Name: 使用软件和冷却装置进行鱼类精子评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习使用计算机辅助精子分析（CASA）和冷却装置评估鱼类精子质量，通过控制低温环境实现快速准确的精子活力检测。该方法有助于提高水产养殖人工授精的成功率和繁殖效率。

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本项目获得了欧洲合作科学与技术协会（COST Association）的资助（农业与食品领域COST行动FA1205：AQUAGAMETE），以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里项目IMPRESS（资助协议编号：642893）。我们谨向PROiSER项目的科研团队表示感谢，特别感谢学生Alberto Vendrell Bernabéu积极参与本项目的视频录制工作。

涉及动物受试者的实验程序已获得瓦伦西亚理工大学农业生产和畜牧业总务处的批准（编号：2015/VSC/PEA/00064）。
1. 采集人工养殖的成熟欧洲鳗鱼的精子
注意：使用在海水和循环系统中饲养且温度恒定（20 °C）的欧洲鳗鲡雄鱼。通过每周一次的腹腔注射给予激素处理（人绒毛膜促性腺激素（hCG），剂量为每克鱼体重1.5 IU）。将鱼逐步适应海水环境，起始时在淡水中饲养3天，之后每隔2天更换1/3体积的总水量为海水，直至盐度达到37.0 g/mL。
<ol>
	<li>在激素注射后24小时对鳗鱼进行麻醉，以获得精子质量更佳的样本。
	<ol>
		<li>预先配制麻醉剂：将300 mg苯佐卡因加入100 mL 70%乙醇中，充分混合后于4 °C保存。</li>
		<li>在容量为5 L的塑料桶中，用系统水稀释苯佐卡因，使其终浓度为60 mg/L，并充分混匀。</li>
		<li>将鱼转移至含有系统水和苯佐卡因的桶中，静置数分钟，直至鱼体活动平静。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用水清洗生殖区域，并用吸水纸擦干，以避免粪便、尿液或海水污染精子样本。</li>
	<li>轻轻按压腹部区域，使用真空泵将精子收集至15 mL塑料管中。精子体积可达6–7 mL，具体取决于个体雄鱼。</li>
	<li>将精子样本置于4 °C环境中至少1小时，待进行活力分析。</li>
</ol>
2. 冷藏并稀释精子样本
<ol>
	<li>提前准备好稀释液。 
	注意：精子样本应使用针对每种物种特异的稀释保存液进行稀释。
	<ol>
		<li>制备鳗鱼精子样本的非激活培养基（P1 培养基）。将 0.42 g 碳酸氢钠、1.828 g 氯化钠、0.127 g 氯化镁、0.56 g 氯化钾和 0.037 g 氯化钙加入 250 mL 蒸馏水中，充分混匀至溶解。于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将冷却块设置为 4 °C，以维持样本温度恒定。等待温度稳定。</li>
	<li>使用针对每种物种特异的稀释液对精子样本进行稀释。 
	注意：稀释比例因物种而异，必须明确以标准化实验流程。首先，根据使用软件在运动能力预分析中获得的浓度估算精子浓度，具体方法见步骤 3 和 4。通过该分析，还可根据运动率百分比筛选出最佳的精子样本。完成此步骤后，研究人员即可选用浓度合适且质量最佳的样本开始实验数据采集。
	<ol>
		<li>将鳗鱼精子样本按 1:50 的比例在 P1 培养基中稀释。为制备 500 µL 稀释后的鳗鱼精子，加入 50 µL 新鲜精子样本和 450 µL P1 培养基，充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 评估精子运动参数
