Name: 建立一种结构逼真的心肌细胞的有限元几何模型研究蜂窝结构在心肌系统生物学中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 了解如何利用电子显微镜和共聚焦显微镜数据建立心肌细胞有限元模型，以研究细胞结构对心脏功能的影响。该方法整合互补成像技术，为心血管生物学研究提供新工具。

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本工作得到了新西兰皇家学会Marsden Fast Start基金11-UOA-184、人类前沿科学计划研究基金RGP0027/2013以及澳大利亚研究理事会发现项目基金DP170101358的支持。

本文所述所有方法均已获得奥克兰大学动物伦理委员会和加州大学圣地亚哥分校机构动物护理与使用委员会的批准，其中组织方案最初由后者开发。
1. 实验准备
<ol>
	<li>根据表1配制pH 7.4的0.15 M和0.3 M二甲胂酸钠缓冲液储备液。</li>
	<li>使用表1中列出的组分，配制戊二醛固定液（含2%多聚甲醛（PFA）、2.5%戊二醛和0.2%单宁酸的0.15 M二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4）。
	<ol>
		<li>将2 g PFA粉末加入20 mL蒸馏水中，在加热板上60 °C条件下持续搅拌使其溶解。</li>
		<li>逐滴加入1 M NaOH溶液，直至溶液变澄清。</li>
		<li>待溶液温度降至40 °C以下后，加入10 mL戊二醛和20 mL 0.3 M二甲胂酸钠缓冲液。</li>
		<li>加入0.2 g单宁酸，并使其完全溶解于溶液中。</li>
		<li>加入50 mL 0.15 M二甲胂酸钠缓冲液。</li>
		<li>将固定液分装至三到四个20 mL闪烁瓶中，于4 °C冰箱中保存；若当天使用，可置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据表1中的配方，配制含20 mM 2,3-丁二酮单肟（BDM）的Tyrode溶液。</li>
	<li>在通风橱内组装Langendorff装置。
	<ol>
		<li>将两个100 mL塑料注射器固定在两个不同的铁架台上，高度约为距台面70 cm。</li>
		<li>使用内径为3 mm的管路和三通旋塞，将塑料注射器与连接管连接，具体连接方式见图1。</li>
		<li>在连接管底部安装外径为3 mm的套管，用于结扎心脏以进行灌注固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将37 °C的Tyrode溶液和固定液分别注入注射器管中。
	<ol>
		<li>使溶液流经管路，以排除其中的气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 获取心肌细胞超微结构的电子显微镜数据
<ol>
	<li>准备动物以进行心脏切除和化学固定。 
	注意：本方案详细描述了成年雄性Wistar（一种白化大鼠品系的名称）大鼠心脏组织的处理步骤。当心脏组织来源于其他物种时，本方案可能需要相应修改。
	<ol>
		<li>通过腹腔注射0.5 mL浓度为250 U/mL的肝素对动物进行麻醉处理（大鼠体重为200–250 g）。等待10分钟后，通过腹腔注射戊巴比妥（剂量为210 mg/kg体重）。</li>
		<li>通过测试足趾夹捏反射确认麻醉程度是否合适。</li>
		<li>通过颈椎脱位法处死动物。</li>
		<li>采用与此前发表的 JoVE 文章类似的解剖方法收获心脏22,23，然后将其置于冰冻生理盐水中。</li>
		<li>分离升主动脉并插管。确保导管尖端位于半月瓣上方、冠状动脉分出处。用缝线在升主动脉周围结扎固定。</li>
		<li>将套管连接至重力驱动的Langendorff装置，该装置运行高度约为系统底部上方70 cm处（图1).</li>
		<li>旋转兰格多夫系统上的旋塞，使含有20 mM BDM（肌球蛋白抑制剂）的台氏液灌注心脏，持续2-3分钟。</li>
		<li>旋转活塞，开始用固定液灌注，固定液成分为2%多聚甲醛、2.5%戊二醛和0.2%单宁酸，溶于0.15 M二甲胂酸钠缓冲液，37 °C条件下持续10分钟。若操作成功，心脏将变为浅棕色，并变得僵硬且有弹性。</li>
		<li>使用剃刀刀片从左心室（侧壁）游离壁切取组织块，并获取约1 mm的组织块3 大小。</li>
		<li>将样品置于预冷的20 mL闪烁小瓶中，加入相同固定液并在冰上保存2小时。尽可能多地将样品存放在小瓶中，并确保样品完全浸没于溶液中。 
		注意：在完成下述100%脱水步骤之前，必须始终保持样品处于低温状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于透射电子显微镜的样品进一步固定与染色
	<ol>
		<li>将100 mL 0.15 M 二甲胂酸钠缓冲液倒入玻璃烧杯中，置于冰上冷却。</li>
		<li>配制等体积的4%四氧化锇和0.3 M二甲胂酸钠溶液，然后加入0.08 g亚铁氰化钾，制备含有2%亚铁氰化钾、2%四氧化锇和0.15 M二甲胂酸钠的重金属染色液。将溶液置于冰上冷却。</li>
		<li>用移液器吸出固定液，加入足量冷的0.15 M二甲胂酸钠缓冲液，完全浸没小瓶中的样品。将小瓶置于冰上放置5分钟。</li>
		<li>重复步骤 2.2.3 四次，每次使用 0.15 M 二甲胂酸钠缓冲液，以去除多余的固定剂。 
		警告：请勿使用玻璃移液管，因为微小的玻璃碎片可能进入样品，并在组织块切片过程中损坏钻石刀。在将溶液加入样品前，必须先将所有溶液置于冰上预冷。整个过程中，样品必须始终完全浸没在溶液中（仅在更换溶液时，可短暂耐受数秒内的部分暴露）。洗涤或更换溶液时，应在移除前一种溶液后迅速加入新溶液。洗涤间隙应将闪烁瓶置于冰上。注意，此步骤对时间不敏感，如有需要，可适当延长组织块的洗涤时间。</li>
		<li>用预冷的重金属染色液替换二甲胂酸钠缓冲液，并在冰上避光保存过夜。用手轻轻振荡小管以确保铁氰化物充分混匀；溶液应变为黑色。 
		注意：进行此步骤时应在通风橱中操作，因为锇具有毒性。</li>
		<li>将4%的水合醋酸铀酰（UA）水溶液稀释（表1) 使用等体积的储备UA溶液与双蒸水将其稀释至2%，并在冰上冷却。</li>
		<li>用冰冷却的0.15 M二甲胂酸钠缓冲液替换重金属染色液，将样品置于冰上孵育5分钟。</li>
