材</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 流式细胞仪</td><td>BD</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>5 mL 真空采血管</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>耗材</td></tr><tr><td>酸性枸橼酸葡萄糖溶液</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>耗材</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>耗材</td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>耗材</td></tr><tr><td>大鼠</td><td>Charles River</td><td>品系编号：400</td><td>实验动物</td></tr><tr><td>大鼠手术器械包</td><td>Harvard apparatus</td><td>728942</td><td>设备</td></tr><tr><td>15 号手术刀片</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>耗材</td></tr><tr><td>大鼠用 Baytril（2 mg/片），&lt;br/&gt; Rimadyl（2 mg/片）</td><td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>耗材</td></tr><tr><td>聚乙醇酸 910，5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>耗材</td></tr><tr><td>伊红醇溶液（Shandon）</td><td>Thermo scientific</td><td>6766007</td><td>耗材</td></tr><tr><td>哈里斯苏木精</td><td>Thermo scientific</td><td>143907</td><td>耗材</td></tr></tbody></table>

大鼠双侧髌腱损伤模型中干细胞疗法的评估

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

再生医学为传统治疗方法难以应对的疾病提供了新的替代方案。跨物种肌腱病的高发病率和致残性，加之该组织自身有限的愈合能力，促使人们探索细胞治疗策略，并推动了用于评估其疗效的实验模型的发展。脐带基质来源的间充质干细胞（UCM-MSC）是极具吸引力的候选细胞，因其来源丰富、易于采集、避免了伦理争议和畸胎瘤形成风险，且相较于成体组织来源的间充质干细胞，更接近原始胚胎干细胞。壳聚糖通过促进间充质干细胞形成球状体以增强其生物学特性，已引起广泛关注。本文详细描述了分离UCM-MSC、在壳聚糖膜上制备细胞球状体以及分析球状体形成对表面标志物表达影响的技术方法。随后，介绍了建立大鼠双侧髌腱损伤模型的方法，用于 体内 在壳聚糖膜上形成的脐带间充质干细胞球体的植入。研究中未观察到与发病率、应激升高效应或组织感染相关的并发症。术后7天，手术大鼠的总功能评分低于正常大鼠，但在术后28天恢复至正常水平。组织愈合的组织学评分显示，术后7天治疗缺损处存在血凝块，无异物反应；术后28天显示愈合进展良好。该双侧髌腱缺损模型通过在每只大鼠体内建立内部对照，控制了个体间差异，具有可接受的发病率，并能够检测未治疗肌腱与不同治疗之间的差异。

本研究中，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。细胞来源于6匹母马的脐带，采用Friedman检验（一种用于重复测量的非参数方差分析）比较标准培养条件与壳聚糖诱导条件下各细胞系表达每种细胞表面标志物的百分比。为建立肌腱缺损模型，术后7天评估使用8只大鼠，术后28天评估使用12只大鼠。功能学结果以均值 ± 均值标准误（SEM）表示，并采用t检验进行比较。选择脐带基质（UCM）作为细胞来源，因其来源丰富、采集方便，且增殖能力优于其他胎儿附属组织来源40。在标准培养皿中培养的UCM来源细胞在整个扩增过程中保持成纤维细胞样形态。当在壳聚糖培养皿中培养时，细胞形成球状体（图8）。
在标准培养条件下，大多数细胞表达CD44（98.6 ± 1.62%）、CD90（88.7 ± 3.04%）和CD105（77.9 ± 6.84%），而CD34（0.07 ± 0.1...

本文描述了利用大鼠双侧髌腱缺损模型制备并评估脐带基质来源的间充质干细胞球体的方法。该模型具有可接受的发病率，并能够检测未治疗与治疗肌腱之间的差异，以及所测试的两种治疗方法之间的差异。

