一种新的体外创面愈合试验评价细胞迁移
March 17th, 2018
在这里, 我们提出一个评估肽对支气管上皮细胞迁移的影响的协议。这种方法允许快速和高度重复获取的数量数据的速度的细胞迁移和伤口闭合。
该程序的目标是展示如何评估某些免疫调节分子（如抗微肽）刺激细胞迁移的能力，这是伤口愈合过程中的限速事件。一般来说，体外研究细胞迁移的基本程序包括细胞单层的创建、伪缠绕的产生、以不同的时间间隔捕获图像直到达到伤口闭合，以及分析图像序列以量化细胞迁移。现在，这种方法相对于基于手动划痕的经典分析的优势在于，由于使用特殊的硅胶培养插入物来创建伪缠绕区域，该区域完全没有细胞，并且具有非常明确的宽度，为 500 微米。
此外，得益于基于 Web 的自动图像分析程序，可以在几分钟内快速接收有关伤口闭合和细胞迁移速度的定量数据。因此，总的来说，这是一种可靠的实验技术，可以应用于任何类型的贴壁细胞，具有非常高的数据可重复性。在这里，作为一个例子，它提供了青蛙皮肤抗微肽对支气管上皮细胞迁移的影响，以及用特异性抑制剂对这些细胞进行预处理如何提供有关此类事件背后的分子机制的信息。
更准确地说，将展示肽诱导的细胞迁移如何涉及表皮生长因子受体的激活。开始实验时，从细胞培养箱中取出含有细胞的培养瓶，并在配备自动图像采集系统的倒置显微镜上检查圆周。如果达到 90% 的完全汇合，移至生物安全罩，在无菌条件下使用 10 毫升塑料移液管小心吸出培养基，然后将培养基轻轻丢弃到废液瓶中。
用不含钙和镁的 6 毫升 PBS（即 CMF）洗涤细胞。手动轻轻摇动培养瓶并丢弃 CMF。然后，添加其他 10 ml CMF 以进一步去除细胞碎片和未附着的细胞。
此时，关闭培养瓶，并将其放回细胞培养箱中 10 分钟。取出培养瓶，弃去 CMF，轻轻加入 2 毫升胰蛋白酶-EDTA，使细胞从塑料表面分离。手动轻轻摇动培养瓶，让溶液完全覆盖细胞，然后将培养瓶再孵育 10 分钟。
然后，从培养箱中取出培养瓶，检查胰蛋白酶添加过程是否完成。如果是这种情况，细胞将处于悬浮状态，并在显微镜下呈圆形。要灭活胰蛋白酶，请添加 10 毫升培养基，并补充有 10% 热灭活牛血清，然后小心清洗培养瓶。
收集细胞悬液，将此体积转移到 50 毫升锥形管中，然后离心样品。离心后，检查沉淀形成，吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于补充有血清的 6 mL 培养基中。上下移液细胞悬液数次，以打碎任何团块形成。
此过程可能需要几分钟时间。然后，用微量移液器吸头取出 10 微升，在 Burker 或 Neubauer 腔室的盖玻片下注入体积并计数细胞数。在 12 孔板的每个孔中，在无菌镊子的帮助下放入培养插入物。
每个插件都由两个隔间组成，由 500 微米的壁隔开，底部有粘性以允许粘附。但是，通过镊子，沿插入边缘施加一些压力以将它们固定在板的表面。用 70 微升细胞悬液填充插入物的每个隔室，每个腔室含有约 3.5 x 10 至 4 个细胞。
重要的是，应用于每个隔室的细胞浓度取决于细胞的类型。建议使用在 24 小时内完全汇合的细胞密度。在显微镜下以四倍放大倍数检查细胞是否未从插入室中泄漏，然后将板孵育 24 小时。
孵育后，用无菌镊子轻轻去除插入片段，不要破坏细胞单层，然后将插入片段转移到吸收纸上。通过每孔添加 1 mL 培养基来洗涤细胞。注意不要将培养基直接添加到细胞单层的顶部，以避免其中断。
盖上板，然后手动轻轻摇动。吸出培养基，并用每孔 1 毫升新鲜培养基替换。在显微镜下观察无细胞间隙，并在零时间采集图像。
从孔中取出培养基，并加入补充有钙和镁的 PBS。摇动板，去除 PBS，最后将测试化合物添加到孔中。对于未处理的对照样品，使用 1 毫米培养基。
孵育板。对于每个样品，在显微镜下以四倍放大观察细胞迁移，并在孵育 15、20 和 24 小时后获取图像。在此步骤中，尝试在与时间零相同的区域中捕获图像。
捕获图像的时间间隔的选择取决于所选单元格的迁移速度。实验完成后，以不同的时间间隔为每个样本选择图像，并创建一个 zip 文件。在每个时间间隔内，每个样品至少要有 3 个重复，这一点很重要。
打开自动 Image Analysis Wimasis 程序，并使用最低放大倍率上传 zip 文件。该程序将通过电子邮件自动提供一个摘要文件，其中包含细胞覆盖区域和划痕区域的实验数据，作为每个样品的百分比，例如，样品 1a 和 2a，在选定的时间点。计算时间零处所有样本的平均值。
根据时间零处的平均值对所有数据进行标准化。计算每个时间点所有样本的平均值和相对标准误差。通过使用 two-way 方差分析检验，执行统计分析。
获得的数据可以绘制成直方图，显示不同样品组在不同时间点的细胞覆盖面积百分比。这些直方图显示了与对照相比，用不同浓度的抗微肽 esculentin 1-21-1c 或 esculentin 1-21 处理支气管细胞 15、20 和 24 小时后获得的伤口闭合。正如直方图和一些代表性的显微照片所指出的，在大约 20 小时内，在一微摩尔下诱导的伤口区域几乎完全闭合的支气管细胞中假性伤口的再上皮化方面更有效，而 esculentin 1-21 需要更高的浓度，即 10 微摩尔。
为了研究某些受体（例如表皮生长因子受体）对细胞迁移的作用，用特异性抑制剂（例如化合物 AG1478）预处理细胞单层。为此，在取出插入物之前，吸出每个隔室中的培养基，洗涤一次，然后加入 70 微升补充有 5 微摩尔 AG1478 的培养基。将板孵育 30 分钟。
然后，用镊子取出插入物，并如前所述进行作。这些是表明肽诱导的细胞迁移涉及表皮生长因子受体激活的最终数据。事实上，在用抑制剂 AG1478 预处理后，与在添加肽之前未用 AG1478 预孵育细胞时发现的结果相比，细胞覆盖面积的百分比在所有时间间隔内都显着降低。
总之，所描述的方法具有很大的潜力，可以在短时间内以高精度显着提高对不同类型细胞迁移特征的理解，以及选择最有前途的伤口愈合促进剂和/或抑制剂。
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概述
该协议评估免疫调节肽对支气管上皮细胞迁移的影响，这是伤口愈合过程中的关键过程。该方法提供了关于细胞迁移和伤口愈合的快速和可重复的定量数据。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞迁移
- 伤口愈合
- 免疫调节分子
背景
- 细胞迁移对伤口愈合至关重要。
- 免疫调节肽可以影响细胞行为。
- 传统的划痕测定法在可重复性方面有局限性。
- 自动图像分析提高了数据收集效率。
研究目的
- 评估特定肽对支气管上皮细胞迁移的影响。
- 利用新颖的方法创建伪伤口场。
- 分析细胞迁移所涉及的分子机制。
使用的方法
- 使用硅胶培养插入物创建细胞单层和伪伤口。
- 在伤口愈合之前，在不同时间间隔进行图像捕捉。
- 使用基于网络的程序定量分析细胞迁移。
- 评估特定抑制剂对细胞迁移的影响。
主要结果
- 证明了青蛙皮肤抗菌肽对细胞迁移的影响。
- 提供了伤口愈合速度的定量数据。
- 显示了实验技术的高可重复性。
- 揭示了细胞迁移分子机制的见解。
结论
- 该方法可靠，适用于各种粘附细胞。
- 自动分析显著提高了数据收集速度。