		<li>在冰上重复步骤 2.2.7 四次，以洗去多余的重金属染色液。</li>
		<li>用纯化水（双蒸水即可）清洗样品，共清洗四次，每次间隔 2 分钟。</li>
		<li>用预冷的2% UA替代纯化水，将样品置于冰上孵育60-120分钟。</li>
		<li>将五个装有乙醇（用量需足以浸没样本）的20 mL闪烁瓶置于冰上冷却，用于后续脱水步骤。这六个瓶子中的乙醇浓度依次递增，分别为蒸馏水配制的20%、50%、70%、90%和100%乙醇溶液。</li>
		<li>将纯丙酮倒入另一个20 mL 闪烁瓶中，并与乙醇瓶一同置于冰上冷却。</li>
		<li>用纯化水在冰上孵育2分钟，重复冲洗样品四次，以去除多余的UA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用乙醇对样品进行脱水。
	<ol>
		<li>在冰上依次更换样品管中的溶液，进行冷乙醇梯度脱水：20% 乙醇 10 分钟；50% 乙醇 10 分钟；70% 乙醇 10 分钟；90% 乙醇 10 分钟；然后在 100% 乙醇中更换两次，每次 10 分钟。</li>
		<li>将最终的100%乙醇替换为冷却的纯丙酮，使样品过渡至室温，并将样品管置于室温实验台放置10分钟。</li>
		<li>在室温下用纯丙酮再进行一次10分钟的洗涤，以去除离心管内可见的冷凝物。在孵育期间，配制丙酮/树脂溶液。</li>
		<li>将小瓶中的纯丙酮替换为50:50的纯丙酮与环氧树脂混合液（环氧树脂各组分比例按制造商说明）。使用同一生产批次的全部组分。将装有树脂的样品小瓶置于旋转仪上过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品包埋于树脂中。
	<ol>
		<li>用75%树脂（25%丙酮）替换50:50树脂，室温孵育3小时，随后在100%树脂中进一步孵育/渗透4小时。</li>
		<li>将100%树脂更换为新鲜的100%树脂，并将样本瓶放置过夜，以促进树脂对组织样本的充分渗透。</li>
		<li>从离心管中取出样品，放入可耐受烘箱且具有平坦底部的容器中；例如，可使用铝箔或银箔制的烘焙杯。</li>
		<li>轻轻将新鲜树脂倒入样品上（避免样品移位），使样品包埋于树脂中，随后将树脂和样品置于60 °C烘箱中聚合48 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重新调整树脂块的方向，以观察细胞的横截面。
	<ol>
		<li>使用超薄切片机和玻璃刀从树脂块中获取1 µm厚的测试切片，以评估细胞取向24.</li>
		<li>用1%甲苯胺蓝和1%硼砂对厚切片染色20秒。</li>
		<li>在明场显微镜下观察肌细胞的排列方向。</li>
		<li>根据染色测试切片图像推断出的方向，重新调整纵向或斜向（类似于 图2A树脂块以确保细胞暴露于玻璃刀刃，从而被横向切割（类似于 图2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用电子断层扫描技术对组织切片进行成像。
	<ol>
		<li>使用金刚石刀从重新定向的组织块上获取半薄切片（约300 nm），并将切片转移至铜网上25.</li>
		<li>用2%铀酸和Sato铅染色厚切片25.</li>
		<li>在切片的两侧施加胶体金颗粒25.</li>
		<li>从 -70° 到 +70° 获取单轴或双轴倾斜系列的投影图像25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 IMOD20 重建细胞的三维图像堆栈（一系列二维图像，提供单个电子断层扫描切片的三维信息）。该重建的图像堆栈将在下一步中进行分割。</li>
</ol>
3. 从电镜三维图像数据集中分割肌原纤维和线粒体区域
<ol>
	<li>运行 IMOD 程序 &#34;3dmod&#34;。</li>
	<li>在 3dmod 图形用户界面中，将包含细胞三维重建图像数据集（在步骤 2.7 中生成）的 &#34;.rec&#34; 或 &#34;.mrc&#34; 文件地址输入到标有 &#34;Image file(s):&#34; 的输入框中，然后点击 &#34;OK&#34;。</li>
	<li>在 &#34;File&#34; 菜单下，选择“New Model”，然后使用 &#34;Save Model as"… 菜单项（位于 &#34;File&#34; 菜单下）将文件以适当名称保存。 
	注意：IMOD 中的一个对象可以包含构成该 &#34;object&#34; 的多个分割组分。默认情况下，一个新模型包含一个 ID 为 &#34;#1&#34; 的新对象。</li>
	<li>在 &#34;Special&#34; 菜单下，选择 &#34;Drawing Tools&#34;。这将打开一个新的工具栏，如 图 3A 所示。 
	注意：有多种工具可用于在不同细胞器边界周围创建轮廓。有关这些工具使用方法的更多帮助，请参见 IMOD20 文档。</li>
	<li>在 &#34;Drawing Tools&#34; 菜单中选择 &#34;Sculpt&#34; 选项，并将鼠标移至图像窗口；此时会出现一个以鼠标指针为中心的圆形轮廓。</li>
	<li>在图像文件中较暗区域的线粒体上（如 图 3A 中绿色轮廓线所标示的区域），按住鼠标中键，拖动圆形轮廓的边缘，使其形状贴合线粒体的边界。</li>
	<li>完成线粒体边界的轮廓绘制后，松开鼠标中键，并对数据集中的每一个线粒体重复步骤 3.6。每个轮廓将被 IMOD 自动识别为同一对象内的新轮廓。</li>
	<li>在 &#34;Edit | Object &#34; 菜单下，选择 &#34;New&#34; 以创建一个新对象。这将自动使对象总数增加 1，并将此编号分配给新对象。</li>
	<li>重复步骤 3.6 和 3.7，以分割并保存肌原纤维的轮廓。</li>
	<li>重复步骤 3.8，然后执行步骤 3.6，以同时分割并保存细胞边界。</li>
	<li>在 &#34;File&#34; 菜单下保存模型文件。</li>
	<li>在命令行窗口中执行以下命令，将每个对象分组转换为二值掩膜，如 图 4A-C 所示。
	<ol>
		<li>从模型中提取特定对象：&#34;imodextract object modelfile outputmodelfile&#34;，其中 &#34;object&#34; 是要提取的对象编号。</li>
