使用软件和冷却装置进行鱼类精子评估
2018年7月28日
本议定书描述了一种使用计算机辅助精子分析和冷却装置进行鱼类精子评估的程序。该软件对基于精子运动的鱼类精子质量进行了快速、准确和定量分析, 可作为水产养殖中提高繁殖成功率的有用工具。
该程序的主要目标是根据精子运动分析鱼精子质量，以便为成功的人工受精做出贡献。我是瓦伦西亚大学教授兼 PROiSER R+D 科学主任 Carles Soler 博士。我是 Carina Caldeira，来自 Impress Project 的研究员。
CASA 技术是几十年前开发的，用于通过使用计算机辅助精液分析对哺乳动物物种进行精液分析。对于鱼，需要考虑两件事。第一个是这些动物通常在 4 度左右的低温下受精，因此，不可能在家中分析精液，但需要开发特定的工具来冷藏样品。
另一个问题是激活后运动下降得非常快，需要分析这一事实，以确定什么是分析质量或精液质量的好时机。因此，我们将展示鱼精子的分析，该方案将是哺乳动物方案的修改，并将包括使用 So 的运动分析，让我们开始吧。对鱼进行麻醉以注射激素，并在 24 小时后收集精子样本。
清洁生殖器区域以避免污染。通过施加轻柔的压力来收集精子。精子样本保持在 4 度，直到进行运动分析。
稀释剂和活化剂是事先准备好的。将冷却器模块设置为 4 度，以保持样品处于恒定温度。等到它稳定下来。
使用每个物种专用的稀释器稀释精子样品。对于欧洲鳗鱼，精子在 P1 培养基中以 1：50 的比例稀释。准备 500 微升稀释的精子，加入 450 微升 P1 和 50 微升新鲜精子样本。
搅拌均匀。取四分之一活化剂溶液，放入冷却器块中。将较冷的阶段设置为四度。
等到它稳定下来。选择 motility module，如有必要，使用名称和密码。选择 properties （属性）。
单击 species，然后选择 fish。选择每秒帧数和要使用的图像数量。必须使用负对比度。
选择相应的计数室和秤。对于每个物种，调整颗粒面积和连通性。对于欧洲鳗鱼，最小颗粒面积应为 2，连通性应为 7。
保存配置。打开捕获。取 4 微升活化剂溶液，放入腔室中。
将稀释的精子匀浆。取 5 微升精子，与活化剂混合。盖上盖子。
聚焦样本，并找到最佳视觉区域。选择 Capture video （捕获视频） 以获取精子轨迹，这些轨迹根据速度进行分离。可以捕获更多字段。
选择 Capture 并像以前一样继续。单击 exit 以获取所有字段的一般视图。在激活后的特定时间间隔捕获精子。
然而，对每个时间间隔重复进行精子分析。每个时间间隔的 partial report 可以通过选择 fields 并单击 partial 来获取。Excel 工作表提供精子轨迹的部分数据、图表和图像的平均值。
对其他字段重复相同的过程。另一个选项是常规数据。这些数据提供了所有领域的单个精子的动力学值。
使用部分报表，可以使用饼图立即比较不同时间的移动百分比和渐进性。一般数据提供了使用动力学参数获得多个统计分析的选项。精子轨迹给出三个参数。
VCL，曲线速度，VSL，渐进速度和 VAP，路径速度。VCL 是最重要的参数，它随每秒帧数的变化而变化。通过增加帧数，VCL 也会增加，从而实现近乎完美的轨迹分析。
最佳帧速率可能因物种而异。目标是找到 VCL 的最高值，之后可能会观察到与其他工具（例如计数室）的任何潜在差异。亚群目前是一项重要的统计分析，它提供了有关精子样本的更多信息。
这是大西洋鲑鱼精子样本的一个例子。在圈养产生的不同世代中可以观察到不同的精子亚群。我们已经展示了如何使用计算机系统进行鱼精子分析，以及如何优化技术和方法方面，如计数室、温度和帧速率。
因此，有了这些数据，我们可以在不同领域进行大量分析，例如鱼类养殖，不仅适用于水产养殖，还用于保护计划、系统发育研究或增加对精子种群的了解。所以，我希望这个协议能对你的学习有所帮助。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本协议概述了一种通过计算机辅助精子分析（CASA）和冷却设备评估鱼类精子质量的方法。它旨在通过提供快速和准确的精子运动性评估来提高水产养殖的繁殖成功率。
关键研究组成部分
科学领域
- 水产养殖
- 繁殖生物学
- 精子分析
背景
- 鱼通常在大约四摄氏度的低温下受精。
- 由于温度要求，标准精液分析方法不适用于鱼类。
- CASA技术最初是为哺乳动物物种开发的。
- 分析过程中需要特定工具来冷藏鱼类精子样本。
研究目的
- 基于精子运动性分析鱼类精子质量。
- 为水产养殖中的人工授精成功做出贡献。
- 通过准确的精子评估改善繁殖结果。
使用的方法
- 计算机辅助精子分析（CASA）技术。
- 分析过程中保持低温的冷却设备。
- 精子运动性的定量分析。
- 精子质量的快速评估。
主要结果
- 成功实施CASA用于鱼类精子分析。
- 证明了温度控制在精子评估中的重要性。
- 提供了一种评估精子运动性的可靠方法。
- 为改进人工授精技术做出了贡献。
结论
- 该协议为水产养殖研究提供了一个有价值的工具。
- 准确的精子分析可以提高繁殖成功率。
- 未来的应用可能包括更广泛的物种评估。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of fish sperm motility is critical for optimizing artificial fertilization in aquaculture breeding programs. Computer-assisted sperm analysis (CASA) combined with temperature-controlled cooling devices enables rapid, quantitative evaluation of sperm quality under physiologically relevant low-temperature conditions. This approach supports predictive confidence in gamete viability and reduces biological risk in reproductive workflows for species with short motility windows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sperm motility as a functional biomarker for gamete quality and fertilization potential.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible motility measurements under controlled low-temperature conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative kinetic parameters (VCL, VSL, VAP) for objective sperm motility assessment across time intervals.
- Operational Value: Supports assay standardization through species-specific configuration of particle area, connectivity, and frame rate settings.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates comparison of sperm subpopulations across generations or breeding lines for genetic selection programs.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of motility parameters to inform optimal timing for gamete collection and activation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into aquaculture reproductive pipelines by providing motility data that informs gamete selection, breeding decisions, and conservation strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on sperm motility dynamics and subpopulation distribution under activation conditions.
- Screening: Delivers standardized, reproducible motility outputs for evaluating sperm quality across experimental conditions.
- Analytics: Generates track-based kinetic parameters and subpopulation analysis for comparative sperm quality assessment.
- Translational Research: Connects motility data to fertilization success in artificial breeding and species conservation programs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sperm quality assessment adaptable to multiple fish species through configurable software and cooling parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in gamete quality through objective motility and subpopulation analysis.
- Operational Value: Standardized, temperature-controlled workflow ensuring reproducibility across laboratories and time points.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in gamete selection, reducing waste in artificial fertilization attempts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of breeding lines based on quantitative sperm quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in sperm handling, dilution, and activation protocols specific to fish species.
- CASA software with motility module and cooling hardware capable of maintaining 4°C during analysis.
- Standardization of diluents, activators, and chamber types across users and facilities.
- Adaptation of particle area, connectivity, and frame rate settings to species-specific sperm morphology and motility characteristics.
- Limitation: Short motility window post-activation requires rapid sample processing and analysis.