<ol>
	<li>设置软件的运动性分析模块
	<ol>
		<li>将冷却载台设置为 4 °C，并等待其温度稳定。</li>
		<li>打开软件并选择 运动性分析模块。如有需要，创建用户名和密码。</li>
		<li>选择 属性，并在开始精子分析前设定所需的参数。
		<ol>
			<li>点击 物种 | 鱼类。</li>
			<li>根据各物种的最佳技术条件选择 每秒帧数 和 图像数量。将两个选项均设为每秒 120 帧。</li>
			<li>选择负反差模式。这是准确重建精子运动轨迹的必要条件16。</li>
			<li>选择相应的 计数室 和视频显微镜的 标尺。根据实验所用物镜的放大倍数校准视频显微镜。设置计数室为 SpermTrack10，标尺为 10X。 
			注：通常情况下，计数室深度为 10 µm，物镜放大倍数为 10X 是推荐条件，因为这能更好地聚焦所有精子，并捕获最多数量的细胞。然而，建议针对每种物种预先研究其运动性分析的最佳条件。</li>
			<li>针对每种物种调整 颗粒面积 和 连接距离。将最小颗粒面积设为 2 µm2，连接距离设为 7 µm。 
			注：对于鱼类，颗粒最小面积范围通常在 2–5 µm 之间，而连接距离取决于精子运动速度和帧率。</li>
			<li>保存设置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择 采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用软件分析欧洲鳗鲡精子
	<ol>
		<li>通过将 0.946 g 商业海盐加入含 2% BSA 的 25 mL 蒸馏水中，配制激活液（人工海水）。</li>
		<li>取 500 mL 激活液（人工海水）置于冷却块中。 
		注：通常鱼类精子通过渗透压冲击激活，但对某些物种而言，离子浓度也可能起重要作用。对于淡水物种，激活液应为低渗溶液；而对于海水物种，激活液应为高渗溶液。</li>
		<li>将计数室置于冷却载台上，并等待温度稳定至 4 °C。</li>
		<li>混合激活液与稀释后的精子以激活精子，并在激活后 5–10 秒内开始录制精子运动视频。
		<ol>
			<li>取 4 µL 激活液加入计数室中。</li>
			<li>轻轻振荡离心管 3 次，使稀释后的精子均匀混合，避免损伤精子细胞。</li>
			<li>取 0.5 µL 稀释后的精子，与激活液混合后迅速盖上盖玻片。 
			注：此步骤应在 5 秒内完成，以便尽快开始分析。</li>
			<li>聚焦精子细胞，寻找最佳观察区域，即精子数量较少（150 至 200 个细胞）的区域，以避免细胞间轨迹交叉（补充图 1A）。选择 采集视频 以获取按速度区分的精子运动轨迹。</li>
			<li>选择 采集 以获取 3 至 7 个视野，这是获得较低结果变异性的最佳区间，操作方式同前。在激活后 120 秒内完成视频录制，以避免计数室盖片上产生冷凝水。</li>
			<li>选择 退出 以查看所有视野的总体情况。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 获取运动性数据
<ol>
	<li>选择 字段 | 部分 | 保存，并选择一个文件名。点击 保存。 
	注意：电子表格提供部分数据的平均值、精子运动轨迹的图表和图像。</li>
	<li>选择 总览数据 | 文件名 | 保存。 
	注意：这些数据提供所有视野中各个精子的运动学参数值。</li>
</ol>