		<li>为该对象创建掩膜：imodmop -mask 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc</li>
		<li>将文件转换为 tif 堆栈：mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从分割后的组分创建有限元网格
<ol>
	<li>iso2mesh 是一个可免费获取的 MATLAB 程序，用于将 TIFF 图像堆栈转换为体积分割的四面体有限元网格。请从 iso2mesh.sourceforge.net 下载并将其添加到 MATLAB 路径中。</li>
	<li>从 GitHub 网站 https://github.com/CellSMB/RyR-simulator 下载用于在网格上模拟 RyR 簇的源代码和数据。</li>
	<li>启动 CardiacCellMeshGenerator MATLAB 应用程序（图 5）。</li>
	<li>使用图形用户界面左上角的三个按钮，将不同细胞器组分的掩膜载入 MATLAB。</li>
	<li>创建另一个二值图像堆栈，以标示肌原纤维与线粒体之间的间隙，如 图 6A 所示。
	<ol>
		<li>打开 ImageJ。</li>
		<li>通过“文件 | 打开”对话框，将肌原纤维和线粒体的 TIFF 堆栈载入程序。</li>
		<li>选择 &#34;处理 | 计算器 Plus&#34;，启动图像加法插件。</li>
		<li>将肌原纤维图像堆栈选为 i1，线粒体图像堆栈选为 i2，并选择 &#34;加法&#34;操作符，然后点击 &#34;确定&#34;。</li>
		<li>当显示步骤 4.5.4 结果的新图像堆栈出现后，选择 &#34;编辑 | 反转&#34;，生成类似于 图 6A 的图像堆栈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 CardiacCellMeshGenerator 程序中，点击 &#34;RyRGapsFile&#34; 按钮，加载包含肌原纤维与线粒体间隙的二值图像堆栈文件。</li>
	<li>在图形用户界面上点击 &#34;生成网格&#34;。这将触发 iso2mesh 命令 v2m 并使用 'cgalmesh' 选项，生成一个类似于 图 4E 的四面体网格。此步骤完成后将输出三个文件：一个 .ele 文件、一个 .face 文件和一个 .node 文件，分别包含构成单元的节点列表、构成面的节点列表以及节点的坐标。</li>
</ol>
5. 将目标离子通道的空间变化密度数学映射到有限元网格上。
<ol>
	<li>通过点击图形用户界面（GUI）上标记为“Generate RyR-Simulator inputs”的按钮，生成RyR-Simulator所需输入文件。 
	注意：该按钮将触发函数 generateRyRsimulatorInputs.m，该函数利用步骤 4 中的以下信息生成输入： 
	(1) outDir：用于输出进行RyR簇模拟所必需的文件的路径。 
	(2) imres：图像堆栈在三个方向上的像素分辨率。 
	(3) myofibril_file：包含二值图像堆栈的文件，如图所示 图4B. 
	(4) sarcolemma_file：包含二值图像堆栈的文件，如图所示 图4A. 
	(5) ryrgaps_file：包含二进制图像堆栈的文件，如图所示 图 5A.
	<ol>
		<li>此函数执行后，请检查在指定为 outDir 路径的目录中是否已创建以下文件：</li>
	</ol>
	<ul>
		<li>d_axial_micron.txt，表示Z盘位置与图像堆栈中其余像素之间的轴向距离。</li>
		<li>d_radial_micron.txt，表示从可能的RyR簇位置集合中的每个像素到Z盘平面上像素的欧几里得距离（不包括轴向分量）。</li>
		<li>W_micron.txt，表示可用于RyR簇存在的所有位置的空间坐标列表。</li>
		<li>文件夹中其余的3个文件包含以下后缀 &#34;像素&#34; 而不是 &#34;微米&#34; 用于表示这些文件中的数值是以像素坐标形式写出的。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>在肌原纤维的二值化图像堆栈上模拟兰尼碱受体簇的分布。
	<ol>
		<li>按下标有 &#34;在 R 中打开 RyR 模拟器&#34; 启动 R 程序。</li>
		<li>在 R-gui 中，选择 &#34;文件 | 打开&#34; 并找到该文件 &#34;settings.R&#34; 在 RyR-Simulator 软件包中（RyR-Simulator/source/settings.R）。</li>
		<li>同时打开文件 ryr-simulator-parallel.R（位于 RyR-Simulator/source/ryr-simulator-parallel.R）。类似 Rstudio 的环境&#160;（https://www.rstudio.com）或纯命令行界面均可使用， 例如 在 shell 或命令窗口中使用 R64 命令。</li>
		<li>根据以下说明修改 settings.R 文件中的参数：
		<ol>
			<li>将 Path2 设置为包含实验获取的RyR簇和肌原纤维共聚焦图像堆栈文件的文件夹路径，这些文件列在5.1.2中。 
			注意：github 代码库文件夹 input-files/master-cell/ 中已包含为先前采集的图像堆栈生成的文件。</li>
			<li>将 Path4 设置为存储步骤 5.1.2 中生成文件的文件夹路径。</li>
			<li>将路径3的点设置为用户希望保存模拟的RyR簇位置的文件夹。</li>
			<li>将 N 设为模型中拟模拟的雷诺丁受体（RyR）簇的数量（通常在 200 到 300 之间）。</li>
			<li>设定 etol（容差参数），用于表示实验测得的 RyR 聚集体空间分布与模型模拟的 RyR 聚集体空间分布之间的差异。</li>
			<li>将 numIter 设置为限制 RyR-Simulator 寻找满足 etol 值的模拟 RyR 聚集模式所尝试的次数。 
			注意：etol 和 numIter 的取值已在 settings.R 文件中设置为典型值。</li>
			<li>将 numPatterns 设置为用户希望模拟的不同 RyR 簇模式的数量（通常，为获得统计学置信度，建议模拟 99 种模式）。</li>
