通过核糖体图谱分析对芽殖酵母进行全基因组翻译定量分析

本实验的主要目标是鉴定信使RNA（mRNA）中哪些区域被翻译成蛋白质，并在全基因组水平上对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的蛋白质翻译进行定量测量。核糖体谱分析可用于监测蛋白质合成速率及其在疾病中的变化，也可用于研究翻译调控的分子机制。该技术的主要优势在于，与其他方法相比，其灵敏度显著提高，尤其能够在单核苷酸分辨率下对活体内的蛋白质合成及疾病相关过程进行测量。

尽管本实验方案专为芽殖酵母设计，但对于试图在其他模式系统（如哺乳动物细胞和组织）中建立核糖体谱分析的研究人员也同样具有参考价值。提取物将从生长至对数中期的酵母细胞中制备。使用玻璃滤器组件通过0.45 µm膜滤器过滤培养物。

用刮勺刮取沉淀，液氮速冻，并于-80摄氏度保存。将三颗直径为3.2毫米的铬钢珠放入1.8毫升不锈钢管中，并将管子在液氮中预冷。加入冷冻的沉淀物，用硅橡胶帽盖住钢管。

以4200 rpm的转速进行冷冻研磨10秒以均质化样品。为确保整个研磨过程中样品保持冷冻状态，每次研磨之间必须将离心管置于液氮中预冷至少10秒。均质化完成后，向样品中加入1毫升含有环己酰亚胺的裂解缓冲液。

用移液器充分混匀，将样品转移至新的1.5毫升离心管中。在4°C条件下，以20,000 × g离心5分钟。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。

取100微升裂解液转移至另一个新的1.5毫升离心管中，用于poly(A)mRNA的分离。将含有mRNA样品的剩余裂解液分装管在液氮中速冻，并于-80摄氏度保存，用于后续的核糖体印迹提取。在进行核糖体印迹提取的前一晚，于4摄氏度条件下解冻先前制备好的蔗糖梯度。

次日，将细胞裂解液置于冰上解冻。取含有 50 OD260 单位的细胞裂解液等分试样，转移至新的 1.5 毫升离心管中，加入新鲜裂解缓冲液至总体积为 1 毫升，并加入 10 微升 RNase One。在室温下，使用翻转混匀仪轻柔旋转孵育 1 小时。

接下来，将裂解液样品轻轻铺加到聚合物管中10%至50%的蔗糖梯度溶液上方。使用SW41 ti转子，在4°C条件下以35,000 rpm超速离心3小时。在超速离心过程中，设置梯度分馏系统。

打开各组件，使紫外监测仪预热至少30分钟。用追加溶液填充注射器，并去除注射器和套管内的所有气泡。超速离心完成后，安装并穿刺含有蔗糖梯度的超速离心管。

以每分钟1毫升的流速启动注射泵，同时监测A254值并收集每1毫升的组分。收集代表ADS单体峰的组分并合并。将合并后的组分通过0.5毫升离心过滤器，在4°C、12,000 ×g条件下离心10分钟，弃去滤过液，重复此步骤直至体积小于100 µL。

加入400微升洗脱缓冲液，用移液器吹打混匀，冰上孵育10分钟。将套管转移至新的收集管中，在4°C、12,000 × g条件下离心10分钟。收集穿流液。随后，纯化足迹片段，并按照文本方案中所述，采用乙醇沉淀法沉淀样品。

开始此实验步骤时，将沉淀的足迹法产物和片段化的 mRNA 样品在 20,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟。去除乙醇并空气干燥沉淀后，将每个沉淀重悬于 7.75 µL 水中。向每个沉淀中加入 1 µL 10×T4 多核苷酸激酶缓冲液、1 µL T4 多核苷酸激酶和 0.25 µL RNase 抑制剂。

在37摄氏度孵育一小时。向每份足迹（footprint）和mRNA样品各取10微升，加入10微升2X TBE尿素上样缓冲液。将样品及相应的对照在75摄氏度孵育三分钟，离心，然后置于冰上一分钟。