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<li>Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+and+subpopulations%27+structure+definition+of+blue+fox+%28Alopex+lagopus%29+sperm+motility+using+the+ISASV1+CASA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system.</a> Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).</li>
<li>Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermiogram+and+sperm+head+morphometry+assessed+by+multivariate+cluster+analysis+results+during+adolescence+%2812-18+years%29+and+the+effect+of+varicocele%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+sperm+head+morphometry%3A+its+diversity+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution.</a> Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).</li>
<li>Valverde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+and+subpopulation+structure+of+Holstein+bull+spermatozoa%3A+variations+in+ejaculates+and+cryopreservation+straws%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中使用的精子分析软件已被全球研究人员应用于包括鱼类在内的多种物种。然而，鱼类具有一些可能影响精子评估的特定特征。鱼类精子在激活瞬间表现出高速运动，但其活力迅速下降，导致激活后运动时间较短。此外，繁殖温度因物种而异，在某些情况下可能低至 4 °C2,4,8,12。因此，有必要对计算机化系统进行一些调整，以提高其在鱼类精子分析中的效率。精子运动参数的基本原理是对活动精子的连续图像进行采集和分析。由于软硬件的限制，大多数系统采用标准帧率（16、25、30、50 或 60 fps）17,18,19,20,<su...

生殖效率取决于配子（卵子和精子）的质量1,2。这是决定受精是否成功并产生可存活后代的主要因素3,4。对配子质量进行便捷评估是判断个体生育潜力的最佳手段。
将多个雄性的精子混合是许多水产商业物种生产中的常见做法4。然而，不同雄性之间的精子存在差异，可能导致精子竞争，因此并非所有雄性对基因库的贡献均等5。在此背景下，对单个精液或精子特征（如运动能力）进行准确评估，对于获取有关个体雄性生育潜力的区分性信息至关重要。直接观察精子运动能力可能产生不准确且主观的数据，因其需要时间和经验，从而导致结果缺乏一致性和可比性6,7。然而，目前已存在多种创新、快速且定量的技术，可提供可靠的精子质量分析2,4。
计算机辅助精子分析技术的发展旨在提供关于精子质量的准确数据8。该技术包括与相差显微镜配套使用的软件开发，可用于评估精子的运动能力。然而，影响运动参数准确性的一个限制因素是摄像机的帧率。单个精子的运动轨迹基于视频记录连续帧中精子头部中心点的位置变化，该变化与鞭毛运动模式相关3,9,10,11。主要测定的动力学参数包括直线速度（VSL）、曲线速度（VCL）和平均路径速度（VAP）。VSL 是指精子运动起点与终点之间的直线距离除以时间。VCL 是指精子沿其实际轨迹行进的真实速度。VAP 是指沿轨迹经平滑处理后路径的运动速度。这些参数可进一步提供其他动力学信息，包括直线性（LIN）、前向性（STR）、摆动性（WOB），以及如精子头部侧向摆动幅度（ALH）和鞭打交叉频率（BCF）等鞭打相关测量指标4,10。
精子分析系统最初用于哺乳动物物种，该系统的一个要求是在供体体温（约37 °C）下运行。该软件也可用于鱼类物种，但需要进行一些调整，以减少精子分析结果的误差。在某些鱼类物种中，例如鲑科鱼类和鳗鱼8,12，受精发生在低温条件下（约4 °C）2,4。因此，应开发冷却装置，以避免操作时产生不适的工作环境。此外，鱼类精子在精液中处于不活动状态，需要渗透压冲击来激活其运动能力。对于淡水物种，激活介质应具有低渗渗透压，而对于海水物种，介质则应为高渗。然而，对于某些物种（如鲑科鱼类），离子浓度也可能至关重要3,4,9。激活后，鱼类精子表现出运动能力迅速下降（少于2分钟）13,14且运动速度较高的特征，因此确定最佳帧率以获得可靠数据显得尤为关键15。
本研究的目的是设计并应用适用于鱼类精子样本的制冷系统。此外，本方案还定义了如何根据物种确定建立标准方案所需的最优帧率。通过使用欧洲鳗鱼作为模型，该方案为鱼类精液评估领域开辟了新的途径。

<table><tbody><tr><td>人绒毛膜促性腺激素</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>hCG</td><td>激素</td></tr><tr><td>苯佐卡因</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1 培养基</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 培养基</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 培养基</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 培养基</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1 培养基</td></tr><tr><td>商用海盐</td><td>Aqua Medic&amp;nbsp;</td><td>Meersalz</td><td>激活液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>激活液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Falcon 管</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管架</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&amp;reg; Classic</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l 微量移液器</td><td>Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l 微量移液器吸头</td><td>Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l 微量移液器吸头</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td><td>计数板</td><td></td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td><td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>UB 200i Serie 显微镜</td><td>PROiSER</td><td>显微镜</td><td></td></tr><tr><td>冷却板</td><td>PROiSER</td><td></td><td>原型</td></tr><tr><td>冷却块</td><td>PROiSER</td><td></td><td>原型</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>PROiSER</td><td>ISAS</td><td>软件</td></tr></tbody></table>

利用软件与冷却装置进行鱼类精子评估

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

在配子质量评估方面，已有一些创新、快速且定量的技术可为水产养殖提供有用的数据。已开发出用于精子分析的计算机化系统，可测量多个参数，其中最常测量的参数之一是精子活力。
最初，这种计算机技术是为哺乳动物物种设计的，但也可用于鱼类精子分析。鱼类具有一些可能影响精子评估的特定特征，例如激活后运动时间较短，以及在某些情况下对较低温度的适应性。因此，有必要对软件和硬件组件进行改进，以提高鱼类精子运动分析的效率。对于哺乳动物精子，通常使用加热板来维持精子细胞的最适温度。然而，对于某些鱼类物种，采用较低温度有助于延长精子运动持续时间，因为其精子活性通常不到2分钟。因此，在分析期间（包括在光学显微镜上）需要使用冷却装置，以使样品保持恒定的低温。本实验方案描述了利用精子分析软件和新型冷却装置对鱼类精子运动能力进行分析的方法，以优化分析结果。

分析时间效应对精子活力的影响
对于欧洲鳗鲡，在激活后15秒至120秒期间，静止精子的比例从24.4%上升至40.7%，而具有前向运动能力的活动精子比例则下降（从36.9%降至20.9%）（图1A 和 1B）。根据速度分析，精子细胞的运动速度随时间推移而降低（图1C 和 1D）。高速运动精子的比例下降约23%（从49.4%降至26.6%），中速运动精子的比例则上升约7%。
帧率和计数室的影响
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本实验方案描述了一种利用计算机辅助精子分析系统和冷却装置进行鱼类精子评估的方法。该软件可根据精子的运动能力，快速、准确且定量地分析鱼类精子质量，可作为水产养殖中提高繁殖成功率的有用工具。