			<li>将 numCores 设置为启用多个 CPU 线程（核心），以利用 R 进行更快的并行处理来模拟点格局。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>检查是否已通过 R 中的包安装器图形界面安装了以下包：snow、doSNOW、doparallel、foreach、iterators 和 rgl。</li>
		<li>在 R 命令窗口中输入以下命令以运行模拟器：source('path to ryr-simulator-parallel.R', chdir=TRUE) 
		注意：RyR-Simulator 程序的输出为一组 .txt 文件（将生成一个 numPatterns 文件），其中包含 N 行 3 列的坐标列表，分别表示 N 个模拟的 RyR 聚集体的 x、y 和 z 坐标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 CardiacCellMeshGenerator 将点映射为计算模型上的空间密度。
	<ol>
		<li>点击标有 &#34;选择 RyR 点文件&#34;选择由 RyR-Simulator 输出的模拟 RyR 聚集分布文本文件。</li>
		<li>执行 &#34;RyR 密度图谱工具&#34; 在 MATLAB 的图形用户界面（GUI）中，此步骤将通过一种称为球形核强度估计器的方法，把第 5.3.1 步中 .txt 文件内模拟的兰尼碱受体（RyR）簇的空间位置映射到第 4.8 步生成的有限元网格上26. 
		注意：此步骤的输出是一个扩展名为 .txt 的文件，其中包含在每个计算网格节点处每单位球形体积内离子通道数值密度的数值列表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Noble, D., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://rsta.royalsocietypublishing.org/content/359/1783/1127">Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation.</a> Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).</li>
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<li>Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+reveals+a+continuous+network+linking+transverse-tubules%3A+this+organization+is+perturbed+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure.</a> Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).</li>
<li>LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+structure+of+the+heart%3A+a+mathematical+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laminar structure of the heart: a mathematical model.</a> Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).</li>
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<li>Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+organization+of+t-tubules%2C+sarcoplasmic+reticulum+and+ryanodine+receptors+in+rat+and+human+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Clinic.+Exp.+Pharmacol.+P%22%5BJournal%5D)">Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium.</a> Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).</li>
<li>Bradley, C., Bowery, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenCMISS%3A+a+multi-physics+%26+multi-scale+computational+infrastructure+for+the+VPH%2FPhysiome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project.</a> Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述方案概述了构建心肌细胞超微结构新型有限元几何模型的关键步骤。该方法能够计算融合不同的显微成像技术（或原则上其他数据）模态，从而建立更全面的心肌细胞动力学计算模型，其中包含细胞空间结构的详细信息。目前尚无其他可用的方案来创建此类心肌细胞模型。
步骤1概述了灌注固定的方案。或者，也可将心脏切除后分割成较小的组织块，并浸入固定液中。然而，该过程必须迅速完成，且结果可能因样本大小而异。根据作者的经验，灌注法可确保固定液充分渗透至组织和细胞内部。作者此前还曾使用克雷布斯-亨塞莱特（Krebs-Henseliet）溶液对心脏进行灌注，以在固定前使其跳动，从而可在固定前对工作状态的心脏进行测量。
步骤2中的透射电子显微镜处理步骤是电子断层扫描的典型流程。当使用其他成像技术（如连续块面扫描电子显微镜或聚焦离子束显微镜）时，所用处理溶液的用量（尤其是染色液）以及处理时间可能有所不同28。所获得的电子显微镜图像必须分割成不同的细胞器区域，例如线粒体、肌原纤维和横小管。该分割过程可手动完成，也可采...

