Name: 邻苯二甲酸酯结合 DNA 核酸适体的选择、表征及其在电化学 Aptasensor 中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习体外筛选特异性结合疏水性小分子的DNA核酸适体，并表征其亲和力用于构建电化学适体传感器。该方法为检测邻苯二甲酸酯类化合物提供了高灵敏度的生物传感策略。

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感谢国家自然科学基金（21675112）、北京市教育委员会科技计划重点项目（KZ201710028027）以及首都师范大学燕京青年学者计划的经费支持。

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作者声明不存在竞争性财务利益。

适配体的一个显著优势在于，它们是通过体外筛选过程确定的 体外 方法SELEX，而抗体则通过 体内 免疫反应。因此，在精心设计的实验条件下，可筛选出具有理想靶标特异性的适配体，而抗体则受限于生理条件。
为了促进结合序列与游离序列的分离，近年来已报道了多种改进的SELEX技术，其中采用了毛细管电泳30微流控技术31磁珠/丙烯酸珠/琼脂糖珠14, 等等。已采用微珠法等技术取代硝酸纤维素滤膜或亲和柱，以实现更高效的分离。在这些技术中，基于微珠的方法因其装置简单、操作便捷，且适用于小分子分析，已成为小分子靶标适配体筛选应用最广泛的技术。
目前常用于小分子靶标适配体筛选的方法分为两类：靶标固定化方法13和文库固定化方法14。在前一类方法中，小分子靶标...

随着经济的快速发展、工业化进程的加快以及城市建设的推进，环境污染问题比以往任何时候都更加严重。典型的环境污染物包括重金属离子、毒素、抗生素、农药、内分泌干扰物以及持久性有机污染物（POPs）。除金属离子和毒素外，其他污染物多为小分子，且通常包含多种同类物。例如，毒性最强的持久性有机污染物包括多氯联苯（PCBs）、多环芳烃（PAHs）、多溴联苯醚（PBDEs）、多氯二苯并二噁英（PCDDs）、多氯二苯并呋喃（PCDFs）以及邻苯二甲酸酯（PAEs）1,2，这些物质均包含大量同类物。由于应用范围广泛，小分子的检测主要依赖色谱/质谱联用技术3,4,5,6。对于现场检测，近年来已发展出基于抗体的检测方法7,8,9。然而，由于这些方法对特定同类物具有高度特异性，往往需要进行多次检测。更为严重的是，新型同类物不断涌现，其相应抗体难以及时制备。因此，开发能够一次性检测所有同类物总含量的族特异性生物传感器，可能为评估环境污染状况提供一种极为重要的量化指标。
近年来，核酸适配体因其能够识别多种目标物——从离子、小分子到蛋白质和细胞——而被广泛应用于各类生物传感平台中作为识别元件10,11,12. 通过以下方式鉴定适体 体外 指数富集配体系统进化法（SELEX）13,14SELEX 起始于随机合成的单链寡核苷酸文库，其包含约 1014-1015 序列。随机文库的规模可确保RNA或DNA候选结构的多样性。典型的SELEX过程包含多轮富集，直至文库中富含对靶标具有高亲和力和特异性的序列。最终富集的文库随后进行测序，并测定其解离常数（Kd以及通过滤膜结合、亲和层析、表面等离子共振（SPR）等不同技术测定对潜在干扰物质的选择性， 等等.15
由于持久性有机污染物（POPs）的水溶性极差，且缺乏可用于表面固定的官能团，理论上针对POPs的适配体筛选具有较大难度。尽管SELEX技术的显著进展已加快了适配体的发现速度，但目前尚未见报道针对POPs的基团特异性适配体的筛选。迄今为止，仅鉴定出对特定同系物具有高特异性的多氯联苯（PCB）结合DNA适配体16。邻苯二甲酸酯类（PAEs）主要应用于聚氯乙烯材料中，可将聚氯乙烯由硬质塑料转变为弹性塑料，因而作为增塑剂使用。部分PAEs已被确认为内分泌干扰物，可对肝肾功能造成严重损害，降低男性精子活力，并可能导致精子形态异常以及睾丸癌17。目前尚未见报道针对PAEs的化合物特异性或基团特异性结合适配体。
本研究旨在提供一种代表性方案，用于筛选针对高度疏水性小分子（如典型持久性有机污染物PAEs）的基团特异性DNA适配体。我们还展示了所筛选适配体在环境污染物检测中的应用。该方案为其他疏水性小分子的适配体筛选提供了指导和参考。