- 这种方法可以增进对伤口愈合过程的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables quantitative evaluation of cell migration, a rate-limiting event in tissue repair, supporting target validation for wound-healing therapeutics. The use of defined pseudo-wound fields and automated image analysis improves reproducibility and data throughput, reducing variability in early discovery screening. It provides mechanistic insights into immunomodulatory molecule activity, aiding lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring peptide-induced migration in bronchial epithelial cells.
- Operational Value: Enables functional validation of immunomodulatory targets through reproducible wound closure metrics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying compound effects on cell migration kinetics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, cell-free pseudo-wound fields with 500 μm width for consistent compound testing.
- Operational Value: Integrates with automated image analysis to rapidly generate quantitative wound closure data.
- Scalability: Compatible with adherent cell types and multi-well formats for assay reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by defining molecular mechanisms via inhibitor pretreatment (e.g., AG1478).
- Mechanistic De-risking: Reveals EGFR activation as a key pathway in peptide-induced migration, reducing ambiguity in target engagement.
- Predictive Confidence: Enables dose-response assessment (e.g., 1 μM vs 10 μM peptide efficacy) to inform lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing quantitative migration data that informs go/no-go decisions before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immunomodulatory molecules on cell migration pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible systems with defined wound geometry for compound evaluation.
- Analytics: Generates normalized, time-resolved wound closure percentages enabling statistical comparison via two-way ANOVA.
- Translational Research: Connects phenotypic screening to mechanistic insights through targeted inhibition studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform applicable across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking peptide activity to EGFR-dependent migration.
- Operational Value: Ensures high reproducibility through standardized inserts and automated analysis, reducing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid, quantitative assessment of wound-healing promoters.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of leads based on migration efficacy and mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, sterile technique, and microscopy-based confluence assessment.
- Depends on silicone culture inserts with defined geometry and automated image analysis software (e.g., Wimasis).
- Necessitates cross-team standardization for image capture timing, normalization, and statistical analysis protocols.
- Adaptation considerations include cell density optimization for confluence within 24 hours across different adherent cell types.
- Practical limitations include dependency on inhibitor availability for mechanistic studies and image quality for accurate automated analysis.