心脏中的兴奋-收缩耦联（ECC）是指心肌细胞膜的电兴奋与每次心跳过程中细胞机械收缩之间重要而复杂的耦合关系。数学模型在定量理解调控动作电位1、胞质钙信号2、生物能量学3以及后续收缩力生成的相互关联的生化过程中发挥了关键作用。这些模型还成功预测了当一个或多个此类生化过程发生改变时心跳特性的变化4,5。心肌细胞高度有序的超微结构 increasingly 被认为在细胞及整个心脏的正常收缩功能中起着至关重要的作用。事实上，在肥厚6、心力衰竭7和糖尿病性心肌病8等疾病状态下，心脏超微结构组分的形态和组织变化与生化改变同时发生。这些结构变化是轻微的、适应性的，还是对生化环境改变的病理性反应，目前仍 largely 不清楚9。生物学中结构与功能之间固有的紧密耦联意味着，仅靠实验研究无法提供超越结构重塑与心肌细胞功能之间相关性的深层见解。要全面、定量地理解心肌细胞中结构、生化过程与收缩力之间的关系，亟需新一代能够整合亚细胞组分结构组装特征以及已被深入研究的生化过程的数学模型。本实验方案描述了可用于构建结构精确的心肌细胞有限元模型的方法，以支持此类研究。
过去十年中，三维电子显微镜10、共聚焦显微镜11以及超分辨率显微镜12取得了显著进展，为心肌细胞亚细胞结构在纳米尺度和微米尺度上的组装提供了前所未有的高分辨率洞察。最近，这些数据集已被用于构建心肌细胞超微结构的计算模型13,14,15,16。这些模型采用一种成熟的工程模拟方法——有限元方法17，生成有限元计算网格，用于模拟生化过程和心肌细胞的收缩。然而，这些模型受限于显微成像技术在图像数据集中所能提供的分辨率和细节水平。例如，电子显微镜能够提供细胞结构的纳米级细节，但在图像中难以识别特定蛋白质，而这些蛋白质对于构建模型至关重要。另一方面，超分辨率光学显微镜仅能对细胞中少数特定分子组分提供约50 nm分辨率的高对比度图像。只有整合这些成像模式的互补信息，才能切实地探究功能对结构变化的敏感性。目前，关联光镜与电镜技术尚未成为常规流程，且仍受限于免疫荧光图像中只能对有限数量的组分进行染色，并与电子显微图像进行关联。
本方案介绍了一种新颖的方法18，该方法利用统计学方法19，将离子通道空间分布的光学显微镜信息与肌原纤维和线粒体等心肌超微结构组分的电子显微镜信息进行分析并计算融合。由此生成的有限元模型可与生化过程的生物物理模型结合使用，以研究心肌细胞亚细胞结构组织对调控心肌细胞收缩的生化过程所起的作用。例如，可利用本方案构建来自健康状态及链脲佐菌素诱导的糖尿病心肌细胞的模型，以研究在糖尿病动物模型中观察到的结构重塑对心肌细胞功能的影响8。本方案还展示了该方法在统计学特性方面的另一优势：该方法能够生成多个有限元几何结构实例，这些实例可高度模拟实验中观察到的细胞结构变异。
总体而言，实验方案步骤包括：（i）制备用于电子显微镜观察的心脏组织，以获得具有足够分辨率和对比度的三维图像；（ii）利用名为IMOD20的三维电子显微镜重建与图像分析软件，对电子显微镜数据中的三维图像序列进行重建与分割；（iii）使用iso2mesh21，以分割后的数据为输入生成有限元网格；（iv）利用新型算法和代码，将离子通道的分布映射到有限元网格上。
本方案中每一步骤的实施原理均在协议中进行了概述，并在附带的图示中提供了代表性结果。文中概述了如何利用所生成的空间精细模型来研究兴奋-收缩耦合过程中钙离子的空间动力学特性以及线粒体生物能量学。同时讨论了该方案目前存在的一些局限性，以及正在开展的新进展，旨在克服这些局限并进一步推动对细胞结构在心脏系统生物学中作用的定量理解。此外，还探讨了这些方法如何推广应用于构建其他细胞类型的有限元模型。
如果使用者已有现成的电子显微镜图像堆栈，可跳过步骤1以及步骤2中的重建部分。若使用者计划与经验更丰富的电子显微镜技术人员合作获取数据，建议在步骤1中与专家讨论并比较固定和染色程序，以确定最佳的数据采集方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛电镜级（500 ml 瓶装）</td><td>默克</td><td>354400-500ML</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>单宁酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040-500G</td><td>100克 EM级</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4593</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632-10ML</td><td>4% 水溶液，5 ml 瓶装（也可提供 10 ml 瓶装）</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td>25克装瓶</td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>默克密理博</td><td>104973</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>硼砂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>也称为硼砂</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>用纯水稀释至不同百分比</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>EM Sciences</td><td>RT10017</td><td></td></tr><tr><td>树脂试剂盒</td><td>EM Sciences</td><td>14040</td><td>ACM Durcupan 效果良好</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1号正常溶液</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Tecnai