<table><tbody><tr><td>UV-2550</td><td>Shimadzu，日本</td><td></td><td>方案，第 3.8.2 节</td></tr><tr><td>DNA Engine 热循环仪，PTC0200</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>第 3.5.1.2 节和第 3.5.2 节</td></tr><tr><td>C1000 Touch</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>第 5.3.6 节和第 6.3 节</td></tr><tr><td>VMP3 多通道恒电位仪</td><td>Bio-Logic Science，Claix，法国</td><td></td><td>第 7.4、7.8 和 7.11 节</td></tr><tr><td>Epoxy-activated Sepharose 6B</td><td>GE Healthcare（Piscataway，NJ，美国）</td><td>10220020</td><td>琼脂糖微珠，第 2.3 和 3.3 节</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 羧酸磁珠</td><td>Invitrogen，美国</td><td>420420</td><td>磁珠，第 5.2 和 5.3 节</td></tr><tr><td>Premix Taq Hot Start Version</td><td>Takara，大连，中国</td><td>R028A</td><td>DNA 聚合酶，第 3.5.1.1 节</td></tr><tr><td>PARAFILM 密封膜</td><td>Bemis，美国</td><td>PM-996</td><td>第 3.6.5 节</td></tr><tr><td>Lambda 外切酶</td><td>Invitrogen，美国</td><td>EN0561</td><td>第 3.7.1.2 节。供应商提供 &amp;times;10 反应缓冲液与 &amp;lambda; 外切酶。</td></tr><tr><td>Dr. GenTLE&lt;br/&gt; 沉淀载体</td><td>Takara，大连，中国</td><td>9094</td><td>第 3.6.2 节和第 3.8.1 节</td></tr><tr><td>UNIQ-10 PAGE DNA 回收试剂盒</td><td>Sangon Biotech（上海）</td><td>B511135</td><td>第 4.2 节</td></tr><tr><td>SYBR Gold 核酸凝胶染料</td><td>Invitrogen，美国</td><td>1811838</td><td>核酸染色剂，第 3.5.1.5 节</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara，大连，中国</td><td>RR820A</td><td>含 DNA 聚合酶和 dNTPs 的聚合酶混合液，第 5.3.5 节</td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1132-61-2</td><td>第 5.2.1 节</td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）</td><td>Invitrogen，美国</td><td>CAS: 25952-53-8</td><td>第 5.2.2 节</td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6066-82-6</td><td>第 5.2.3 节</td></tr><tr><td>巯基己醇（MCH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1633-78-9</td><td>第 7.7 节</td></tr><tr><td>金电极</td><td>上海辰华</td><td>CHI101</td><td>第 7.4 至 7.11 节</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 51805-45-9</td><td>第 7.5 节</td></tr><tr><td>O-(2-巯基乙基)-O'-甲基-六(乙二醇)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 651042-82-9</td><td>第 7.7 节</td></tr><tr><td>邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）</td><td>中国计量科学研究院</td><td>CAS: 117-81-7</td><td>第 7.11 节</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9005-64-5</td><td>聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9002-93-1</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>含 1 M NaCl 的 10 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td></tr></tbody></table>

邻苯二甲酸酯结合dna适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类主要的持久性有机污染物。由于同系物数量迅速增加，对PAEs进行基团特异性检测具有重要意义。DNA适配体 increasingly 被用作生物传感器平台中的识别元件，但针对高度疏水性小分子靶标（如PAEs）的适配体筛选报道较少。本研究描述了一种基于微珠的方法，用于筛选针对PAEs的基团特异性DNA适配体。通过合成带有氨基功能化的邻苯二甲酸二丁酯（DBP-NH2）作为锚定靶标，并将其固定在环氧活化的琼脂糖微珠上，使邻苯二甲酸酯基团暴露于固定化基质表面，从而实现对基团特异性结合分子的筛选。我们采用定量聚合酶链式反应结合磁性分离技术测定适配体候选序列的解离常数。通过竞争性实验测定适配体对其他PAEs的相对亲和力和选择性，该实验中，适配体候选序列首先与连接DBP-NH2的磁性微珠结合，随后在与待测PAEs或其他潜在干扰物质孵育后释放至上清液中。由于该竞争性实验可简便地比较那些缺乏表面固定功能基团的PAEs之间的亲和力差异，因此被采用。最后，我们展示了电化学适配体传感器的构建，并将其用于对邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯的超灵敏和高选择性检测。本方案为其他疏水性小分子适配体的筛选提供了思路。