将每个样品加入到15% TBE尿素凝胶的两个孔中，在180伏电压下进行电泳分离RNA片段，持续1小时。用核酸染料染色凝胶，避光孵育5分钟。在蓝光透射成像仪下观察凝胶时，切下对应于足迹样品28至32个核苷酸之间以及mRNA样品约50至70个核苷酸大小的条带。

在从聚丙烯酰胺凝胶中提取 RNA 之前，将切下的聚丙烯酰胺凝胶条置于 -80 摄氏度冷冻至少 10 分钟。在进行逆转录之前，按照文本方案中所述进行 3' 端接头连接，并对样品进行沉淀处理。将每个沉淀物重悬于 11.5 µL 无核酸酶的水中。

然后加入0.5 µL的8 µM逆转录引物和1 µL的dNTP混合物。在65 °C孵育5分钟，随后置于冰上。向每个样品中加入4 µL的5×第一链缓冲液、2 µL的0.1 M DTT、0.5 µL RNase抑制剂和0.5 µL逆转录酶。

在 48 摄氏度孵育 30 分钟，65 摄氏度孵育 1 分钟，80 摄氏度孵育 5 分钟。立即进行 RNA 水解：向每个样本中加入 0.8 µL 2 M 氢氧化钠，并在 98 摄氏度孵育 30 分钟。加入 0.8 µL 2 M 盐酸以中和反应。

按照文本方案中所述沉淀样品后，将每个沉淀物重悬于5 µL无核酸酶水中，并加入5 µL 2×TBE尿素上样缓冲液。在75 °C孵育3分钟，离心收集，冰浴1分钟。将样品上样至10% TBE尿素凝胶的一个加样孔中。

将逆转录反应产物通过凝胶电泳分离，180伏特下电泳50分钟。用核酸凝胶染色剂避光染色5分钟。使用蓝光透射仪，切下约128个核苷酸及更大片段的条带。

在从聚丙烯酰胺凝胶中提取DNA之前，将聚丙烯酰胺凝胶切片置于-80摄氏度冷冻至少10分钟。为环化DNA，将每个DNA沉淀重悬于16.75 µL无核酸酶的水中。加入2 µL 10×单链DNA连接酶缓冲液、1 µL 50 mM氯化锰和0.25 µL单链DNA连接酶。

在60摄氏度孵育1小时，随后在80摄氏度孵育10分钟。单链DNA连接反应产物无需沉淀，于-20摄氏度保存。随后，按照文本方案中所述进行PCR文库扩增，接着进行文库定量和高通量测序。

展示了mRNA样本的PCR扩增后足迹文库和测序文库的代表性生物分析仪图谱。足迹文库的预期平均大小为148至152个核苷酸，mRNA文库的预期大小为170至190个核苷酸。该图显示了野生型样本和hbs1缺失突变体两个独立生物学重复实验中获得的mRNA、足迹和rRNA测序读段的总数。

在足迹文库中，50%至60%的测序读段对应于核糖体保护的足迹片段。相比之下，在mRNA文库中仅观察到3%的rRNA片段，表明poly(A) mRNA分离可有效去除rRNA读段。足迹文库和mRNA样本文库均表现出良好的重复性，匹配样本间的皮尔逊相关系数约为0.99。

将核糖体谱分析与 mRNA 表达量测定相结合，可实现对不同实验条件下翻译效率变化的测量。在 hbs1 缺失突变体中显著上调和下调的基因，根据其是否受到 mRNA 转录、翻译效率变化或共同效应的影响进行分组。掌握该技术后，整个实验方案可在约 11 天内完成。

在进行该实验操作时，务必注意佩戴手套，并全程使用无RNase的试剂和耗材，以避免RNase污染，降低样本中RNA降解的风险。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过核酸酶消化生成核糖体保护片段，利用蔗糖梯度离心分离完整的核糖体保护复合物，以及构建用于深度测序的DNA文库。请务必注意，操作液氮具有极高的危险性，在接触极低温物质时，必须采取佩戴护目镜和低温手套等安全防护措施。