F30</td><td>http://www.leica-microsystems.com/</td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Proscitech</td><td>T752</td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>生物策略</td><td>75831-346</td><td>对于兰格多夫灌流装置，建议使用直径3 mm的导管，但并非必需</td></tr><tr><td>三通阀</td><td>SDR</td><td>QP13813</td><td>用于兰格多夫导管；该产品仅为示例，用户可选择任意产品</td></tr><tr><td>铁架台夹具</td><td>Proscitech</td><td>T715</td><td></td></tr><tr><td>塑料注射器</td><td>SDR</td><td>QPC1108</td><td>用于兰格多夫装置的溶液</td></tr><tr><td>7-0 丝线套管</td><td>TeleFlex</td><td>15B051000</td><td>用于将心脏固定在朗根多夫装置上</td></tr><tr><td>导管</td><td></td><td></td><td>由外径3 mm的钢针制成</td></tr><tr><td>橡胶培养皿垫</td><td>Proscitech</td><td>H068</td><td>用于固定心脏解剖时作为切板</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Proscitech</td><td>L056</td><td>用于将固定的心脏切割成小块以进行电镜处理</td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>生物策略</td><td>89000-236</td><td>用于在组织固定和电镜处理过程中储存溶液</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>生物策略</td><td>213-0477</td><td>用于临时储存溶液及灌注过程中使用</td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>生物策略</td><td>548-2170</td><td>用于组织样本在电镜处理过程中的处理</td></tr><tr><td>解剖工具包</td><td>Proscitech</td><td>T161</td><td>用于动物解剖</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Proscitech</td><td>WS3-02225S</td><td>用于醋酸铀酰的纯化</td></tr><tr><td>铝/银箔烤杯</td><td></td><td></td><td>从任何烘焙用品商店</td></tr><tr><td>Dupont 金刚石刀片</td><td>生物策略</td><td>102680-780</td><td>35度角版本可产生最佳切片。</td></tr><tr><td>胶体金</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC15</td><td>15 nm 胶体金</td></tr><tr><td>EM 网格载网</td><td>Proscitech</td><td>GCU150</td><td>可测试多种尺寸：例如 GCU150h、GCU200h</td></tr><tr><td>塑料一次性移液管</td><td>Proscitech</td><td>LCH20</td><td>最好使用一次性塑料制品，尤其是在处理树脂时</td></tr><tr><td>软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>博尔德大学</td><td></td><td>断层扫描采集</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>IMOD</td><td>博尔德大学</td><td></td><td>图像配准与分割</td></tr><tr><td>iso2mesh</td><td></td><td></td><td>可在 http://iso2mesh.sourceforge.net 获取</td></tr><tr><td>Fiji 或类似的图像处理软件</td><td>ImageJ</td><td>Fiji 就是 ImageJ</td><td>可在 https://fiji.sc 获取，用于二值图像序列的处理</td></tr><tr><td>RyR-Simulator 代码/数据</td><td>CellSMB 小组</td><td></td><td>可在 https://github.com/CellSMB/RyR-simulator 获取</td></tr><tr><td>心脏细胞网格生成器</td><td>CellSMB 小组</td><td></td><td>随 RyR-Simulator 位于文件夹中 &quot;图形界面版本&quot;</td></tr><tr><td>R 统计软件</td><td>R-project</td><td></td><td>从 https://www.r-project.org 下载</td></tr><tr><td>spatstat</td><td>R项目</td><td></td><td>通过 R 程序安装</td></tr><tr><td>rgl</td><td>R项目</td><td></td><td>通过 R 程序安装</td></tr><tr><td>doparallel</td><td>R-project</td><td></td><td>通过 R 程序安装</td></tr><tr><td>foreach</td><td>R项目</td><td></td><td>通过 R 程序安装</td></tr><tr><td>doSNOW</td><td>R-project</td><td></td><td>通过 R 程序安装</td></tr><tr><td>迭代器</td><td>R-project</td><td></td><td>通过 R 程序安装</td></tr></tbody></table>