用于配子质量评估，存在一些创新、快速且定量的技术，可为水产养殖提供有用数据。计算机化系统……

本实验的主要目的是通过分析精子的运动能力来评估鱼类精子质量，从而促进人工授精的成功。我是瓦伦西亚大学教授、PROiSER R+D 公司科学总监 Dr. Carles Soler。我是来自 Impress 项目的研究员 Carina Caldeira。CASA 技术是在几十年前为利用计算机辅助精液分析技术对哺乳动物物种进行精液分析而开发的。对于鱼类而言，需要注意两点。第一，这些动物通常在低温下受精，温度约为 4 °C，因此无法在室温下分析精液，而需要开发特定的工具来冷藏样品。另一个问题是，精子在激活后活力会迅速下降，因此需要分析这一现象，以确定分析精液质量的最佳时机。接下来，我们将展示鱼类精子的分析方法，该方案是在哺乳动物方案基础上改进而来的，其中包括利用计算机辅助系统进行的活力分析。那么，让我们开始吧。首先对鱼类进行麻醉，然后注射激素，24小时后采集精子样本。清洁生殖区域以避免污染。通过施加轻柔压力收集精子。精子样本保存在4°C，直至进行活力分析。预先准备好稀释液和激活剂。将冷却块设置在4摄氏度，以保持样品温度恒定。等待其温度稳定。使用针对每个物种特异的稀释液稀释精子样品。对于欧洲鳗鱼，精子用P1培养基以1:50的比例进行稀释。配制500微升稀释后的精子悬液，加入450微升P1培养基和50微升新鲜精子样品。充分混匀。取一份活化剂溶液，置于冷却块中。将冷却台温度设置为4°C。等待其稳定。选择运动性模块，如有必要，输入用户名和密码。选择属性。点击物种，选择鱼类。选择每秒帧数以及您希望使用的图像数量。必须使用负对比度。选择相应的计数室和刻度。针对每个物种，调整颗粒面积和连通性参数。对于欧洲鳗鱼，最小颗粒面积应为2，连通性应为7。保存配置。打开捕获界面。取4 µL激活剂溶液，放入样品室中。充分混匀稀释后的精子。取5 µL精子与激活剂混合，盖上盖玻片。调整样本焦距，找到最佳观察区域。选择“录制视频”以获取根据速度分离的精子运动轨迹。可采集更多视野。选择捕获区域并按之前步骤操作。点击退出以获得所有视野的总体图像。在激活后的特定时间间隔进行精子捕获。然而，每个时间间隔的重复样本均进行了精子分析。通过选择相应字段并点击“部分”按钮，可获取每个时间间隔的部分报告。Excel 表格提供了部分数据的平均值、图表以及精子运动轨迹的图像。对其他视野重复相同的步骤。另一种选择是总体数据。这些数据提供所有视野中各个精子的运动学参数值。通过部分报告，可以立即使用饼图对不同时间的精子活动率和前向运动率百分比进行比较。总体数据提供了利用动力学参数进行多种统计分析的选项。精子运动轨迹提供三个参数。VCL（曲线速度）、VSL（直线速度）、VAP（平均路径速度）。VCL 是最重要的参数，其数值随每秒帧数的变化而变化。增加每秒帧数，VCL 也随之增加，从而实现近乎完美的轨迹分析。最佳帧率可能因物种而异

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用软件和冷却装置进行鱼类精子评估

这是一种用于斑马鱼的高通量精子冷冻保存方案。采用该方案冷冻保存的精子在后续体外受精中平均具有25%的受精率，并可在多年内保持稳定。...

一种高通量的斑马鱼精子冷冻保存方法 体外 受精

本视频文章逐步介绍了如何处理精液样本，以在人类精子上获得高质量的荧光原位杂交结果。所获得的样本可用于临床诊断背景下的非整倍体筛查。...

荧光 原位 人类精子中的荧光原位杂交（FISH）实验方案

卵子及其周围的胞外包被常会释放多肽、蛋白质和小分子，这些物质可与精子进行通讯，引导精子趋向卵子，从而促进受精。本文利用蛙类精子，描述并比较了两类用于检测精子趋化性吸引的实验方法——精子聚集实验和精子追踪实验。...

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通过流式细胞术对小鼠精子细胞进行分步分选

本研究的主要目的是调整针浸式玻璃化冷冻（NIV）程序，用于整块斑马鱼睾丸的冷冻保存。此外，还测试了该方法在五种不同斑马鱼品系中的可重复性。...

斑马鱼精原细胞的全睾丸针浸式超快速冷冻保存

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利用密度梯度离心法收集不同质量的精子

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硬骨鱼类模型日本青鳉（Oryzias latipes）的精子采集与计算机辅助精子分析

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U型水平泳动法用于制备低DNA碎片化指数的高质量精子

学习使用计算机辅助精子分析（CASA）和冷却装置评估鱼类精子质量，通过控制低温环境实现快速准确的精子活力检测。该方法有助于提高水产养殖人工授精的成功率和繁殖效率。

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