邻苯二甲酸酯结合 DNA 核酸适体的选择、表征及其在电化学 Aptasensor 中的应用
March 21st, 2018
本文提出了一种体外的协议, 用于对组特定邻苯二甲酸酯结合 DNA 适配子的筛选和表征。在电化学 aptasensor 中也包括了所选核酸适体的应用。
该程序的总体目标是选择高度疏水性小分子的组特异性 DNA 适配体，并使用选定的适配体开发灵敏的电化学生物传感器。该方法可以帮助回答适配体选择领域中的关键问题，即当靶标是高度疏水分子时如何选择和表征组特异性适配体。虽然这种方法最有用的部分是开发电化学生物传感器，用于检测标题。
这些生物传感器也应该适用于我们的适配体亲和力测量。开始反应时，向纯化的适配体 PCR 产物中加入 100 μL 不含 RNase 的水。涡旋混合物，直到沉淀物溶解。
Lambda 核酸外切酶反应对盐浓度敏感，是一种应通过乙醇沉淀增殖的产物，但另一种异丙醇。将 5 微升适配体溶液、11 微升不含 Rnase 的水和 2 微升 10x 反应缓冲液放入五个微量离心管中。将 2 微升不含 Rnase 的水以及 2、5、8 和 10 单位的 lambda 核酸外切酶溶于不含 Rnase 的水中的溶液加入到一根试管中。
轻轻移液充分混合。将试管在 37 摄氏度下孵育 35 分钟，在 80 摄氏度下孵育 15 分钟。然后将试管保持在 4 摄氏度并制备 12% 天然页面凝胶。
向每管中加入 1 微升上样染料和 4 微升不含 Rnase 的水。将混合物在非变性页面凝胶中以 150 伏电压运行，持续 45 分钟。确定完全生成单链 DNA 所需的最低 lambda 核酸外切酶量。
进行大规模反应以生成单链 DNA。对于每个待测的结合靶标，在室温下旋转，将 10 μL 平均官能化 DBP 编码磁珠与 500 μL 一种 DBP-1 微摩尔溶液孵育 1 小时。然后丢弃上清液。
用 200 μL 的 PAE 结合缓冲液洗涤磁珠 4 次，然后将磁珠重悬于 10 μL 的 PAE 结合缓冲液中。在 PAE 结合缓冲液中获得 10 微摩尔结合靶标测试分散体。疏水靶标在 PAE 结合缓冲液中的分散非常有用。
为了确保文库的丰富性，在亲和力测试下进行了选择。将 10 μL DBP-1 编码珠子添加到 110 μL 每种目标测试溶液中。将混合物孵育 1 小时，并通过磁分离收集上清液。
将上清液稀释 100 倍，每次定量 PCR 使用 3 μL。通过将在测试样品存在下释放的 DBP-1 的数量除以仅在 PAE 结合缓冲液中释放的 DBP-1 的数量来计算相对亲和力。在进行测量之前，合成和纯化基于 DBP-1 的硫醇化核心序列探针和信号探针。
在无核酸酶的水中重构硫醇化探针和信号探针，并作为 100 微摩尔溶液。接下来，用 1 微米、0.3 微米和 0.5 微米的氧化铝粉和超细纤维布将直径为 2 毫米的金电极抛光到镜面状表面，各研磨 5 分钟。每次抛光后，在超纯水中对电极进行超声处理 5 分钟。
将抛光电极浸入 0.5 摩尔的硫酸溶液中。用 35 次连续循环伏安扫描清洁电极，从负 0.4 伏到正 1.2 伏，而不是以每秒 100 毫伏的水银甘汞。接下来，在薄壁离心管中制备 0.5 微摩尔硫醇化探针 DBP-1 的混合物。
和 100 μL PBS 中的 0.5 μmol FC 修饰的 DBP-1。在设置为 95 摄氏度的水浴中加热混合物 10 分钟。然后让混合物在水浴中冷却至室温。
向冷却的混合物中加入 1 微升 10 毫摩尔 TCEP 储备液，并在室温下保持 1 小时。然后将干净的金电极在室温下浸入混合物中 12 小时。用 PBS 冲洗电极，然后将电极浸入硫醇化 PEG 的 PBS 溶液中 1 小时。
用无靶标 PAE 结合缓冲液彻底冲洗电极，并将电极浸入缓冲液中。接下来，在超纯水和 PAE 结合缓冲液中，对铂对电极和饱和甘汞参比电极的电解槽各进行超声处理 2 分钟。打开 square wave of voltam 仪器软件并输入实验参数。
用无靶标 PAE 结合缓冲液填充干净的电解池。将三个干净的电极连接到电化学工作站，并将电极浸入缓冲液中。获取后台 SWV 扫描。
然后将金工作电极浸入 10 皮卡莫拉尔 DEHP 溶液中，在室温下浸泡 PAE 结合缓冲液 30 分钟。用 PAE 结合缓冲液彻底冲洗电极。将所有三个电极浸入新鲜的 PAE 结合缓冲液中，并使用与以前相同的参数收集另一条 SWV 曲线。
用增加浓度的 DEHP 重复此过程以获得滴定曲线。基于小规模反应，发现仅获得单链 DNA 所需的最小 lambda 核酸外切酶量为 2 个单位。通过 SELEX 鉴定适配体候选 DBP-1，然后进行高通量测序。
DBP-1 对 PAE 同系物具有良好的组特异性。使用 DBP-1 的电化学适配体传感器对 DEHP 的选择性响应优于其他常见环境污染物。适配传感器对 DEHP 高度敏感，在浓度低至 10 皮卡莫拉时响应。
用于危险疏水小分子的适配体的激光颗粒选择和表征。由于 PAE 的水溶性极其有限且分子量低，因此疏水性小分子（如 PAE）的适配体的表征和挥发通常非常具有挑战性。看完这个视频，你应该对如何制作电化学适体传感器以及如何使用它来检测标题有了很好的了解。
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概述
本文介绍了一种用于体外选择和表征与疏水性小分子结合的群体特异性DNA适配体的协议。此外，它还讨论了这些选择的适配体在开发电化学生物传感器中的应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 生物物理学
- 分析化学
背景
- DNA适配体是可以与特定靶标结合的短单链DNA分子。
- 疏水性小分子由于其特性，对适配体的选择提出了挑战。
- 电化学生物传感器为检测适配体-靶标相互作用提供了一种敏感的方法。
- 本研究解决了为此类具有挑战性的靶标选择适配体的有效方法的需求。
研究目的
- 开发一种选择群体特异性DNA适配体的协议。
- 表征这些适配体对疏水性分子的结合亲和力。
- 利用所选适配体创建灵敏的电化学生物传感器。
使用的方法
- 通过系统进化进行DNA适配体的体外选择。
- 适配体结合特性的表征。
- 开发电化学适配体传感器以进行检测。
- 使用无核糖核酸酶水准备适配体溶液。
主要结果
- 成功选择了疏水性靶标的群体特异性DNA适配体。
- 证明了所选适配体的结合亲和力。
- 开发了能够检测适配体-靶标相互作用的电化学生物传感器。
- 方法为具有挑战性的靶标的适配体选择提供了见解。
结论
- 该协议有效地选择和表征了疏水性分子的DNA适配体。
- 可以使用这些适配体开发电化学生物传感器。
- 本研究有助于理解适配体选择方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Discovery-stage detection of hydrophobic small molecules like phthalic acid esters (PAEs) is limited by the lack of robust, group-specific recognition elements. This protocol enables the selection and quantitative characterization of DNA aptamers for highly hydrophobic targets, supporting the development of ultrasensitive electrochemical biosensors. The approach advances predictive confidence and portfolio triage for environmental and safety-relevant analytes in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables group-specific interrogation of hydrophobic small molecule targets using DNA aptamers.