创建心肌细胞的结构逼真有限元几何模型以研究细胞架构在心肌细胞系统生物学中的作用

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

随着电子断层扫描、连续块面扫描电子显微镜和共聚焦显微镜等三维（3D）成像技术的发展，科学界前所未有地获得了大量亚微米分辨率的数据集，这些数据能够表征健康与疾病状态下心肌细胞功能变化所伴随的细胞结构重塑。然而，这些数据集在研究细胞结构重塑对心肌细胞功能影响方面尚未得到充分利用&#160;。本实验方案旨在介绍如何利用高分辨率电子显微镜和共聚焦显微镜图像，构建一个精确的心肌细胞有限元模型。一个详细且准确的细胞结构模型具有巨大潜力，能够提供仅靠实验难以获得的心肌细胞生物学新见解。该方法的优势在于能够通过计算手段融合来自两种不同成像模态的心肌细胞超微结构信息，从而构建出统一而详尽的心肌细胞模型。本方案详细说明了整合成年雄性Wistar（一种白化大鼠品系的名称）大鼠心肌细胞的电子断层扫描与共聚焦显微镜图像，以建立心肌细胞半肌节有限元模型的步骤。该流程生成的三维有限元模型，能够以高分辨率（约~35 nm）精确呈现线粒体、肌原纤维以及兰尼碱受体簇的分布情况，后者负责将钙离子从肌浆网（SR）释放至肌原纤维和胞质区，从而触发心肌细胞收缩。本文所展示的示例模型未包含横小管结构或肌浆网网络的细节，因此属于心肌细胞的最小化模型。尽管如此，该模型已可用于基于模拟的研究，以探讨细胞结构在钙信号传导和线粒体生物能量学中的作用，本文在详细方案之后通过两个案例研究对此进行了说明和讨论。

图2 至 图7 展示了本实验方案中若干关键步骤的代表性结果：（i）对组织块进行可视化并重新定位，以获得横截面电子显微镜图像；（ii）生成三维电子显微镜图像序列；（iii）对目标细胞器的亚细胞超微结构进行分割；（iv）使用 iso2mesh 生成有限元网格；（v）在网格上模拟兰尼碱受体（RyR）簇的真实空间分布；（vi）随后将该空间分布映射为计算网格上的空间密度。
图2展示了典型的明场图像，显示了细胞相对于切面呈纵向（图2A，标记为L）、斜向（图2A，标记为O）和横截向（图2B）排列时的外观。斜向和纵...

本方案概述了一种利用电子显微镜和共聚焦显微镜图像构建心肌细胞细胞内结构高空间分辨率有限元模型的新方法。通过钙信号传导和生物能量学的案例研究，展示了该高空间分辨率模型的强大功能。

随着电子断层扫描、连续块面扫描电子显微镜和共聚焦显微镜等三维（3D）成像技术的发展，...