再生医学为传统治疗方法难以应对的疾病提供了新的替代方案。肌腱病的发病率和致残率在……

该双侧大鼠模型的总体目标是优化动物的使用，并评估用于治疗肌腱缺损的候选疗法。该方法有助于解答骨科领域的关键问题，例如细胞疗法在肌腱病中的疗效评估。该模型的主要优势在于能够控制个体间的差异，从而减少检测不同处理之间差异所需的动物数量。对该模型进行可视化演示至关重要，因为双侧标准化髌腱缺损的建立在大鼠中较难掌握。该模型要求操作者熟悉局部解剖结构，具备扎实的基础外科技能，并在处理微小结构时保持高度精确性。首先，将收获的马脐带置于含有抗生素的室温磷酸盐缓冲液（PBS）中，在50毫升离心管内清洗两次。接着，将组织转移至150毫米培养皿中，并将其切成约两英寸长的片段。然后将这些片段转移至50毫升离心管中，用含抗生素的PBS清洗，以去除血液。在室温下重复此操作两到三次。接下来，沿脐带纵向切开其碎片部分，以暴露贯穿其长度的血管。使用镊子和剪刀去除这些血管，其中包括两条动脉和一条静脉。现在，从两到三个组织碎片中收集血管周围的胶状基质，用手术刀将其刮下，然后将这种胶状基质（也称为华通胶）切成细小碎片。接下来，将凝胶转移至含有15毫升含0.1% I型胶原酶A的PBS溶液的50毫升离心管中，在37摄氏度下轻轻振荡孵育3至4小时，直至组织完全溶解。随后，离心消化后的组织，并吸除上清液。然后，将消化后的组织重悬于15毫升PBS中，通过移液混匀。然后，用 PBS 以较慢的离心速度重复洗涤三次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于 15 毫升 PBS 中，接着使用 100 微米细胞筛过滤细胞，并在 150 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。将细胞重悬于 10 毫升新鲜配制的培养基中，于 37 °C 条件下培养。将悬液转移至25平方厘米的培养瓶中，培养细胞，并每隔三天更换一次培养基。当细胞融合度达到70%至80%时进行传代：吸除培养基，用不含抗生素的室温PBS洗涤细胞两次，然后加入3毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞使其脱落。加入6 mL温热培养基终止反应。收集悬浮细胞并离心成团。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于1 mL培养基中。为完成传代，以每平方厘米5,000个细胞的密度重新接种组织培养瓶，并继续培养。首先，配制新鲜的壳聚糖溶液，然后向12孔板的每个孔中加入500微升溶液。轻轻晃动培养板，使溶液均匀覆盖所有表面。随后，在超净工作台中将培养板干燥。16至24小时后，培养板孔内将形成一层壳聚糖薄膜。向每个孔中加入一毫升 0.5 N 氢氧化钠以中和该薄膜。然后在室温下孵育平板两小时。随后，吸出各孔中的氢氧化钠，再用一毫升蒸馏水洗涤每个孔。进行三次水洗，然后每孔加入一毫升70%乙醇洗涤一次。去除乙醇洗涤液后，每孔更换为另一毫升70%乙醇，并将培养板置于超净工作台中过夜孵育，以灭菌壳聚糖膜。次日，吸去每孔中残留的乙醇，再用PBS洗涤每孔三次。移除 PBS，然后将壳聚糖膜在无盖条件下直接暴露于紫外光下过夜，以进一步灭菌。接下来，为了形成脐带来源的间充质干细胞球体，在孔中接种 20,000 个细胞，并将培养板置于正常或低氧条件下孵育。将麻醉后的大鼠置于两个装有温水的 0.5 升瓶子之间，并用布覆盖瓶子，以保持大鼠体温，同时避免皮肤损伤。为降低低体温风险，用气泡膜覆盖身体。接下来，为避免皮肤损伤，在两侧股膝部涂抹脱毛膏，并使用压舌板清除脱毛膏和毛发。然后，将每个肢体用胶带固定在实验台上。现在，用氯己定二葡糖酸盐擦拭手术部位，并用70%乙醇冲洗。重复此步骤三次，然后进行手术。使用无菌的15号手术刀，在膝关节前内侧从近端向远端方向切开皮肤。从髌骨水平近端约一厘米处开始切口，向下延伸至胫骨结节处，长度约为五毫米。接着，用手术刀游离下方的皮下组织，并将皮肤翻开以暴露髌腱。然后，将一根直径为0.99毫米的克氏针沿髌腱方向放置，位置从髌骨远端至胫骨结节之间。然后，在保持钢丝稳定的同时，使用手术刀在钢丝两侧做切口，释放出一段约一毫米宽的肌腱。接着使用精细虹膜剪从近端和远端切除中央部分。同时，让助手准备血凝块。为此，将血浆样本解冻，并取 20 微升与五十万个间充质干细胞混合。接着，在微量离心管中，将 6 微升 10% 氯化钙与 100 微升解冻后的血浆混合，以激活该血浆。然后，将细胞悬液加入激活的血浆中，这将导致血浆凝固。现在，将制备好的凝块置入髌腱缺损处。操作凝块时应尽量轻柔，以减少凝块内液体的释放。随后，使用5-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物910缝线，以十字交叉方式仔细缝合筋膜，注意避免干扰凝块。最后采用皮内缝合模式闭合皮肤。细胞从六匹母马的脐带中分离，并在标准条件或壳聚糖膜上进行培养。在壳聚糖上培养的细胞形成了球状体。在多只大鼠中测试了髌腱缺损模型，并采用一系列行为学测试来评估恢复情况。术后28天时，大鼠的肌力已恢复至基线水平，而在术后7天时曾观察到肌力出现初期下降。通过Masson三色染色进行组织学检查发现，存在中度的动脉和毛细血管浸润，以及中度至广泛的胶原形成，但未见软骨形成。 总体而言，双侧髌腱缺损模型在不引起显著病态的情况下限制了个体间的差异，从而减少了测试所需的动物数量。观看本视频后，您应能充分了解如何建立大鼠双侧髌腱窗型缺损模型，以及大鼠术后恢复的过程。一旦掌握，该操作可在三名研究人员的协作下于30分钟内完成。第一名研究人员负责细胞准备，第二名执行手术，第三名协助手术并监测麻醉状态。完成该操作后，可采用生物力学测试、组织学及免疫组织化学等方法，以比较不同治疗对肌腱愈合的影响。

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