- Supports mechanistic de-risking by providing quantitative affinity and selectivity data for aptamer-target interactions.
- Facilitates functional validation of aptamer binding to structurally related PAEs, informing target confidence.
Screening & Assay Development
- Prepares validated aptamer-based systems for downstream biosensor workflows.
- Standardizes competitive binding assays for reproducible affinity and selectivity measurements.
- Enables scalable screening of aptamer candidates for group-specific detection.
- Provides quantitative outputs for reliable compound evaluation in biosensor platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer selection with translational biosensor development for environmental and safety monitoring.
- Supports continuity from molecular recognition discovery to preclinical biosensor validation.
- Reduces risk in advancing aptamer-based detection systems for regulatory or field deployment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early aptamer discovery through biosensor assay development, enabling a continuum from target validation to preclinical biosensor readiness.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification in small molecule recognition.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative affinity and selectivity data for aptamer candidates.
- Analytics: Employs qPCR and competitive assays to generate comparative binding metrics across PAEs.
- Translational Research: Bridges aptamer discovery with biosensor application for environmental and safety endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for aptamer selection against other hydrophobic small molecules.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in small molecule detection.
- Operational Value: Standardizes aptamer selection and biosensor fabrication for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in biosensor pipeline development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of aptamer-based detection platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aptamer selection, qPCR analytics, and biosensor fabrication.
- Needs access to magnetic separation, high-throughput sequencing, and electrochemical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of binding and competitive assay protocols.
- May require adaptation for other hydrophobic targets with limited solubility or functionalization options.
- Practical limitations include the challenge of immobilizing highly hydrophobic targets for selection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Small-scale λ Exonuclease Reaction
2:40
Relative Affinity and Specificity Test by Competitive Assays
4:17
Fabrication and Electrochemical Measurements of Diethylhexyl Phthalate (DEHP) Electrochemical Biosensors
7:52
Results: Optimization of λ Exonuclease Reaction and Electrochemical Aptasensor Evaluation
8:46
Conclusion