我们设计并合成了氨基功能化的邻苯二甲酸二丁酯（DBP-NH2）作为锚定靶标（图1F）。随后，以DBP-NH2为锚定靶标，采用经典的基于靶标固定的筛选方法，对邻苯二甲酸酯类（PAEs）进行DNA适配体筛选（图2）。在每一轮筛选中，均使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行预实验PCR，以优化PCR循环次数（图3）。强烈建议使用变性PAGE而非天然PAGE，因为我们及其他研究人员发现，在较高循环数下，天然凝胶上出现的疑似高分子量副产物，实际上是正确大小序列之间形成的交联复合物。因此，变性PAGE的条带强度才能真实反映正确产物的量。单链DNA的制备是另一个关键步骤，已有多种方法被报道28。其中，λ外切酶消化法成本最低。该步骤是否成功可通过天然PAGE方便地检测：PCR产物在天然PAGE上表现为单一条带（SEL...

一种实验方案 体外 介绍了特异性结合邻苯二甲酸酯类化合物的DNA适配体的筛选与表征，并包含了所选适配体在电化学适体传感器中的应用。

邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类主要的持久性有机污染物。由于……，对PAEs进行基团特异性检测具有重要意义。

本实验的总体目标是筛选针对高度疏水性小分子的基团特异性DNA适配体，并利用所筛选的适配体开发一种高灵敏的电化学生物传感器。该方法有助于解决适配体筛选领域中的关键问题，即当靶标为高度疏水性分子时，如何进行基团特异性适配体的筛选与表征。尽管该方法最有价值的部分在于电化学生物传感器的构建，但其亦可用于目标物的检测。这些生物传感器也应适用于我们的适体亲和力测定。开始反应时，向纯化的适体PCR产物中加入100微升无RNase的水。涡旋混合液，直至沉淀完全溶解。λ核酸外切酶反应对盐浓度敏感，其产物应通过乙醇沉淀进行纯化，而非异丙醇。将适配体溶液5微升、RNase-free水11微升以及10×反应缓冲液2微升分别加入五个微量离心管中。向其中四个管子分别加入2微升RNase-free水，以及含有2、5、8和10单位λ核酸外切酶的RNase-free水溶液各2微升。轻轻吹打混匀。将离心管在37°C孵育35分钟，然后在80°C孵育15分钟。随后将离心管置于4°C保存，并配制12%的非变性PAGE胶。向每根试管中加入一微升上样染料和四微升无RNase的水。将混合物在天然PAGE凝胶中以150伏电压电泳45分钟。确定完全生成单链DNA所需的最低量λ外切核酸酶。进行大规模反应以生成单链DNA。针对每个待检测的结合靶标，将10微升经平均功能化的DBP编码磁珠与500微升浓度为1微摩尔的DBP-1溶液在室温下孵育1小时，同时旋转。随后弃去上清液。用200微升PAE结合缓冲液将磁珠洗涤四次，然后将磁珠重悬于10微升PAE结合缓冲液中。在PAE结合缓冲液中制备10微摩尔的结合靶标测试分散液。这是将疏水性靶标在PAE结合缓冲液中进行分散的良好方法。为了确保文库的富集，通过亲和试验进行筛选。将10 µL编码为DBP-1的磁珠加入到110 µL每种靶标测试溶液中。混合物孵育1小时后，通过磁分离收集上清液。将上清液稀释100倍，每份定量PCR使用3微升。通过将测试样品存在时释放的DBP-1数量除以仅在PAE结合缓冲液中释放的DBP-1数量，计算相对亲和力。在进行测量之前，合成并纯化基于DBP-1的巯基化核心序列探针和信号探针。用无核酸酶水将巯基化探针和信号探针分别配制成100微摩尔的溶液。接着，使用粒径分别为1、0.3和0.5微米的氧化铝粉末及微纤维布，对直径为2毫米的金电极进行抛光，每种粉末各抛光5分钟，直至电极表面呈镜面状。每次抛光后，将电极在超纯水中超声处理5分钟。将抛光后的电极浸入0.5摩尔的硫酸溶液中。以饱和甘汞电极为参比电极，在-0.4至+1.2伏特范围内，以100毫伏每秒的扫描速率连续进行35次循环伏安扫描以清洗电极。随后，在薄壁离心管中配制0.5微摩尔的硫醇化探针DBP-1混合液。将0.5微摩尔的FC修饰的DBP-1溶于100微升PBS中。将混合物置于95摄氏度的水浴中加热10分钟，随后在水浴中冷却至室温。向冷却后的混合物中加入1 µL的10 mM TCEP储备溶液，在室温下孵育1小时。随后将洁净的金电极浸入该混合物中，在室温下孵育12小时。用PBS冲洗电极，再将电极浸入含1 mM巯基化PEG的PBS溶液中，孵育1小时。用不含靶标的 PAE 结合缓冲液彻底冲洗电极，并将电极浸入缓冲液中。随后，将铂对电极和饱和甘汞参比电极的电解池依次在超纯水和 PAE 结合缓冲液中各超声处理两分钟。打开方波伏安法仪器软件中的方波设置，输入实验参数。用目标游离PAE结合缓冲液填充洁净的电解池。将三个洁净的电极连接至电化学工作站，并将电极浸入缓冲液中。采集背景方波伏安扫描曲线。然后将金工作电极浸入含有10皮摩尔邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）的PAE结合缓冲液中，在室温下孵育30分钟。用PAE结合缓冲液彻底冲洗电极。将三个电极均浸入新鲜的PAE结合缓冲液中，并使用与之前相同的参数采集另一条方波伏安（SWV）曲线。通过逐步增加DEHP的浓度重复此过程，以获得滴定曲线。根据小规模反应结果，获得单链DNA所需的λ外切酶最小用量为2个单位。适配体候选物DBP-1通过SELEX技术结合高通量测序鉴定获得。DBP-1 对邻苯二甲酸酯类化合物表现出良好的组特异性。使用 DBP-1 的电化学适体传感器对邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）的响应具有选择性，不受其他常见环境污染物的干扰。该适体传感器对 DEHP 具有高灵敏度，最低可检测浓度低至 10 皮摩尔（10 picomolar）。用于选择和表征危害性疏水小分子适配体的激光颗粒技术。由于邻苯二甲酸酯类（PAEs）等疏水小分子的水溶性极低且分子量较小，其适配体的表征与挥发性研究通常具有较大挑战性。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建电化学适体传感器，以及如何利用该传感器检测目标物。