本实验的总体目标是构建一个空间细节精确的心肌细胞内结构有限元模型。该模型基于电子显微镜和共聚焦显微镜数据构建而成。此类模型可用于研究细胞结构对心肌细胞功能的影响。该方法有助于解答有关细胞内部结构变化以及健康与疾病状态如何影响心肌细胞系统生物学的关键问题。此方法的主要优势在于，它能够整合来自电子显微镜和共聚焦显微镜的互补信息，从而构建出细胞结构的空间精细模型。尽管该方法可为心肌细胞系统生物学提供深入见解，但这种总体策略也可应用于其他需要理解细胞结构对细胞功能影响的细胞类型。该方法的可视化演示至关重要，因为将离子通道模拟并映射到更精细的单元网格上的步骤是全新的。在制备左心室游离壁组织切片并根据文本方案使用电子断层扫描技术进行成像后，运行 IMOD 程序 3dmod。在图形用户界面中，将包含细胞三维重建图像数据集的 rec 或 mrc 文件的地址输入标有“Image Files”的输入框，然后按“Okay”。接下来，在文件菜单下选择“新建模型”。然后，通过“另存为模型”菜单项，使用适当的名称保存文件。在“特殊”菜单下选择“绘图工具”，然后选择“雕刻”选项，并将鼠标移至图像窗口。一个以鼠标指针为中心的圆形轮廓将出现。在图像文件中较暗的线粒体区域上，按住鼠标中键，拖动圆形轮廓的边缘，使其形状与线粒体边界一致。完成线粒体边界的轮廓绘制后，松开鼠标中键，并对数据中的每个线粒体重复此过程。每个轮廓将被 IMOD 自动识别为同一对象中的新轮廓。在“编辑对象”菜单下，选择“新建”以创建一个新对象。这将使对象总数自动增加一，并将此编号分配给新对象。使用 Sculpt 选项来分割并保存肌原纤维轮廓。同时分割细胞边界，然后在文件菜单下保存模型文件。根据文本协议下载 iso2mesh 后，从此处所示的 GitHub 网站下载源代码和数据，以在网格上模拟兰尼碱受体（RyR）簇。启动 Cardiac Cell Mesh Generator MATLAB 应用程序。然后，使用图形用户界面左上角的三个按钮，将不同的细胞器组分掩膜加载到 MATLAB 中。为了创建另一个用于划分肌原纤维与线粒体之间间隙的二值图像序列，请打开 ImageJ，然后通过“文件打开”对话框，将肌原纤维和线粒体的 TIFF 图像序列加载到程序中。通过选择“Process Calculator Plus”启动图像加法插件。将肌原纤维图像堆栈选为I1，线粒体图像堆栈选为I2，并选择“Add”操作符，然后点击“Okay”。当显示代表结果的新图像堆栈后，选择“Edit Invert”以生成图像堆栈。通过点击“心肌细胞网格生成器”程序中的 RyR 间隙文件按钮，加载包含肌原纤维与线粒体之间间隙的二值图像堆栈文件，然后在图形用户界面（GUI）中点击生成网格。通过点击 GUI 上标注为“生成 RyR-Simulator 输入”的按钮，生成 RyR-Simulator 所需的输入文件。函数执行完毕后，请检查是否已在指定为 OUT_DIR 路径的目录中成功生成 d_axial_micron 文件。txt 文件，表示 Z 盘位置与图像堆栈中其余像素之间的轴向距离；d_radial_micron.txt 文件，表示从可能的 RyR 聚集体位置集合中的每个像素到 Z 盘平面上像素的欧几里得距离（不包括轴向分量）；W_micro.txt 文件，表示所有可用于 RyR 聚集体存在的空间坐标的列表。文件夹中的其余三个文件使用后缀 pixel 而非 micron，表示这些文件中的数值是以像素坐标形式写出的。为了在肌原纤维的二值图像堆栈上模拟兰尼碱受体（RyR）簇的分布，请点击标记为“Open RyR-Simulator in R”的按钮，以启动 R 程序。在 R 的图形用户界面中，选择“File”菜单下的“Open”，然后在 RyR-Simulator 软件包中找到 settings 文件。R.有关此字段中参数及默认值的详细说明，请参阅文本方案。用户应检查R窗口中RyR簇的模拟分布，并调整设置，以确保簇位于Z盘附近，并在整个细胞横截面上均匀分布。若要使用心肌细胞网格生成器将点映射为计算模型上的空间密度，请单击标记为“Select RyR Points File”的按钮，并从RyR-Simulator输出的模拟RyR簇分布文本文件中选择一个文件。最后，在 MATLAB 的图形用户界面中运行 RyR 密度映射程序。用户应通过视觉检查确认密度值的分布情况，确保高密度值区域的范围与实验数据中 RyR 聚集体的大小相似。这些明场图像展示了细胞相对于切面呈纵向、斜向和横截面方向时的形态。斜切和纵切样本均显示出条纹状结构，而横切样本则无此特征。在横切面视图中，毛细血管呈现较接近圆形的形态，而在斜切面视图中则不然。该图显示了按照本实验方案的组织制备步骤操作后可获得的高质量断层成像序列。确保组织块染色充分，并且胶体金颗粒在组织体积内均匀分布，需要细致的操作和丰富的经验。图中显示的是肌原纤维和线粒体的分段三维模型。该四面体网格的三维渲染图由 iso2mesh 生成。只要原始图像堆栈和分割任务的质量良好，此步骤就具有较强的稳健性。最后，这些图示展示了在使用球形核强度估计器算法后，同一网格拓扑上模拟的三种兰尼碱受体（RyR）簇的示例。请注意RyR簇在组织结构上的差异。一旦掌握并正确操作，利用我们的技术可在数小时内构建出结构逼真的心肌细胞有限元模型。通过该方法，可开展钙信号传导、心脏生物能量学及细胞力学的有限元模拟，以探究细胞结构对心肌细胞功能的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

建立一种结构逼真的心肌细胞的有限元几何模型研究蜂窝结构在心肌系统生物学中的作用

在本实验方案中，我们展示了利用毛细力光刻技术，采用两种不同的高分子材料制备仿生心脏细胞培养基质的方法。in vitro 和 in vivo...

毛细力光刻技术在心肌组织工程中的应用

导致先天性心脏缺陷的突变需要在发育过程中对心脏结构进行体内研究，但在小鼠胚胎心脏中开展高分辨率的结构研究在技术上具有挑战性。本文介绍了一种可靠的免疫荧光与图像分析方法，用于评估发育中小鼠心脏中心肌细胞特异性结构。...

小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

本方案描述了用于临床前药物测试的人类心脏切片的切片与培养步骤，并详细说明了如何利用光学标测技术同步记录这些切片中的跨膜电压和细胞内钙信号。...

利用人源类器官心脏切片的双电压与钙光学标测进行临床前心脏电生理学评估

本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。...

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本文提出了一种针对暴露于电场（EF）的纤维导电材料构建有限元模型的策略。这些模型可用于估算接种在该类材料中的细胞所接收到的电学输入，并评估改变支架的组成材料特性、结构或取向所产生的影响。...

细胞电微环境的有限元建模

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外...

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

基于血管内超声图像的有限元建模方法用于量化人冠状动脉的体内力学特性

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

我们介绍一种利用嵌入铁颗粒的超软硅胶弹性体（聚二甲基硅氧烷，PDMS）制备的动态且可逆刚度检测平台。该新型检测方法适用于研究细胞表型中出现的时间依赖性物理变化，包括接触引导效应。在此，我们通过磁力作用诱导基质刚性化，测量新生大鼠心肌细胞的排列情况。...

微图案化磁流变弹性体驱动心肌细胞排列变化

了解如何利用电子显微镜和共聚焦显微镜数据建立心肌细胞有限元模型，以研究细胞结构对心脏功能的影响。该方法整合互补成像技术，为心血管生物学研究提供新工具。

创建心肌细胞的结构逼真有限元几何模型以研究细胞架构在心肌细胞系统生物学中的作用

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