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邻苯二甲酸酯结合 DNA 核酸适体的选择、表征及其在电化学 Aptasensor 中的应用

使用随机DNA文库进行无引物适配体筛选

“E-DNA”传感器是一种无需试剂的电化学生物传感器，即使直接在血液及其他复杂基质中检测，仍表现出良好的性能，目前已适用于多种核酸、蛋白质和小分子分析物的检测。本文介绍了一种此类传感器的制备与使用通用方法。...

无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

提供了一种基于可调节严格度磁珠筛选方法的小分子靶标结构转换型适体选择方案。具有结构转换特性的适体有利于需要通过构象变化来指示靶标存在的检测方法，例如文中所述的金纳米粒子检测法。...

一种用于比色法金纳米粒子检测的构象转换型适体筛选方法

利用微尺度热泳技术绘制适配体在ATP上的结合位点

介绍了一种电化学DNA生物传感器的制备方案，该传感器由聚乳酸稳定的、金纳米颗粒修饰的丝网印刷碳电极组成，用于检测副溶血性弧菌（Vibrio...

开发一种电化学DNA生物传感器以检测食源性病原体

核酸酶活性的改变与多种人类疾病状态相关，表明其作为疾病生物标志物的潜力。本文介绍了一种模块化且易于实施的筛选方法，可用于选择特异性的核酸探针，从而利用核酸酶活性作为疾病的生物标志物。...

利用核酸探针进行核酸酶活性的动力学筛选

本实验方案描述了使用等温滴定...

利用等温滴定量热法测定DNA适配体与四环素结合的热力学和动力学参数

在抗癌适配体开发过程中，一个必要的步骤是检测其与靶标的结合能力。我们展示了一种基于流式细胞术的检测方法来研究这种结合，并强调了实验中必须包含阴性对照适配体，以及对该特定蛋白呈阳性或阴性的癌细胞的重要性。...

一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合检测方法用于评估抗癌适配体的选择性与特异性

本方案展示了使用一种快速、三步式、基于适配体的指数扩增检测方法来检测目标物。涵盖了样本制备、信号扩增和显色发育步骤，以实现对该体系的应用，特异性识别茶碱而非咖啡因的存在。...

基于适体的靶标检测结合三阶段G-四链体等温指数扩增反应

本方案概述了利用荧光信号增强型适体 DAP-10-42...

利用DNA荧光增强型适体作为信号报告分子的分裂杂交探针用于序列特异性核酸分析

学习体外筛选特异性结合疏水性小分子的DNA核酸适体，并表征其亲和力用于构建电化学适体传感器。该方法为检测邻苯二甲酸酯类化合物提供了高灵敏度的生物传感策略。

邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用

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